مقالة منهجية

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

DOI:

10.3791/52607

مارس 24, 2015

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير المستقر داخل الحيوية عالي الدقة للخلايا المناعية في الكبد أمرا صعبا. نقدم هنا طريقة حساسة للغاية وموثوقة لدراسة الهجرة وتفاعلات الخلايا الخلوية للخلايا المناعية في كبد الفأر على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) عن طريق الفحص المجهري بالليزر متعدد الفوتون داخل الحيوية مع مراقبة العناية المركزة.

الملخص

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد. والأنف والحنجرة "> طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات.

للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4).

CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) - القاتلة الطبيعية (NK) - ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي 1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp + الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.

المقدمة

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم 2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد 3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد.

بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء 6. وبالمقارنة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: وأجريت التجارب وفقا للتشريعات التي تحكم الألماني الدراسات على الحيوانات في أعقاب "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات NIH، الطبعة 8، 2011) والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض العلمية (الجريدة الرسمية للاتحاد الأوروبي، 2010). تم منح إذن رسمي من الحكومة رعاية الحيوان واستخدام المكتبي (LANUV نوردراين فيستفالن، ركلينغاوسين، ألمانيا).

ملاحظة: الخطوات التي يمكن حذفها للتصوير على المدى القصير (على سبيل المثال المفاجئة الطلقات، مداخن 3-D أو أيضا مدة قصيرة الوقت الفاصل بين المجهري) يتم وضع علامة مع النج....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقق من صحة نهج TPLSM حيوي داخلي لدينا، وتعرض CXCR6 GFP / + الفئران لتصوير TPLSM حيوي داخلي. تم الفئران يقم إما غير المعالجة والضوابط الأساسية أو تعرض لحقن داخل الصفاق واحد من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على تلف الكبد الحاد 20.

اتخذت تسلسل الفيديو عبر فترة زمنية من 2-5 ساعة، وكانت تتبع الخلايا مع مرور الوقت بسبب مضان الخضراء. لإظهار الحركة الخلوية العامة، تم رسم.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والتوازن والمرض. ومع ذلك، فإن موقف التشريحي تحديا إلى حد ما في الكبد، وذلك بسبب والتي التنفسي وحركة الأمعاء تحوي تنتقل مباشرة إلى الكبد، فضلا عن هشاشة العالية مقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى تفرض العديد من التحديات للتصوير.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يكشف المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون منشأة المركزية التابعة لمستشفى آخن الجامعي على الدعم الفني. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG Ta434 / 2-1 ، DFG SFB / TRR 57) والمركز متعدد التخصصات للأبحاث السريرية (IZKF) آخن. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل المرفق الأساسي "التصوير ثنائي الفوتون" ، وهو مرفق أساسي للمركز متعدد التخصصات للأبحاث السريرية (IZKF) آخن داخل كلية الطب في جامعة RWTH آخن.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التخدير
بوبرينورفينإسيكس فارما997.00.00Analgeticum ، 0.1 مجم / كجم
FentanylRotex MedicaCharge: 30819
نظام التخدير FluovacHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5٪Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor)Eickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9٪) محلول كلوريد الصوديومDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10٪cevaالرسوم: 36217/09
Xylazin 2٪medistarالرسوم: 04-03-9338 / 23
مستلزمات
20 مل حقنةBD Plastipak
250 مل قارورة ErlenmeyerSchott Duran21 226 36
25 مل دورق 2xSchott Duran50-1150
2 مل حقنةBD Plastipak
4-0 خياطة فيكريلEthiconV7980
Agaroseمتوفرة
Bepanthen Eye و مرهم الأنفBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High Temp CuuteryKit Fine Science Tools Inc.18010-00
مسحات الشاش القطنيةFuhrmann GmbH32014
غطاء زلة 24x50 ممROTH1871
شريط حرير Durapore3M1538-1
ريشة مشرط يمكن التخلص منهريشة02.001.30.011
أنابيب البوليثين ذات التجويف الناعم 0.58 مم معرفسميث الطبية800/100/200
هيستواكريلبراون10500525x 0.5 مل
LeukoplastBSN Medical Inc.
شرائح المجهرROTH1879
بولي كحول هوت & هيلب. farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
إبرة Sterican 18 جم × 1B. إبرة Braun304622
Sterican 27 3/4 G x 1B. براون4657705
المناديل الورقيةالمتوفرة
تجاريا الأدوات
حرق الملغم 3PLGatz0110؟
مباعدات بلير (4 محاور (حادة)) × 2Storz & كلاينS-01134
دومون رقم 7 ملقطأدوات العلوم الدقيقة Inc.91197-00
ملقط Graefe منحني x1شركة أدوات العلوم الدقيقة11151-10
ملقط Graefe مستقيم x2Fine Science Tools Inc.11050-10
ملعقة هايدمان HD2Stoma2030.00
حامل إبرة MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
أدوات العلوم الدقيقة المقصية14074-11
ملقط Semkenأدوات العلوم الدقيقة Inc.11008-13
مقص جراحي صغير منحنيشركة أدوات العلوم الدقيقة14029-10
مقص جراحي صغير مستقيمشركة أدوات العلوم الدقيقة14028-10
ملقط نمط قياسيFine Science Tools Inc.11000-12
مقص زنبركي فاناسأدوات العلوم الدقيقة Inc.15000-08
معدات
وحدة الزناد ECG3000003686الطب الحيوي السريع
MICROCAPSTAR محلل ثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزرAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
مجهر متعدد الفوتون Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 قنوات مسجلAD InstrumentsPL3508
وسادة تسخين يتم التحكم في درجة حرارتهاSygonix26857617
مستشعر درجة الحرارةمتاح
نظام التحكم في درجة الحرارة للمجاهر - Cube& تصوير بوكس لايف
استهلاكيةتجارياالجراحية شركة بشكل عاجل خدمات

المراجع

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluores....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Intravital MicroscopyMultiphoton MicroscopyLiver ImagingCXCR6 Gfp MiceLeukocyte MigrationCell Cell InteractionsLong Term ImagingTissue StabilizationVital Parameter MonitoringLaser Scanning Microscopy

مقالات ذات صلة