مقالة منهجية

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

DOI:

10.3791/52607

⸱

مارس 24, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير المستقر داخل الحيوية عالي الدقة للخلايا المناعية في الكبد أمرا صعبا. نقدم هنا طريقة حساسة للغاية وموثوقة لدراسة الهجرة وتفاعلات الخلايا الخلوية للخلايا المناعية في كبد الفأر على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) عن طريق الفحص المجهري بالليزر متعدد الفوتون داخل الحيوية مع مراقبة العناية المركزة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد. والأنف والحنجرة "> طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات.

للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4).

CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) - القاتلة الطبيعية (NK) - ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي 1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp + الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم 2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد 3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد.

بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي 5، والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء 6. وبالمقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى، وجراحة الكبد هي تحديا من نوع خاص. نظرا لهيكل الاوعية الدموية الدقيقة كثيفة، يمكن التلاعب الجراحية تؤدي إلى آفات النزفية واسعة النطاق، وضعف دوران الأوعية الدقيقة 7، وكذلك تفعيل المقيمين طخلايا مناعية مثل خلايا كوبفر 8. ولذلك، التثبيت الميكانيكي للأنسجة كما نشرت في أماكن أخرى 6،9 من المحتمل أن تتداخل مع التصوير intravital المجهري.

في كبد صحي، 10-15٪ من حجم الدم الكلي يكمن داخل الأوعية الدموية والكبد، والجهاز يستقبل حوالي 25٪ من النتاج القلبي العام 10، مما يجعل الجهاز عرضة للتغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، وتقلبات ضغط الدم ). ولذلك، فإن اضطرابات في تدفق الدم الكبدي بسبب مثل إجهاد القص، والتشرد، والإصابة التي كتبها معالجة الأنسجة المفرط أو تداول مركزية تؤدي إلى تغيرات مصطنعة في الكريات البيض سلوك الهجرة، الأوكسجين الكبد وضعف، وبالتالي المزيد من تلف الكبد، مما يؤثر على الكبد الاستجابات المناعية وكذلك كما الحفاظ على الجهاز والوقت حياة الشامل للحيوان.

واستندت الدراسات المجهرية في وقت مبكر على ميل epifluorescence حيوي داخليcroscopy، ولكن العديد من المعوقات الفنية مثل تبيض الصورة وعمق الاختراق المنخفض تحد من استخدام هذه التقنية لتصوير الكبد على المدى الطويل 4،11،12. مع تطور المجهر multiphoton في 1990s، تم حل القيود المفروضة على الصورة تبيض أو عمق الاختراق بشكل رئيسي، كما كان هذا الأسلوب الجديد قادر من الناحية الفنية لإجراء دراسات التصوير في تقريبا جميع الأجهزة تحت مواقف الحياة الحقيقية 13-15. ومع ذلك، كانت التحديات الرئيسية المتبقية فيما يتعلق التصوير الكبد: حركات التنفس، وتألق ذاتي من أنسجة الكبد، وتأمين تدفق الدم دون تغيير في الجيوب الكبدية، والتصوير مستقر وخاصة لفترات أطول من عدة ساعة 16.

على الرغم من أن العديد من الدراسات تناولت وظيفة والهجرة من مختلف الكريات البيض في الكبد 17، على سبيل المثال، NKT خلايا 18-20، وخلايا T 21،22، 23،24 الضامة الكبد أو العدلات 25، المدى الطويل multiphoton ملم يتم بعد إنشاء التصوير icroscopy بنجاح، وهي مهمة أكثر صعوبة في الحيوانات مع مرض الكبد الحاد أو المزمن بسبب الأضرار الموجودة وبالتالي ارتفاع قابلية لمزيد من الضرر 26. ومع ذلك، ومراقبة سلوك الهجرة وظيفة الخلوية من الكريات البيض في الكبد في الوقت الحقيقي يتيح رؤى جديدة في دورها معين في التوازن الكبد ومرض 27.

يتم التعبير عن CXCR6 مستقبلات chemokine على عدة مجموعات فرعية لمفاوية، بما في ذلك القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا NKT وبعض السكان الخلية T 18،28. وقد أشارت الدراسات السابقة في الفئران التي CXCR6 وCXCL16 يجند لها وما شابه ذلك قد السيطرة على الدوريات الخلايا NKT على الجيوب الكبد خلال التوازن. ونتيجة لذلك، وقد وصفت استخدام الفئران CXCR6.gfp (يحمل في المغلوب من البروتين الفلوري الأخضر [GFP] في موضع CXCR6) للتحقيق في الهجرة من الخلايا الليمفاوية في مختلف أجهزة مثل الدماغ 29وكذلك الكبد 18،20، والتي تبين زيادة تسلل خلايا CXCR6.gfp على الالتهاب.

مع أسلوب المقدمة في هذه الدراسة كان من الممكن أن تتبع هذه العمليات على مدى فترة طويلة من الزمن في ظل ظروف مستقرة. يسمح الإجراء multiphoton حيوي داخلي يستند التصوير التي كان استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من اضطراب الحيوان والجهاز. الأمثل لبقاء الحيوان على المدى الطويل من خلال رصد واسعة تليها مراقبة وثيقة من التنفس والدورة الدموية. ومرنة للغاية وسهلة تعتمد أيضا على أجهزة متني أخرى مثل الكلى أو الطحال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: وأجريت التجارب وفقا للتشريعات التي تحكم الألماني الدراسات على الحيوانات في أعقاب "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات NIH، الطبعة 8، 2011) والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض العلمية (الجريدة الرسمية للاتحاد الأوروبي، 2010). تم منح إذن رسمي من الحكومة رعاية الحيوان واستخدام المكتبي (LANUV نوردراين فيستفالن، ركلينغاوسين، ألمانيا).

ملاحظة: الخطوات التي يمكن حذفها للتصوير على المدى القصير (على سبيل المثال المفاجئة الطلقات، مداخن 3-D أو أيضا مدة قصيرة الوقت الفاصل بين المجهري) يتم وضع علامة مع النجمة (*) للحد من الوقت اللازم لإعداد وتبسيط البروتوكول الجراحي. ويمكن أيضا أن يؤديها التصوير دون رقابة رصد وتداول واسعة النطاق إذا لزم الأمر، ومع ذلك، سيتم تخفيض الوقت البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ.

1. إعداد المجهر وجراحة قبل إعداد (5-10 ميلن)

  1. نظام التبديل على (المجهر، مختبر السلطة، ليزر، وسادة التدفئة، وغرفة المناخ، وكاميرا ويب، جهاز ضخ حقنة، التنفس).
  2. ربط O 2 العرض لالأيزوفلورين بخار وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 1.5٪ المجلد (ت / ت)، وربط لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة.
    1. للتصوير على المدى القصير، والحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلورين إلا بعد الأولي للتحريض التخدير IP (راجع الخطوة 2.2). ثم استخدام 2 المجلد٪ (ت / ت) الأيزوفلورين، والحفاظ على وقت التصوير أقل من 2 ساعة لضمان استقرار دوران الأوعية الدقيقة في الكبد.
  3. ضبط التنفس إلى 120-140 دورات التنفس / دقيقة مع حجم 150-200 ميكرولتر.
  4. إعداد مرحلة الماوس الاغاروز. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز، وسكب عليه في طبق (حوالي 10 سم × 15 سم القاعدة) في زاوية من 40 درجة.
  5. اقامة منطقة العمل الجراحي جمع الأجهزة المطلوبة. لمنع العدوى الميكروبية، وتطهير الأدوات باستخدام محلول 1٪ من Sekusept فورت S (9.9٪ ث / ت)، غلوتارال 9.8٪ ث / ت، الفورمالديهايد لمدة 5 دقائق قبل التجربة (الشكل 1A).
  6. الحصول على المكونات المتبقية: مطهر الجلد (على سبيل المثال، 10٪ محلول البوفيدون اليود)، ومرحلة الكبد (مداخن والجسر)، والحل الاغاروز (3٪ (ث / ت) في PBS)، ضخ حقنة مع 5٪ (ث / ت) حل الجلوكوز (G-5)، ضخ حقنة مع الحل مخدر I (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل)، ومسحات القطن، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat، وبرنامج تلفزيوني 1X. وضع طبق مرحلة الاغاروز إلى غرفة الحضانة لالتسخين.

2. القصبة الهوائية (10-15 دقيقة)

  1. استخدام C57BL / 6 الفئران من المنزل في تربية وزنها 25-28 ز. بيت الفئران في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة وفقا للمبادئ التوجيهية FELASA، في و للحرارة البيئة التي تسيطر عليها الرطوبة مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام. تسمح الحيوانات حرية الوصول إلى النظام الغذائي العادي الفئران (الشمة ستاندرد القوارض الدايت) والمياه الإعلانية libitum.
  2. تخدير الماوس عن طريق الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم داخل الصفاق (IP) حقن 250 ميكرولتر من محلول مخدر II (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 1 ملغ / مل، البوبرينورفين 10 ميكروغرام / مل).
    1. * للصيانة خلال التصوير حيوي داخلي وإدارة باستمرار حل مخدر I عن طريق الحقن الملكية الفكرية المستمر (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل) باستخدام جهاز ضخ حقنة مع معدل تدفق 0.2 مل / ساعة في بالاشتراك مع inhalative الأيزوفلورين 0.5 المجلد٪ (ت / ت).
    2. تحقق من ردود الفعل بعد 5 دقائق (مثل قرصة وسادة القدم مع ملقط)، وتطهير الجلد لالقصبة الهوائية، وبدء التحضير إذا الفأر هو في حالة التخدير الجراحي متسامحة.
    3. تطبيق كريم العين واقية (على سبيل المثال، ديكسبانتينول 50 ملغ / غ) لمنع القرنية من الجفاف (الشكل 1B).
  3. يحملق الماوس على إعداد جدول فضح الجانب البطني باستخدام شريط لاصق لالأطراف. تنهك بلطف الرقبة، يحملق في هذا الموقف، على سبيل المثال، باستخدام الشريط المطاطي مدمن مخدرات رس القواطع.
    1. تطهير الجلد والفرو باستخدام محلول اليود البوفيدون، من خلال تطبيق مطهر مع مسحة القطن.
  4. أداء قطع الجلد الأولي (0.5-1 سم طول) أدناه الذقن مباشرة (الشكل 1C)
    1. تشريح بعناية النسيج الضام بين الغدد اللعابية (الشكل 1D).
    2. المسيل للدموع بعناية مفتوحة العضلات المحيطة أنبوب القصبة الهوائية (الشكل 1E، F).
  5. وضع موضوع الجراحي تحت القصبة الهوائية لاحق أنبوب التهوية تثبيت (الشكل 1G).
    1. فتح القصبة الهوائية مع مقص الصغرى بين حلقات الغضروف إجراء شق على شكل حرف T (الشكل 1H)
  6. وضع أنبوب التهوية إلى القصبة الهوائية من خلال شق (~ 0.5 سم). لدفع أنبوب إلى الأمام، والاستيلاء على نهاية الذيلية مع ملقط التشريحية الصغيرة ودفع بلطف أنبوب في القصبة الهوائية (الشكل 1I)
  7. يحملق أنبوب مع موضوع الجراحية (على سبيل المثال ، 5-0) مع موضوع وضعت في الخطوة 2.5 ربط عقدة حول أنبوب داخل القصبة الهوائية. أداء تثبيت الجمجمة الثاني من الأنبوب في الجلد لتجنب الاعادة العرضي (الشكل 1J، K).
  8. ختم قطع مع الغراء الأنسجة (على سبيل المثال، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat) (الشكل 1L).
  9. يحملق أنبوب على رأس باستخدام شريط لاصق.

3. Laparatomy (15-20 دقيقة)

  1. ضع الماوس على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. حلق البطن، إزالة بعناية الشعر من الجلد. تطهير الجلد والفرو حلق باستخدام محلول البوفيدون اليود.
  2. إجراء خفض أدناه القص باستخدام مقص جراحي (الشكل 2A) الجلد صغير. تمديد خفض أفقيا تحت الأضلاع لكلا الجانبين، كية جميع الأوعية الدموية واضحة لمنع النزيف.
  3. أداء بعناية قطع صغيرة في ألبا الخط تحت القص، وفتح الغشاء البريتوني (الشكل 2B). تمديد خفض لكلا الجانبين باستخدام cauterizأوجه لمنع النزيف (الشكل 2C، D).
  4. ضع الماوس إلى الاغاروز طبق المرحلة (الشكل 2E). وضع أكوام من الارتفاع المناسب على كلا الجانبين من الماوس (عادة 12-14 زلات الغطاء) (الشكل 2F).
  5. ضع الجهاز التنفسي استشعار الزناد تحت أعلى الظهر لمزامنة المجهر مع التنفس. تفعيل وحدة الزناد (الشكل 2G).
  6. وضع موضوع الجراحي (5-0) من خلال القص لسحب الأضلاع (الشكل 2I).
  7. قطع بعناية الرباط الذي يربط الكبد والحجاب الحاجز (المنجلي الرباط)، وكذلك الكبد والجهاز الهضمي المسالك باستخدام مقص جراحي منحنية. قطع في الرباط المنجلي وصولا الى الشريان الأبهر (الشكل 2J).

4. إعداد نموذج (10-15 دقيقة)

  1. ضع الماوس على الجانب الأيمن مع بزاوية 45 درجة لسهولة الوصول إلى الفص الكبد واسع.
  2. إضافة جسر تنظيم تحت الأضلاع، الذي يغطي البطنتجويف. تصنيع جسر باستخدام غطاء زلة القياسية مع شريط لاصق الطلاء لتغطية حواف حادة (الشكل 2K).
  3. وضع الفص الكبد كبير على خشبة المسرح. زلة بعناية كروي مزدوج قلم التحقيق أو ملعقة مبطن أسفل الكبد مع الاستمرار على رأس الجهاز باستخدام قطعة من القطن مبللة أو الأنسجة الرطبة. رفع الفص على الشريحة وتطبيق السحب لطيف. الفص يمكن أن تكون عازمة أو مطوية. توفير المزيد من الحيطة لطيف فقط التلاعب في الكبد (الشكل 2L).
  4. ضع دعم الوحشي المخاطر، على سبيل المثال، أكوام من زلات صغيرة غطاء (20 ملم × 20 ملم)، ما يقرب من نفس الارتفاع من الفص الكبد بجانبه لدعم تغطية زلة.
  5. ضع زلة غطاء كبير (24 ملم × 50 ملم) على الفص الكبد. تأكد من أن غطاء زلة موجه كما الأفقي ممكن (الشكل 2M).
    ملاحظة: يجب أن يكون زلة تغطية على اتصال مع الأنسجة دون الضغط عليه. التحقق من وجود علامات واضحة على ضعف تدفق الدم (الأنسجة البيضاء). إذا microcircتعطل ulation، إضافة مزيد من دعم حصص.
  6. * مكان اثنين من القسطرة داخل الصفاق المستقلة (الشكل 2N) للتخدير المدى الطويل وG-5 التطبيق. تثبيت القسطرة أفقيا في الجزء الأسفل من البطن بالقرب من أطرافه الخلفية.
    ملاحظة: يمكن للالقسطرة داخل الصفاق يكون من خلال ربط الإبر 27 G مع مرونة أنابيب السيليكون (الشكل 3) من صنع الذات.
  7. * يحملق إبرة مع حلقة من 5-0 موضوع الجراحي للجلد لتجنب النزوح عرضي.
  8. * إرفاق ضخ حقنة مع حل التخدير I لقثطار 1، تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل / ساعة. إرفاق ضخ حقنة مع G-5 لقسطرة 2، تعيين معدل التدفق إلى 0.1 مل / ساعة.

5. رصد ماوس

  1. * أقطاب مكان ECG إلى الأمام والأطراف الخلفية (الشكل 4A).
  2. * إرفاق أنابيب انتهاء إلى CO 2 استشعار مستوى.
  3. إضافة جهاز استشعار درجة الحرارة الخارجي المتصل سادة الحرارة (الشكل 4C).

6. تضمين وتثبيت الأنسجة (5-10 دقيقة)

  1. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X. تضمين الكبد عندما تكون درجة الحرارة في 41 ° C باستخدام حقنة 5 مل و 18 G إبرة (الشكل 5A).
  2. صب المتبقية الاغاروز على ساترة وحول الماوس (الشكل 5B، C). انتظر حتى يتم مهيلم الاغاروز بالكامل.
  3. إزالة الاغاروز الزائد باستخدام ملعقة هايدمان، وإعداد viewfield كبيرة بما يكفي لمسح الفص الكبد إعداد (الشكل 5D، E).

7. التصوير

  1. نقل الماوس إلى غرفة المناخ المجهر.
  2. إضافة 50-100 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن على 37 ° C).
  3. تغطية صحن عينة لمنع التبخر (الشكل 5F).
  4. * تصغير الأيزوفلورين inhalative إلى 0.5٪ المجلد (ت / ت).
  5. * ابدأ برنامج مراقبة وتسجيل تخطيط القلب، معدل ضربات القلب وCO 2 الزفير.
  6. بدء تصوير: فتح لامصاريع سر، وتحديد جهة نظر المجالات ذات الاهتمام، وتحديد الحدود العليا والدنيا للZ-مداخن، وبدء تسجيل مرور الوقت. تعدل Z-مداخن إذا لزم الأمر لتصحيح Z-الانجراف (على سبيل المثال. نظرا للتغيرات في ضغط الدم أو درجة حرارة تذبذب، الشكل (5G).
    ملاحظة: بعد الانتهاء من فترة التصوير أو إذا كان التداول أو تخدير الحيوانات يصبح غير مستقر، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم (بدون الصحوة من التخدير).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقق من صحة نهج TPLSM حيوي داخلي لدينا، وتعرض CXCR6 GFP / + الفئران لتصوير TPLSM حيوي داخلي. تم الفئران يقم إما غير المعالجة والضوابط الأساسية أو تعرض لحقن داخل الصفاق واحد من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على تلف الكبد الحاد 20.

اتخذت تسلسل الفيديو عبر فترة زمنية من 2-5 ساعة، وكانت تتبع الخلايا مع مرور الوقت بسبب مضان الخضراء. لإظهار الحركة الخلوية العامة، تم رسم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والتوازن والمرض. ومع ذلك، فإن موقف التشريحي تحديا إلى حد ما في الكبد، وذلك بسبب والتي التنفسي وحركة الأمعاء تحوي تنتقل مباشرة إلى الكبد، فضلا عن هشاشة العالية مقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى تفرض العديد من التحديات للتصوير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يكشف المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون منشأة المركزية التابعة لمستشفى آخن الجامعي على الدعم الفني. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG Ta434 / 2-1 ، DFG SFB / TRR 57) والمركز متعدد التخصصات للأبحاث السريرية (IZKF) آخن. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل المرفق الأساسي "التصوير ثنائي الفوتون" ، وهو مرفق أساسي للمركز متعدد التخصصات للأبحاث السريرية (IZKF) آخن داخل كلية الطب في جامعة RWTH آخن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التخدير
بوبرينورفينإسيكس فارما997.00.00Analgeticum ، 0.1 مجم / كجم
FentanylRotex MedicaCharge: 30819
نظام التخدير FluovacHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5٪Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor)Eickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9٪) محلول كلوريد الصوديومDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10٪cevaالرسوم: 36217/09
Xylazin 2٪medistarالرسوم: 04-03-9338 / 23
مستلزمات
20 مل حقنةBD Plastipak
250 مل قارورة ErlenmeyerSchott Duran21 226 36
25 مل دورق 2xSchott Duran50-1150
2 مل حقنةBD Plastipak
4-0 خياطة فيكريلEthiconV7980
Agaroseمتوفرة
Bepanthen Eye و مرهم الأنفBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High Temp CuuteryKit Fine Science Tools Inc.18010-00
مسحات الشاش القطنيةFuhrmann GmbH32014
غطاء زلة 24x50 ممROTH1871
شريط حرير Durapore3M1538-1
ريشة مشرط يمكن التخلص منهريشة02.001.30.011
أنابيب البوليثين ذات التجويف الناعم 0.58 مم معرفسميث الطبية800/100/200
هيستواكريلبراون10500525x 0.5 مل
LeukoplastBSN Medical Inc.
شرائح المجهرROTH1879
بولي كحول هوت & هيلب. farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
إبرة Sterican 18 جم × 1B. إبرة Braun304622
Sterican 27 3/4 G x 1B. براون4657705
المناديل الورقيةالمتوفرة
تجاريا الأدوات
حرق الملغم 3PLGatz0110؟
مباعدات بلير (4 محاور (حادة)) × 2Storz & كلاينS-01134
دومون رقم 7 ملقطأدوات العلوم الدقيقة Inc.91197-00
ملقط Graefe منحني x1شركة أدوات العلوم الدقيقة11151-10
ملقط Graefe مستقيم x2Fine Science Tools Inc.11050-10
ملعقة هايدمان HD2Stoma2030.00
حامل إبرة MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
أدوات العلوم الدقيقة المقصية14074-11
ملقط Semkenأدوات العلوم الدقيقة Inc.11008-13
مقص جراحي صغير منحنيشركة أدوات العلوم الدقيقة14029-10
مقص جراحي صغير مستقيمشركة أدوات العلوم الدقيقة14028-10
ملقط نمط قياسيFine Science Tools Inc.11000-12
مقص زنبركي فاناسأدوات العلوم الدقيقة Inc.15000-08
معدات
وحدة الزناد ECG3000003686الطب الحيوي السريع
MICROCAPSTAR محلل ثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزرAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
مجهر متعدد الفوتون Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 قنوات مسجلAD InstrumentsPL3508
وسادة تسخين يتم التحكم في درجة حرارتهاSygonix26857617
مستشعر درجة الحرارةمتاح
نظام التحكم في درجة الحرارة للمجاهر - Cube& تصوير بوكس لايف
استهلاكيةتجارياالجراحية شركة بشكل عاجل خدمات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Intravital MicroscopyMultiphoton MicroscopyLiver ImagingCXCR6 Gfp MiceLeukocyte MigrationCell Cell InteractionsLong Term ImagingTissue StabilizationVital Parameter MonitoringLaser Scanning Microscopy

مقالات ذات صلة