مقالة منهجية

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

12.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52654

⸱

يناير 31, 2015

 ,  , 
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا لالتقاط ديناميكيات تجديد زعانف ذيل يرقات الزرد على نطاق كامل من الأنسجة باستخدام الفحص المجهري المجهري القائم على الحقل الساطع. تتيح هذه التقنية التقاط ديناميكيات التجديد بدقة خلية واحدة. يمكن تكييف هذه المنهجية مع أي مجهر مجسمة مزود بكاميرا CCD وبرنامج الفاصل الزمني.

الملخص

تعتبر زعنفة ذيل يرقات الزرد مثالية لدراسة تجديد الأنسجة بسبب الهندسة المعمارية البسيطة لطية زعنفة اليرقات ، والتي تتكون من طبقتين من الجلد تحيطان باللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ولأن زعنفة ذيل اليرقات تتجدد بسرعة في غضون 2-3 أيام. باستخدام هذا النظام ، نوضح طريقة لالتقاط ديناميكيات إصلاح زعنفة الذيل المبتورة باستخدام الفحص المجهري المجهري للمجال الساطع بالفيديو بفاصل زمني. نثبت أن بتر الزعانف يؤدي إلى تقلص جرح البتر وبثق الخلايا حول هامش الجرح ، مما يؤدي إلى إزالتها لاحقا. ينتقل تجديد الزعانف من الاتجاه القريب إلى الاتجاه البعيد بعد تأخير قصير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة النمو التنموي لليرقة خلال جميع المراحل. توفر الطريقة المقدمة فرصة لمراقبة وتحليل سلوكيات مقياس الأنسجة بالكامل مثل تطور الزعانف ونموها في إعداد مجهر بسيط ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع أي مجهر مجسم مع قدرات الفاصل الزمني.

المقدمة

تعد قدرة الكائن الحي على تنسيق عمليات إصلاح الأنسجة بعد الإصابة أمرا بالغ الأهمية لبقائها على قيد الحياة 1. في حين أن جميع لديها القدرة على التئام جروحها ، فإن مدى تجديد الأنسجة يختلف اختلافا كبيرا بين الأنواع. تتمتع أنواع الفقاريات مثل أسماك الزرد والسمندل والضفادع الصغيرة بقدرة رائعة على تجديد الأنسجة المفقودة ، بما في ذلك الزوائد وأجزاء من عيونها وقلبها والجهاز العصبي المركزي 2-4. أنواع الثدييات ، مثل الفأر الشوكي الأفريقي والأرانب ، قادرة على تجديد الثقوب في الصيوان 5-7 ، ويجدد البشر والفئران أجزاء من كبدهم بالإضافة إلى أطراف أرقامهم خلال مراحل الجنين والأحداث 8-12. على الرغم من أنه ليس مفهوما جيدا حتى الآن لماذا وكيف تجدد أنواع معينة الأنسجة بشكل أكثر فعالية من غيرها ، إلا أن وجود مسارات وراثية مماثلة يشير إلى أن هذه الآليات قد تظل نائمة في الأنواع دون إمكانية تجديد كبيرة 13،14. وبالتالي فإن توضيح آليات إصلاح الأنسجة وتجديدها في الأنواع ذات نتائج التجديد المرضية سيفيد التجديد لدى البشر.

لقد اخترنا زعنفة ذيل الزرد اليرقية كنموذج لإثبات تجديدها من خلال الفحص المجهري المجهري الساطع بفاصل زمني. زعنفة ذيل يرقات الزرد بسيطة من الناحية التشريحية مقارنة بالهياكل البالغة الأكثر تعقيدا ، وتتكون من ظهارة مطوية من طبقتين مع محاور حسية جسدية تعصب الجلد الذي يحيط بالخلايا الوسيطة الموجودة وسطيا 15. على الرغم من الاختلافات التشريحية ، فإن تجديد زعانف ذيل اليرقات يمكن مقارنته إلى حد ما بتجديد الزعانف البالغة من حيث التوقيعات الجزيئية واستجابات النمو 16،17. بالمقارنة مع الزعنفة البالغة ، فإن تصوير تجديد زعانف ذيل اليرقات له العديد من المزايا: 1) يكتمل تجديد زعانف اليرقات في غضون 2-3 أيام فقط 16 ، 2) يمكن تركيب اليرقات في الاغاروز منخفض الذوبان ، و 3) لا تتطلب اليرقات التغذية حتى ~ 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) بسبب وجود كيس صفار البيض. هذا يجعل يرقات الزرد مثالية لمراقبة ديناميكيات إصلاح الأنسجة في الجسم الحي.

تتيح الطريقة المقدمة التقاط الديناميكيات التفصيلية الكامنة وراء العمليات المبكرة لتجديد الزعانف. استخدمت العديد من الدراسات الفحص المجهري متحد البؤر القائم على التألق لدراسة العمليات البيولوجية الخلوية وتحت الخلوية في أسماك الزرد الجنينية واليرقات. ومع ذلك ، غالبا ما لا تكون إعدادات التصوير متحد البؤر المتطورة في متناول الجميع ومكلفة للغاية مقارنة بتقنيات التصوير الأخرى. في المقابل ، تستخدم المنهجية المقدمة مجهريا مجسيما Discovery V12 مزودا ببرنامج Axiovision ووحدة فاصل زمني ، مما يوفر بديلا ميسور التكلفة لمعدات التصوير باهظة الثمن لفحص سلوكيات الأنسجة. نوضح أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير تجديد الأنسجة بدقة زمنية عالية بأقل تكلفة. يمكن أن تمتد الآثار المترتبة على هذه الطريقة إلى ما هو أبعد من علم الأحياء الأساسي لتطوير دراسات تجديد الثدييات باستخدام مزارع الأعضاء ، من أجل التطوير العلاجي من خلال الشاشات الدوائية والجينية ، ويمكن أن تكون بمثابة أداة تعليمية في بيئة الفصل الدراسي.

البروتوكول

كانت ولدت الزرد (سلالة الصدف) ورفعت وفقا لبروتوكولات المعمول بها. وقدمت كل الجهود للحد من المعاناة، وذلك باستخدام 0.4 ملي تريكين للتخدير و1 ملم تريكين للقتل الرحيم. تم التعامل مع الأجنة الزرد واليرقات وفقا صارم مع ممارسة الحيوان جيدة كما وافقت عليها اللجنة المناسبة (مختبر MDI البيولوجية الحيوانية الأساسية IACUC عدد 13-20). وافقت هذه الدراسة من قبل لجنة معهد بحوث الجينوم البشري رعاية الحيوان واستخدام الوطني، MDIBL ضمان المؤسسي # A-3562-01 تحت بروتوكول # 14-09.

ملاحظة: إجراء التصوير الذي يلتقط تجديد الزعانف في يتلخص في الخطوات التالية الزرد اليرقات:

1. رفع من اسماك الزرد إلى مراحل اليرقات

  1. جمع البيض ووضع ما يقرب من 50 البيض إلى 100 × 25 مم طبق بتري تحتوي على 0.03٪ ملح المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات تستكمل مع 0.00004٪ الميثيلين الأزرق. احتضان O / N في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
    2. <لى> في صباح اليوم التالي إزالة الأجنة الميتة مع ماصة الزجاج وشطف البيض في مصفاة مع 0.03٪ ملح المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات (وهو ما يسمى المتوسطة الجنين).
    ملاحظة: متوسطة مثل قارعو الأجراس 18، 18 هانكس، E2 19، 20 E3، وDanieau 21 مايو يكون من المفضل.
  2. سوب> إضافة المتوسطة الجنين الطازجة إلى الطبق. إذا باستخدام سلالات المصطبغة، اختياريا إضافة 0.2 ملي 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU)، وPTU سيمنع استحداث الميلانين وبالتالي تصبغ اليرقات. السماح للأجنة مواصلة تطوير في الحاضنة حتى 2 أيام بعد الإخصاب أو أي مرحلة اليرقات الأخرى المطلوبة.

2. إعداد غرفة التصوير

  1. طريقة 1: التصوير غرف مصنوعة من PVC أو تفلون أنابيب (الشكل 1)
    ملاحظة: هذه الطريقة مشابهة لكونشا وآدامز (1998) 22.
    1. الحصول على مياه الشرب البلاستيكية الصف أو تفلون أنابيب من متجر لاجهزة الكمبيوتر مع 25 ملم والخارجيدا 20 مم القطر الداخلي. قطع أنابيب لجعل حلقات من حوالي 10 مم سمك حتى مع سطح على كل جانب. استخدام> 200 حصى الصنفرة لتنعيم الحواف.
    2. تنظيف حلقات مع الماء الدافئ والايثانول 70٪ والسماح لهم الهواء الجاف.
    3. مع طرف ماصة، وتطبيق الشحوم السيليكون لنصف حلقة وإرفاق حلقة إلى 75 مم × 25 مم غطاء زجاجي زلة. بدلا من ذلك، استخدم حقنة 3 مل مليئة الشحوم السيليكون بدلا من غيض ماصة.
      ملاحظة: لأنه من الصعب إدراج الشحوم السيليكون في حقنة 3 مل، إضافة الشحوم السيليكون لحقنة 30 مل أولا واستخدام هذا لملء حقنة 3 مل.
  2. طريقة 2: إعداد طبق بتري بمثابة غرفة التصوير.
    1. الحصول على 35 أو 60 مم أطباق بتري مع ساترة الزجاج تعلق على غطاء (الشكل 2A). بدلا من ذلك، كما هو مبين في الشكل (3) من ديستل وكوستر (2007) 23، حفر فتحة صغيرة بما يكفي لحساترة القديمة إلى غطاء طبق بتري الصغيرة وتطبيق الشحوم السليكون إلى الخارج مع حقنة 3 مل. باستخدام طرف ماصة نظيفة، ونعلق بعناية جولة أو ساترة مربع من سمك المطلوب إلى الخارج (الشكل 2B).
  3. للتأكد من أن الاغاروز تستخدم لتركيب إقامة ترتبط بقوة أثناء إجراء التصوير، وإرفاق شبكة بلاستيكية الجميلة داخل الحلبة. أولا، وقطع شبكة مصنوعة من نافذة الشاشة تم الحصول عليها من متجر لاجهزة الكمبيوتر، في حجم قطرها الدائري الداخلي باستخدام مقص غرامة مع زاوية. ثم قطع مستطيل صغير> ضعف حجم اليرقة إلى منتصف شبكة (الشكل 1، 2).
  4. تطبيق أربعة نقاط صغيرة من غير سامة السيليكون الشحوم إلى الواجهة بين انزلاق الغطاء وحلقة الغرفة (الشكل 1A).
  5. استخدام ملقط لإرفاق شبكة بقوة إلى أسفل ساترة الزجاج.

3. تركيب والتصوير من قبل ينجمحكم اليرقة (هذه الخطوة اختيارية)

ملاحظة: هذه الخطوة هي مناسبة لإجراء مقارنات بين طول الزعانف بتر ومجدد، حيث أن الطائرة بتر بعد تجديد الزعانف ليست معترف بها في يرقات الزرد.

  1. يعد حل الاغاروز 0،5-1،2٪ المنخفضة للذوبان في المتوسط ​​الجنين عن تجميد للعينة.
  2. تسخين الاغاروز في الميكروويف ونقل الاغاروز السائل إلى 1.5 مل أنابيب التي يتم قبل تحسنت إلى 42 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
  3. السماح للالاغاروز الساخن يبرد إلى 42 درجة مئوية، والتي لا يمكن الحفاظ عليه على مدى عدة أسابيع في درجة الحرارة هذه. في محاولة لتجنب pipetting لاليرقات إلى الاغاروز فوق 42 ° C، وهذا سيكون ضارا للحيوانات.
  4. تخدير عدة اليرقات باستخدام 10 مل من 0.4 ملي تريكين (الرقم الهيدروجيني 7) في المتوسط ​​الجنين في 60 مم طبق بتري. إعداد تريكين وفقا لكتاب وصفات اسماك الزرد 18.
    1. بدلا من ذلك، استخدم 10 مل من 1: 1000 تخفيف من 99٪ 2-فينوكسييثانول في 60 مم طبق بتري. كزة اليرقات مع توج طرف microloader ماصة لتقييم استجابة اتصال بهم قبل المتابعة. استخدام اليرقات غير متجاوبة فقط.
  5. نقل يرقة واحدة إلى 42 ° C حل الاغاروز باستخدام الماصة الزجاج باستور. لا نقل السائل المفرط في الاغاروز، وإلا فإن الاغاروز سوف تضعف جدا ولا يصلب.
  6. تجاهل السائل المتبقي من الماصة ونقل اليرقة مع قطرة واحدة من الاغاروز في طبق بيتري صغير (35 أو 60 مم). ضع اليرقة على جانبها للتصوير من زعنفة الذيل.
  7. السماح للالاغاروز ليصلب. تقييم الاغاروز مع ماصة غيض من البلاستيك؛ سوف غيض تزج في الاغاروز إذا كان السائل أيضا. مرة واحدة وقد عززت agarose، فإن المسافة البادئة الصغيرة تكون مرئية على لمس مع طرف ماصة. وبعد التصلب، إضافة حل تريكين والمضي قدما للstereomicroscope التي سيتم استخدامها في وقت لاحق للتصوير مرور الزمن. ملاحظة: يمكن أيضا هذه الخطوة أن يؤديها من خلال وضع اليرقة تخدير على طبق بتري المغلفة مع 1.5٪ الاغاروز في المتوسط ​​الجنين.
  8. استخدام stereomicroscope مع برنامج مرور الزمن. تحديد الهدف المناسب والتكبير، والتي سيتم استخدامها في وقت لاحق للتصوير مرور الزمن. هنا، استخدم 3.5 × 16 ملم العمل عن بعد عدسة الهدف على stereomicroscope. كما هو مطلوب، استخدام المجاهر البديلة والعدسات موضوعية ولكن اختيار التكبير الصحيح لتفسير محتمل س ص العائمة ونمو الزعنفة أثناء إجراء التصوير.
  9. حدد طريقة الكشف عن الكاميرا على المجهر.
  10. في البرنامج، حدد وضع "حي" لعرض يرقة على الشاشة.
  11. فتح نافذة "خصائص" للكشف تلقائيا سطوع.
  12. ضبط التباين في المجهر قاعدة العابرة للإضاءة يدويا.
  13. نقل اليرقة من مجال الرؤية وتحديد ميزة تصحيح تظليل للحد من أي خلفيةايسي.
  14. ضع يرقة مرة أخرى في مجال الرؤية وأخذ لقطة. حفظ الصورة.
  15. إزالة الاغاروز من اليرقة عن طريق كشط لأول مرة الاغاروز قبالة الرأس. بهذه الطريقة يمكن انزلق اليرقة من الاغاروز عن طريق سحب بلطف رأسه بعيدا عن الاغاروز المتبقية مع طرف microloader الماصة توج أو دبوس الحشرات.
  16. مع كوب باستور الماصة نقل اليرقة إلى حل تريكين الطازجة.

4. بتر الفحص

  1. يعد حل الاغاروز 1.5٪ باستخدام الجنين المتوسطة وتصب طبقة رقيقة في طبق بتري. السماح للالاغاروز يصلب.
  2. تحت stereomicroscope، وضع sideward يرقة على الاغاروز طدت وبتر زعنفة الذيل مع 23 G حقنة إبرة مع ضغط طفيف (الشكل 3A).

5. تركيب اليرقة التصوير الوقت الفاصل

  1. المضي قدما كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،5 (الشكل 3B).
  2. نقل قطرة من الاغاروز السائل 0،5-1،2٪ عند 42 ° C تحتوي على اليرقة إلى الحلبة غرفة التصوير (الخطوة 2.1)، توجيه اليرقة والسماح للالاغاروز يصلب. ملء حلقة مع حل تريكين. بدلا من ذلك، إذا تم استخدام غرفة طبق بتري (الخطوة 2.2)، جبل اليرقة على ساترة غطاء وملء غطاء مع حل تريكين.
  3. السماح التئام الجروح السليم أو تجديد الأنسجة أن يحدث، كشط بعناية قبالة الاغاروز المحيطة زعنفة الذيل البعيدة باستخدام طرف microloader ماصة توج أو دبوس الحشرات. حاول أن لا تجرح الزعنفة مرارا وتكرارا (الشكل 3C).
  4. صب الحل تريكين تحتوي على إزالة الاغاروز وملء حلقة الغرفة مع الحل تريكين الطازجة.
  5. تطبيق الشحوم السيليكون إلى أعلى الحلبة غرفة وإرفاق 75 مم × 25 مم الزجاج الشرائح. في محاولة لتجنب جيوب الهواء في الغرفة، لأنها سوف تتداخل مع التصوير brightfield وتيبس اليرقة مع مرور الوقت.
  6. في حالة استخدام طبق بتري كمالغرفة التصوير، وتطبيق الشحوم السيليكون إلى حافة العلوية للغرفة السفلى وملء الغرفة السفلى مع حل تريكين. صب بعناية الحل تريكين في غطاء وتحويل غطاء على أن تزج اليرقة إلى حل تريكين من الغرفة السفلى في زاوية طفيف لتفادي جيوب الهواء. سوف تكون مختومة الغرفة بسبب الشحوم السيليكون.

التصوير 6. الوقت الفاصل

  1. تجميع غرفة الحضانة ساخنة كما هو موضح في 23،24 (الشكل 4). مكان في غرفة الحضانة في جميع أنحاء المجهر وبدوره على الحرارة. ضبط درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية لمدة 10 - 20 دقيقة أو حتى استقرت درجة الحرارة.
  2. فتح أمام غرفة الحضانة ساخنة ووضع غرفة التصوير على موقف المجهر مع ساترة تواجه صعودا نحو الهدف.
  3. ضع زعنفة اليرقات بطريقة 2/3 من مجال الرؤية تبقى غير مأهولة. وهذا يضمن القبض علىالنمو وتجديد للزعنفة على مدار إجراء التصوير دون الحاجة إلى إعادة اليرقة.
    1. ضبط اليرقة محمولة إلى 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~ قبل بدء تسجيل مرور الزمن لتجنب التغيرات في كثافة brightfield أو التحولات المحتملة للالاغاروز. بدلا من ذلك، استخدام عازلة استعد مسبقا لبدء التصوير بعد الوقت للتكيف أقصر.
  4. لإعداد تسجيل مرور الزمن، وفتح نافذة 6D متعددة الأبعاد اقتناء في البرنامج Axiovision وحدد الخيار ض المكدس والوقت الفاصل.
  5. اختياري) في علامة التبويب ض المكدس ووضع شريحة، حدد سمك شريحة ثم اختيار وضع بدء / إيقاف.
  6. تحديد موقف العلوي والسفلي من المكدس.
  7. في علامة التبويب مرور الزمن، حدد الفاصل ومدة الفيلم ومن ثم يبدأ الفيلم عن طريق الضغط على زر البداية. وجدنا أن 30 دقيقة فترات كافية وهذا الفاصل الزمني لا يولد البيانات المفرط. ومع ذلك shorteويمكن استخدام فترات ص.
  8. التحقق من موقف وض المكدس الأبعاد خلال الساعة الأولى إذا اليرقة لم تعدل مسبقا. إذا لزم الأمر، إعادة اليرقة مرة أخرى بعد يوم، كما يرقة قد تحولت.
  9. حفظ الملف في نهاية تسجيل الوقت الفاصل بين والمضي قدما في مرحلة ما بعد المعالجة وquantifications باستخدام برامج التحليل متاح الصورة، مثل Imaris 25 أو مفتوحة المصدر حزم البرمجيات صورة J 26 و 27 فيجي.

7. تحليل البيانات

  1. تحديد طول الزعانف.
    1. فتح الفيلم الوقت الفاصل في برامج التصوير وحفظ الملفات في تنسيق ملف الملكية لتعزيز أداء البرمجيات.
    2. حدد عرض متعامد لعرض المقاطع الفردية كما مداخن المتوقعة. لتصحيح الانحراف، ضمن القائمة فيجي، حدد الإضافات، ثم التسجيل، و "3D الانجراف الصحيح". هذا وسوف تفتح نافذة فيجي وإجراء التصحيحات الانجراف. صحيحالانجراف التناوب في وظيفة البقع Imaris. بدلا من ذلك، تثبيت الإضافات StackReg وTurboReg في صورة J واستيراد لفيجي. اختيار خوارزمية التحول المطلوب في البرنامج المساعد StackReg.
    3. لقياس المسافات (على سبيل المثال، قطر الجرح أو طول الزعانف)، حدد الخيار "إضافة نقاط قياس جديدة" في شريط الأدوات العلوي الأيسر.
      1. تحت عنوان "قائمة تكوين للإحصاء مرئية القيم" في القائمة اليسرى السفلى، حدد القيم إحصاءات ليتم عرضها.
      2. في 'وضع خط "تحت علامة التبويب إعدادات اختر' أزواج (AB، CD ...)".
      3. في "تسميات خصائص" حدد "اسم" و "القطر"، لعرض المسافة بين النقطتين A و B المقبل إلى خط القياس.
      4. التبديل إلى الوضع "تحرير" والضغط على زر التحول لتحديد النقطة الأولى في نهاية الحبل الظهري. ثم استخدام نفس التكوين لتحديد النقطة الثانية على الهامش الزعنفة البعيدة.
      5. ضمن علامة التبويب "الإحصائيات"، حدد زر القرص (تصدير جميع) في أسفل اليمين لعرض وتصدير المسافة في الصورة.
      6. تكرار القياسات في أوقات محددة عن طريق تحريك شريط التمرير أسفل الصورة إلى اليمين. بدلا من إنشاء نقاط القياس الجديدة، تلك السابقة يمكن تعديل أوضاعها من خلال اختيار أول نقطة مع زر الماوس الأيسر، ثم في وقت واحد الضغط على التحول وعلى زر الماوس الأيسر في موقف جديد.
    4. بدلا من ذلك إلى الخيار نقاط القياس، واستخدام المشاهد شريحة لقياس المسافات. في وضع العرض شريحة، انتقل إلى الموضع المطلوب وانقر على المركز الأول والثاني مع زر الماوس الأيسر. سيتم عرض المسافة. هذا الخيار ولكن لا يسمح للتصدير البيانات.
  2. تحديد طول الزعانف ومنطقة في يماغيج.
    1. فتح الفيلم الوقت الفاصل في يماغيج باستخدام البرنامج المساعد الذي يعترف تنسيق ملف .zvi. بدلا من ذلك، تحميل في تشوملف ickTime أو تسلسل شجار.
      ملاحظة: في حالة استخدام تنسيق ملف غير مضغوط تشاحن، لا تحتاج أبعاد الصورة لا بد من تحديدها.
    2. إذا فتح تنسيق ملف مختلف دون معلومات الملف، اختر 'مقياس تعيين "ضمن القائمة" تحليل "لتحديد أول مسافة صورة وحدة. في 'تعيين القائمة مقياس "، اكتب في" القطر بالبكسل "، تحت نوع في' المسافة المعروفة" لقيمة بكسل (وهذا يمكن الحصول عليها عن طريق قياس عدد البكسلات على شريط النطاق الذي تمت إضافته إلى الصورة ، ثم انقر فوق قياس للحصول على النتيجة)، و "وحدة من طول" (عادة "ميكرون). ثم انقر فوق موافق.
    3. لقياسات منطقة الزعانف حدد أداة "اختيار حر" في شريط الأدوات والخطوط العريضة للمنطقة الزعانف بواسطة الضغط على زر الماوس الأيسر باستمرار أثناء الرسم على طول الخطوط العريضة للزعنفة. لقياس طول الزعانف، حدد "مستقيم" أداة الخط ورسم خط بين النقاط المرادقياس.
    4. انقر فوق الخيار "قياس" تحت عنوان "تحليل" لعرض المنطقة وطول الزعنفة. كرر هذه الخطوة بقدر ما اللازمة للحصول على نقاط زمنية متعددة من الفيلم.
  3. باستخدام الإحصاءات البرمجيات البيانات يمكن عرضها بيانيا.

النتائج

تقنية عرض مناسبة لتوضيح ديناميات إصلاح الأنسجة ردا على بتر. يوضح الفيلم الذي بتر الزعنفة مشغلات البداية تأثير محفظة سلسلة، وتتميز تقلصات عبر كابلات الأكتين الميوسين التي تكون موجودة في الزعنفة أضعاف 28 (الشكل 5 A، B). وفي الوقت نفسه، تنبثق الخلايا من الجرح (انظر الفيلم). وبالتالي قد تقلص يكون وسيلة لطرد الخلايا التي من المرجح الموجهة للخضوع لموت الخلايا. تظهر نتائجنا أيضا أن النمو التنموي لليرقة يحدث بشكل مستقل عن تجديد (فيلم)، في حين لا بدء تجديد الزعانف حتى حوالي 14 ساعة بعد بتر مقاسا طول الزعانف والمنطقة على مدار الساعة من 36 ساعة بعد بتر (الشكل 5C ، D). وبلغ إجمالي النمو زعنفة التجدد بعد 1.5 أيام حوالي 60٪ من طول الزعانف الأصلي (الشكل 5E). أخذت معا، وهذه النتائج تثبت أن آر البتر iggers انكماش الزعانف، وقذف من الخلايا من الجرح، واستجابة التجدد تأخر زمنيا. في حين أن الخلايا مقذوف من المرجح متجهة للخضوع لموت الخلايا، وطبيعة هذه الخلايا تحتاج إلى مزيد من التوضيح.

figure-results-1
الشكل 1. التصوير التجمع حلقة الغرفة

(A) يظهر هو حلقة من البلاستيك التي يتم تركيبها على ساترة مع الشحوم السيليكون. ومرفق شبكة بلاستيكية إلى داخل الغرفة مع أربعة نقاط صغيرة من الشحوم السيليكون. (B) يتم تعبئة غرفة تحتوي على يرقة مزودة حل تريكين ويتم إرفاق شريحة زجاجية إلى الأعلى. (C) والتي شنت يوم 2-القديم يرقة (السهم) ويظهر في أعلى التكبير لتصوير حجمه بالنسبة للشبكة."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. التصوير غرفة جعلت الجمعية من أطباق بتري. (A) يظهر هو الزجاج التجاري الزجاج العلوي طبق بتري السفلي مع شبكة بلاستيكية تعلق على ساترة الزجاج. (ب) يظهر هو طبق بتري الغرفة التي شيدت الذاتي مع وجود ثقب حفر في غطاء وساترة المرفقة من الخارج مع الشحوم السيليكون. شبكة واليرقة هي التي شنت داخل غرفة تحتوي على حل تريكين. لختم الغرفة، يتم تطبيق الشحوم السليكون إلى العليا، الحافة الخارجية للغرفة السفلى وغطاء رأس المرفقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بديل ملغ = "الشكل 3" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg" />
الشكل 3. مخطط البتر وتصاعد ليرقة للتصوير. (A) لبتر، وضع اليرقة تخدير على أي طبق بتري المغلفة الاغاروز وبتر زعنفة الذيل مع إبرة حقنة. (B) للتركيب، ونقل اليرقة مع ماصة نقل في أنبوب 1.5 مل مليئة 42 ° C الاغاروز السائل وماصة قطرة تحتوي على اليرقة إلى غرفة التصوير، توجيه الأسماك وتغطية عزز الاغاروز مع الجنين المتوسطة. (C) كشط قبالة الاغاروز من زعنفة الذيل باستخدام microloader ماصة توج أو أداة مماثلة، واستبدال الجنين المتوسطة مع المتوسطة الطازجة. (D) صورة زعنفة الذيل تحت stereomicroscope. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ithin صفحة = "دائما"> figure-results-3
الرقم 4. غرفة الحضانة ساخنة-شيدت الذاتي. (AC) يظهر هو غرفة الحضانة ساخنة مصنوعة من الورق المقوى، والتفاف فقاعة والفيلكرو. وترد سخان قبة سلكي (المصممة أصلا لبيضة الدجاج الحضانة) إلى غرفة باستخدام شريط الألمنيوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الرقم 5. ديناميات تجديد مؤشرات مالية (A) مخطط الذيل تستخدم الزعانف فحص البتر والكمي طريقة لتحديد طول الزعانف (السهم الأحمر) والمنطقة (مخطط الحمراء للزعنفة). (B) الذيل بتر الزعنفة مشغلات البداية انكماش الزعنفة، تليها REGEثمرة الأنسجة nerative. يخضع الزعنفة أيضا النمو التنموي، كما يتضح من زيادة حجم الجانبية. (C) يظهر هو طول الزعانف بوصفها وظيفة من الزمن، وكشف عن انطلاق النمو التجديدي الخطي في ~ 14 HPA. (D) الكمي لمنطقة الزعانف يكشف عن انخفاض في البداية في الحجم، والتي يمكن أن تعزى إلى تقلص الزعنفة. بعد ~ 14 ساعة، ويزيد من حجم الزعانف بمعدل خطي. (E) مقارنة طول الزعنفة قبل بتر وبعد 36 ساعة معارض ~ 60٪ إعادة نمو. شريط مقياس: 100 ميكرون المختصرات: قبل أمبير، قبل بتر. آخر ساعة البتر، HPA. مغذي، وتجديد. أمبير، بتر الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم . تجديد زعنفة على مدار الساعة من 36ساعة. المعروضة زعنفة ذيل يرقة القديمة 2.5 يوما خلال التجدد. وبدءا تصوير 30 دقيقة بعد بتر النمو التجديدي في 30 دقيقة فترات على stereomicroscope باستخدام عدسة الهدف 3.5X.

المناقشة

يسمح الطريقة المعروضة لرصد التئام الجروح وترميم الأنسجة في العيش اليرقات الزرد في الجسم الحي مع مرور الزمن التصوير على stereomicroscope brightfield، وذلك باستخدام بسيط نسبيا مجموعة المتابعة. يتطلب هذا الإجراء بعض الجوانب الهامة التي اختبرناها، والتي سوف تحسين نتائج: 1) تركيزات منخفضة الاغاروز (~ 0.5٪) وتقليل العوائق نمو اليرقات الزرد تزايد مستمر، 2) إزالة الاغاروز حول زعنفة مهمة لا لإخفاء عملية الشفاء، 3) محاصرة الاغاروز في شبكة بلاستيكية تحتفظ الاغاروز والحيوانية في وضع مستقر في جميع أنحاء الداخلي، و4) بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة المناسبة، وهو أمر ضروري لبقاء اليرقات. تكيفنا حضانة غرفة ساخنة 23،24، الذي يستخدم التفاف فقاعة التي سجلت على الورق المقوى، وسخان قبة سلكي للسيطرة على درجة الحرارة ودوران الهواء السليم مع تقلبات طفيفة خلالإجراء التصوير. هذه الغرفة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة يمكن أن تكون على استعداد لتناسب أي المجهر. وقد استخدمت وغرفة الحضانة ساخنة مماثلة أيضا بالنسبة للفئران التصوير والتنمية فرخ 24،29.

ونقترح أن اليرقات بترت قبل هي التي شنت لصورة ما قبل البتر، demounted للبتر، وremounted للتصوير مرور الزمن. على الرغم من أنه من الممكن لتنفيذ هذه الخطوات في خطوة واحدة في غرفة التصوير النهائية، في تجربتنا وجدنا أن بتر زعنفة الذيل على ساترة الزجاج ليس الأمثل، لأنه يمزق الأنسجة و لا يؤدي إلى قطع نظيفة. طريقة بتر القائم على الاغاروز باستخدام إبرة حقنة ووصف في الأصل من قبل كواكامي وزملاؤه (2004) 16 وأيضا، في تجربتنا، مثالية لأداء بتر الأطراف. وهكذا، فإن سلسلة معقدة بدلا من الخطوات التي قدمناها له ما يبرره جيدا ويضمن نتيجة تجديد المثلى.

أظهرنا أن larvآل الزرد في 2 DPF ولا يمكن تصوير ما يصل إلى 1.5 أيام في الاغاروز وحل تريكين. كنا تريكين (PH7) الحل الأمثل درجة الحموضة أعد مع الملح المحيط الفوري، والتي لا تتعارض مع صحة العينة للفترة التصوير المقدمة. ونحن مع ذلك سابقا أظهرت أيضا أن استخدام تريكين في Danieau المتوسطة يسمح الوقت الفاصل بين التصوير من 2.5 DPF الزرد اليرقات على المجهر متحد البؤر لا يقل عن 2 أيام 30. وهكذا، يمكن أن الظروف المثلى عازلة تمتد الصحة اليرقات وطول التصوير. بدلا من ذلك، يمكن استخدام تركيزات أقل تريكين للتخدير، أو 2-فينوكسييثانول، التي وجدنا جيد التحمل خلال مراحل اليرقات والكبار عند 28 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 60 ساعة.

لتجنب عيوب في تجديد الزعانف، ونحن إزالة الاغاروز من زعنفة الذيل قبل التصوير. بياناتنا تظهر أنه في غضون 1.5 أيام تمت إعادة إنشاء الزعنفة إلى حوالي 60٪. هذا المعدل تجديد يتسق مع دراسة سابقة تحديد 3 أيام فيليالي متوسط ​​الوقت للزعنفة الذيل تجديد في يرقات الزرد تصل إلى 6 DPF 16. بيد أنه يمكن استخدام أساليب بديلة لالاغاروز لتركيب الأسماك للتصوير. على سبيل المثال، جلطات البلازما رقيقة 31 أو المفلورة الإثيلين والبروبيلين (محطة إثراء الوقود) أنابيب المغلفة مع ميثيل ومليئة تركيزات الاغاروز منخفضة جدا (0.1٪) وقد أوصى للضوء ورقة المجهري 32 و قد تكون مناسبة لأسلوبنا المقدمة. ومع ذلك، فإننا لا ننصح ميثيل و 0.1٪ الاغاروز، لأنها تتطلب أن العينة هي التي شنت على الجزء السفلي من الغرفة نظرا لعدم وجود تصلب هذه الوسائط. سوف تركيزات عالية جدا من ميثيل تولد علاوة على ذلك جيوب الهواء بناء على خبرتنا، وهذه قد تتداخل مع إجراء التصوير. إذا فضلت وسائل الإعلام هذه مع استخدام الغرفة السفلى، من المهم أن المسافة العمل المناسبة بين عدسة موضوعية والعينة موجودة. وتجدر الإشارة إلى أن مويوصى إيثيل سيللولوز كوسيلة تصاعد فقط لمدة تصل إلى 1 في اليوم، لأنها قد تتداخل مع صحة اليرقات 32.

تركيب العينة في الغطاء قد يؤدي إلى بطء الانجراف نحو الانخفاض الجاذبية. لذا فمن المستحسن أن صورة مقاطع متعددة في كل نقطة زمنية، والتي يمكن أن تكون إما المتوقعة في طائرة واحدة أو الصور فقط التي هي في المستوى البؤري يمكن استخراجها لتجميع الفيلم النهائي. يمكن تصوير العينة في الغرفة السفلى تكون منهجية بديلة لتجنب الانجراف نحو الانخفاض المحتمل. جلطات البلازما يمكن أن تكون مفيدة لتجنب الانجراف، والبلازما ستتمسك طبقة يغلف الخارجية (EVL، محيط بالأدمة) 31، وبالتالي قد استقرار العينة. ولكن هذا يحتاج لفحصها، وكذلك كيف يمكن الحفاظ على الزرد اليرقات طويلة في تجلط البلازما دون التدخل في الصحة اليرقات أو تجديد الزعانف.

تم تجميعها دينا فيلم استخدام المقاطع الفردية (26 ميكرون)من سجلت ض المكدس، الذي غطى سمك الكامل للزعنفة (~ 10 ميكرون)، والتي تمثل المحتملين ض الانجراف الزعنفة أثناء إجراء التصوير. من أجل الحفاظ على المعلومات 3-D، فمن الممكن أيضا أن المشروع مداخن-Z في الصور واحدة. لأن هذا قد يؤدي إلى التشويش من الصورة، قد يكون المطلوب brightfield إزالة التفاف. البرامج، مثل Deconvolve أو X3 Autoquant يمكن استخدامها لهذا الغرض. بدلا من ذلك، خوارزميات رياضية (الموصوفة في تادرس 33) يمكن تطبيقها للحصول على وظيفة نقطة انتشار نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء (SNR). الحصول على SNR عالية تمثل واحدة من العقبات الرئيسية في brightfield إزالة التفاف. على الرغم من أن هذه الطريقة يتطلب التباين العالي ورقيقة سمك العينة، سيكون من المناسب للتصوير من زعنفة الذيل نتيجة لانخفاض عرضه.

وهناك ميزة واضحة عن طريقة التصوير قدمت هو أنه قابل للتكيف بسرعة إلى أي stereomicroscope مجهزة كاميرا CCDد البرمجيات الوقت الفاصل بين ويقدم بديلا منخفض التكلفة لأنظمة التصوير متحد البؤر أكثر تكلفة. في حين أن هذا الأسلوب لا تستخدم مضان للكشف عن الخلايا، ويمكن تمديدها لهذه التطبيقات من خلال استخدام نظام آلي للتحكم في مصراع وبعد التصوير إزالة التفاف البرمجيات 34. وهذا من شأنه تمكين المستخدمين لمواصلة مراقبة عمليات إصلاح الجرح وتجديد مع خلية واحدة أو قرار التحت خلوية على مدى فترات زمنية أطول.

وضوح بصري والسهولة التي الجنينية والزرد اليرقات يمكن التعامل معها، والقدرة على التكيف من هذا الأسلوب لأي stereomicroscope يجعلها مناسبة لتدريس علم الأحياء الفقارية الأساسي في إعداد الفصول الدراسية. يمكن لهذا الأسلوب تزويد الطلاب بفهم أفضل للعمليات البيولوجية الأساسية الكامنة وراء إصلاح الأنسجة وتجديدها. العمليات البيولوجية الأخرى التي تم التقاطها باستخدام طريقة مماثلة هي التطور الجنيني الزرد 23،34 والقلبوظيفة (غير منشورة). هذا الأسلوب يوفر أيضا إمكانية لإصلاح مراقبة الجرح وتجديد في اليرقات التي تم التلاعب بها وراثيا ودواء.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر منشأة الخدمة الأساسية للحيوانات في المختبر البيولوجي MDI لصيانة أسماك الزرد. تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من خلال جوائز التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب منحة أرقام P20GM104318 (ل COBRE) و P20GM103423 (INBRE) ووزارة الدفاع - USAMRAA (W81XWH-BAA-1).

المواد

Equipment< / strong>
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
recodes < / strong>
Bullseye AgaroseMidSciBE-GCA500
الكواشف الحيويةمنخفضة الذوبان من الاغاروزفيشر BP1360-100
1-phenyl-2-thioureaAlfa AesarL06690
Instant Ocean Aquarium SaltPet Store
Methylene Blue (محلول 0.1٪)SigmaM9140
تريكايين (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)سيجما ألدريتشE10505
2-فينوكسي إيثانولسيجما ألدريتش77699
طبق بتري 35 × 15 ممطبق بترو 351008
فالكون 60 × 15 ممطبق بترولي351007
Falcon 100 × 25 ممBD Falcon351013
5.75 بوصة ماصات زجاجية بوروشولاتفيشر
35 مم زجاج علوي زجاجي سفلي (زجاج: 0.085-0.115 مم)MatTek CorporationD35-20-0-TOP
Superfrost / Plus شرائح مجهرفيشربراند12-550-15
أغطية زجاجيةخدمات المجهر الإلكتروني72191-75
أغطية زجاجية وارنرإنسترومنتسCS-18R15
Phifer Phiferglass شاشة الحشرات الفحم - 48 "هوم ديبوت
الشحوم عالية الفراغداو كورنينج
ماصة Microloader نصائح 20 & مايكرو ؛ لمقص Eppendorf930001007
Fine Scissors -العلوم الدقيقةحادة 14037-10
3 مل حقنة Luer-Lok & trade يمكن التخلص منها   ؛BD309657
60 مل حقنة Luer-Lok & trade يمكن التخلص منهاBD309653
23 جرام إبر حقنةBD305145
Dumont # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11295-00
LabDoctor Mini Dry BathMidSci
Discovery.V12 المجهر المركب Zeiss
Plan Apo S 3.5X الهدفZeiss
AxioCam MRm زايس
Axiovision البرمجيات ، الإصدار 4.8.2SP1 (12-2011)Zeiss
BDBD أدوات بزاوية < td colspan = "4" >

المراجع

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115(2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766(2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240(2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة