يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال

8.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53214

⸱

ديسمبر 4, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University School of Medicine, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تنتقل microRNAs البشرية من كريات الدم الحمراء المضيفة إلى طفيليات المتصورة المنجلية. هنا ، يتم وصف التقنيات المستخدمة لنقل microRNAs الاصطناعية إلى كريات الدم الحمراء المضيفة وعزل جميع الحمض النووي الريبي من P. falciparum. بالإضافة إلى ذلك ، ستفصل هذه الورقة طريقة لعزل متعدد الجمرات في المتصورة المنجلية لتحديد شغل الريبوسومات وإمكانات الترجمة لنصوص الطفيليات.

الملخص

التباين الوراثي المسؤول عن أليل المنجلي (HBS) يمكن الكريات الحمراء أن تقاوم العدوى عن طريق طفيلي الملاريا، P. المنجلية. الأساس الجزيئي لهذه المقاومة، والذي يعرف لتكون سياقاتها، لا تزال غير مفهومة. وجدت الدراسات الحديثة أن التعبير التفاضلية من microRNAs كرات الدم الحمراء، translocated مرة واحدة في طفيليات الملاريا، تؤثر على كل من تنظيم الجينات والنمو الطفيلي. وقد أظهرت هذه miRNAs في وقت لاحق لمنع الترجمة مرنا من خلال تشكيل نسخة RNA خيالية عبر 5 "الانصهار RNA مع مجموعات فرعية سرية للمن mRNAs الطفيلي. هنا، والتقنيات التي استخدمت لدراسة دور وظيفي والمفترضة آلية microRNAs كرات الدم الحمراء الكامنة على تنظيم الجينات وإمكانات متعدية من P. المنجلية، بما في ذلك ترنسفكأيشن من microRNAs الاصطناعية تعديل في كريات الدم الحمراء المضيف، سيتم تفصيله. وأخيرا، يتم استخدام طريقة polysome التدرج لتحديد مدى هيئة تنظيم الاتصالاتnslation من هذه النصوص. معا، سمحت هذه التقنيات لنا لإثبات أن مستويات dysregulated من microRNAs كرات الدم الحمراء تساهم في مقاومة الملاريا خلايا كريات الدم الحمراء المنجلية الجوهرية.

المقدمة

الملاريا، التي تسببها الطفيليات apicomplexan من جنس المتصورة، هو مرض طفيلي البشري الأكثر شيوعا، وتصيب عالميا ما يقرب من 200 مليون شخص كل عام، وتسبب حوالي 600،000 حالة وفاة 1. من الأنواع المتصورة الخمسة التي تصيب البشر، والأكثر صلة الأمراض التي تصيب البشر هي P. المنجلية وP. النشيطة، ويرجع ذلك إلى توزيع واسعة النطاق واحتمال حصول مضاعفات حادة بالملاريا. دورة حياة طفيل الملاريا تتطلب إصابة كل من البعوض والبشر. عندما تلدغ بعوضة مصابة الإنسان، والطفيليات السفر عبر مجرى الدم إلى الكبد، حيث تحدث في الجولة الأولى من النسخ المتماثل. بعد merozoites تمزق من الكبدية المضيفة، فإنها تصيب خلايا الدم الحمراء القريبة، بدء النسخ المتماثل إما اللاجنسي والجنسي. المرحلة اجنسي النسخ المتماثل، الذي يستمر 48 ساعة في P. المنجلية، هو محور هذه الدراسة لأنه على حد سواء مصدر معظم المالأعراض الأغنية ولخص بسهولة في المختبر.

في حين أن عددا من المبادرات الصحية العامة، بما في ذلك تحسين العلاجات المضادة للملاريا، قد قللت إلى حد ما من عبء الملاريا على الصعيد العالمي، واستمرار ظهور الطفيليات المقاومة للأدوية يمثل مشكلة لجهود مكافحة الملاريا. منطقة واحدة والتي قد تشير إلى طرق علاجية جديدة هي دراسة عن كيفية مختلف المتغيرات الجينية تمنح المقاومة للملاريا. في المناطق التي تتوطن فيها الملاريا، ومجموعة متنوعة من الأشكال الكريات الحمراء شائعة جدا 2،3. هذه الطفرات، مع خلية المنجل يجري لعل أبرز، غالبا ما ترتبط مع المقاومة كبيرة لظهور أعراض الإصابة بالملاريا 4. وغير مفهومة الآليات الكامنة التي كانت تسبب الكريات الحمراء أن تقاوم الإصابة بالملاريا. الكريات الحمراء مطفول مع الطفرات الهيموجلوبين تخضع لتعزيز البلعمة من خلال تعزيز صلابة الخلوية والجفاف، والتيويرتبط مع غزو بنسبة P. المتصورات المنجلية 5. يؤثر على أليل HBC أيضا تعبير البروتين على سطح كرات الدم الحمراء ومع إعادة تشكيل الهيكل الخلوي، مما يزيد من إعاقة التنمية الطفيلي 6،7. وأخيرا، P. المنجلية ينمو بشكل سيئ داخل المنجل متماثل (HBSS) الكريات الحمراء 8،9 في المختبر، مما يشير إلى العوامل الكريات الحمراء الجوهرية للمقاومة الملاريا. ومع ذلك، في حين أن جميع هذه الآليات يبدو أن تلعب دورا، لكنها لا تفسر تماما الآليات وراء مقاومة الخلايا المنجلية للملاريا.

مجموعة واحدة محتمل من العوامل الكريات الحمراء التي لا تزال غير مفهومة هو مجموعة كبيرة من ميرنا موجودة في كرات الدم الحمراء الناضجة. MicroRNAs هي الرنا غير المكودة صغيرة، 19-25 الإقليم الشمالي في الحجم، الذي توسط الترجمة و / أو استقرار من mRNAs الهدف عن طريق الاقتران قاعدة داخل 'UTR 3. قد تورطت أنهم في السيطرة على الاستجابات المناعية الثدييات، بما في ذلك قمع سو تكاثر الفيروس 10، وعرضت للتشاور المقاومة للفيروسات في النباتات كما تم أظهروا لتنظيم العديد من العمليات الكريات الحمراء، بما في ذلك الكريات الحمر 11،12 واستقلاب الحديد 13. حددت دراسات سابقة السكان وفيرة ومتنوعة من miRNAs الكريات الحمراء، الذي التعبير تم تغيير بشكل كبير في HBSS الكريات الحمراء 14،15. منذ كريات الدم الحمراء الناضجة تفتقر النسخ النشط والترجمة، ودور وظيفي من هذه miRNAs كرات الدم الحمراء لا يزال غير واضح. كما يحدث تبادل مادي كبير بين الخلية المضيفة وP. المنجلية خلال دورة التنموية داخل الكريات الحمر (IDC) 16، وكانت هناك تكهنات بأن الملف الشخصي ميرنا غيرت داخل كريات الدم الحمراء HBS قد تسهم بشكل مباشر في مقاومة الملاريا الخلايا الذاتية.

هذه الدراسات أدى في النهاية إلى تطوير خط أنابيب لعزل وتحديد وظيفيا دراسة دور ميرنا البشري داخل مالجناحية الطفيلي، P. المنجلية، التي أشارت إلى أن تلك المضيف / miRNAs الإنسان في نهاية المطاف تساهميا فتيل ثم تقمع translationally النصوص الطفيلي مرنا 17. قدمت هذا مثال من أول عبر أنواع النصوص خيالية شكلتها العابر للالربط وتورط أن هذا الانصهار ميرنا-مرنا يمكن أن تحدث في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الطفيليات الأخرى. كل من mRNAs المثقبيات هي العابرة تقسم مع لصق زعيم (SL) لتنظيم الفصل بين النصوص متعدد المقارين 18. منذ P. المنجلية يفتقر orthologs لالمقامر / منذ 19،20، فمن الممكن أن miRNAs كرات الدم الحمراء يخطفون الآلات SL مماثلة في P. المنجلية للاندماج الجينات المستهدفة. الدراسات التي أجريت مؤخرا في P. المنجلية يكون في الواقع أشارت إلى وجود 5 'تسلسل زعيم لصق 21. تفاصيل هذه الدراسة الأساليب التي أدت إلى اكتشاف للطفيليات الإنسان ميرنا-مرنا النصوص الانصهار، بما في ذلك transcriptomic وtranslaتقنيات تنظيم tional. الأهداف العامة لهذه الأساليب هي للتحقيق في آثار الرنا صغيرة في تنظيم الجينات، الظواهر والترجمة إمكانات P. النصوص المنجلية.

تحديد الأولي من النصوص خيالية-الطفيليات البشرية الاعتماد على استخدام تقنيات تحليل الحمض النووي الريبي، مثل الوقت الحقيقي PCR، والتسلسل Transcriptome على وEST القبض على المكتبة، والتي شملت كل من إجمالي والصغيرة الرنا، بدلا من استخدام التقنيات التي معزولة فقط الرنا الصغيرة. عزل جميع RNA معا في تجمع واحد كبير، وليس بشكل منفصل، يسمح بتحديد كل من الرنا صغيرة الإنسان translocated في الطفيليات وكذلك وجود هذه تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة كجزء من سلسلة أكبر. هذا ثم يطلب تحليلا للدولة ترجمة هذه من mRNAs الانصهار لتحديد العواقب الوظيفية لهذه اندماج.

في حين جهود واسعة النطاق على توصيف الجينوم والطفيليوأضافت د Transcriptome على لفهم البيولوجيا الطفيلي 22-25، كما هو معروف أقل بكثير عن تنظيم متعدية من Transcriptome على مرنا عبر دورة حياة P. المنجلية 26. هذا الفهم المحدود للبروتيوم الطفيلي أعاق على حد سواء فهم البيولوجيا الطفيلي والقدرة على تحديد أهداف جديدة للجيل القادم من العلاجات المضادة للملاريا. وقد استمرت هذه الفجوة في فهم بيولوجيا الخلية الطفيلي يرجع إلى حد كبير إلى عدم وجود تقنيات كافية للتحقيق في تنظيم متعدية في P. المنجلية. ووصفت ورقة واحدة الأخيرة استخدام البصمة الريباسي من P. المنجلية لتحديد حالة الترجمة العالمي 21. واحدة قياس راسخة من إمكانات متعدية من النصوص هو عدد ريبوسوم المرتبطة يحددها polysome التنميط. ومع ذلك، عندما يتم تطبيق هذه التقنية لP. المنجلية </ م>، فإنه غير قادر على استعادة معظم polysomes ويلتقط الغالب monosomes. في الآونة الأخيرة، عدة مجموعات 27،28 وقد الأمثل P. تقنيات polysome المنجلية من قبل الناشر لكرات الدم الحمراء والطفيليات في وقت واحد للحفاظ على polysomes وتميز الإشغال الريباسي وإمكانات متعدية هذه طفيليات الملاريا خلال تطوير اللاجنسي في المضيف خلايا الدم الحمراء (28).

بشكل جماعي، وهذه الأساليب تدل على أن الانصهار الملحوظ من الإنسان ميرنا والطفيليات من mRNAs ينظم ترجمة البروتين الطفيلي تلك من mRNAs الانصهار، والذي تجلى باستخدام أساليب ذكرت سابقا 27، و هي المحدد الرئيسي لمقاومة الملاريا في مهايئات الناقل المضيف وHBSS الكريات الحمراء (17). أن هذه الأساليب تكون مفيدة في أي نظام تتطلع لتحديد وظيفيا استكشاف الأحداث RNA الربط، سواء كانت تلك الرنا الانصهار ضمن P. المنجلية أو أنظمة حقيقيات النوى الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1: عزل الرنا صغيرة الحجم من P. المنجلية خلال IDC

  1. الحصول على طفيليات الملاريا في الثقافة اللاجنسي 29.
    ملاحظة: تختلف حجم الثقافة المطلوبة استنادا إلى التطبيق المطلوب. ومع ذلك، ثقافة 10 مل في 3-5٪ الطفيل و 5٪ الهيماتوكريت توفر RNA وافرة في الوقت الحقيقي PCR (RT-PCR). تم تحسين تقنية في البداية للثقافات غير متزامن، ولكن عندما يتم المطلوب نقطة زمنية محددة خلال دورة العدوى والطفيليات مرحلة الحلقة يمكن أن تكون متزامنة من قبل تزامن السوربيتول في موعد لا يتجاوز 10-12 ساعة بعد الغزو. وينبغي تكرار التزامن بعد دورة واحدة (حوالي 48 ساعة) 29.
  2. الخلايا المصابة تجمع معا (~ 5 × 10 9 كرات الدم الحمراء في الطفيل 3-5٪) وملء PBS الباردة إلى الجزء العلوي من الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق من دون فرامل لتكوير خلايا الدم الحمراء.
  3. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف بعناية باستخدام ماصة الشفط، وتعلقإلى فراغ، لأن بيليه كريات الدم الحمراء من السهل طرد. يغسل بيليه مرة أخرى مع 1X PBS الباردة.
  4. Resuspend بيليه خلية في البارد 0.15٪ سابونين (في برنامج تلفزيوني 1X) ومكان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. خلايا الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 12 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف (والتي سوف تكون حمراء داكنة اللون) و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني الباردة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    ملاحظة: من أجل ضمان أن microRNAs الحالية كانت عاكسة من microRNAs داخل الطفيليات، وليس التلوث كريات الدم الحمراء، تم اختبار عدد من الشروط العزلة الطفيلي: 1) سابونين تحلل، 2) سابونين تحلل جنبا إلى جنب مع العلاج RNaseA من miRNAs الخلية المضيفة و3 ) ميثيل-بيتا-سيكلودكسترين العلاج لإزالة الطفيليات من كرات الدم الحمراء المضيف. أعطت كل العلاجات نتائج مماثلة.
  6. ليز بيليه الطفيلي معزولة باستخدام أوصى 600 ميكرولتر من تحلل العازلة. هذا الحجم من تحلل العازلة كافية للثقافات يصل إلى ~ 30 مل في 2٪ الهيماتوكريت و 5٪ الطفيل.
    ملاحظة: للحصول على الثقافات الطفيلي أكبر، ويمكن زيادة هذا الحجم. من المهم لضمان تحلل كامل للبيليه الطفيلي من قبل vortexing شامل ل1 دقيقة على الأقل. أيضا، لسهولة استخراج والعينات هي lysed يمكن نقلها إلى أنبوب 1.7 مل microcentrifuge ل.
  7. إضافة 60 ميكرولتر، أو 10/01 حجم المخزن المؤقت تحلل المستخدمة في الخطوة 6 من جناسة المضافة (خلات 2 M الصوديوم، ودرجة الحموضة 4).
  8. ترك العينات في الثلج لمدة 10 دقيقة.
  9. إضافة 600 ميكرولتر، أو حجم مساو لكمية من تحلل العازلة وأضاف في الخطوة 6، حامض الفينول choloroform لكل عينة ودوامة لمدة 1 دقيقة.
  10. فصل المراحل المائية والعضوية بواسطة الطرد المركزي العينات في 10000 x ج لمدة 5 دقائق. هذا الدوران هو أطول من ذلك الذي اقترحته عدة لضمان أن جميع الهيموجلوبين / هيموزوين في المرحلة العضوية.
  11. جمع العليا (مائي) طبقة ونقلها إلى أنبوب جديد. كرر الخطوات من 9 و 10 إذا كانت المرحلة المائية بيضاء أو (على الأرجح) في اللون البني، الأمر الذي يوحي للمحترفينتلوث البروتين.
  12. تحديد حجم طاف الناتجة بواسطة ماصة ثم قم بإضافة 1.25 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ (~ 800 ميكرولتر) وتخلط بواسطة قلب من 1.7 مل أنبوب microcentrifuge 5 مرات.
  13. تمرير كل عينة من خلال ملزم RNA خرطوشة فلتر المقدمة (تتوفر عدة مختلفة منها تجاريا) إما عن طريق الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة أو باستخدام مشعب فراغ.
  14. غسل فلتر خرطوشة مع 700 ميكرولتر من ميرنا غسل العازلة 1 يستخدم microcentrifuge ل، والغزل في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  15. غسل فلتر خرطوشة مع 500 ميكرولتر غسل العازلة 2/3 مرتين من قبل الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
  16. أزل RNA مع 100 المياه DEPC ميكرولتر، والتي تم تسخينها إلى 95 درجة مئوية، في اثنين من يغسل من 50 ميكرولتر، الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة لكل منهما. قياس تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 260nm.
    ملاحظة: هلام RNA (إما TBE اليوريا مادة الأكريلاميد أو تغيير طبيعة هلام الفورمالديهايد الاغاروز) يمكن بالبريد المستخدمة لتقييم حجم التوزيع من الرنا المعزولة.
    ملاحظة: هذا RNA هو مناسبة لتحليلها من قبل ميكروأري، RNA التسلسل، وصمة عار الشمالية وفحص حماية ريبونوكلياز.

2: الكميات من الرنا صغيرة الحجم من P. المنجلية خلال IDC

  1. تحديد تركيز عينات فردية معزولة في الخطوة 1 باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر.
  2. تولد في الوقت الحقيقي الاشعال PCR للأنواع RNA المطلوب. لميرنا وحده، وكنا ولم يضف المقايسات ميرنا QPCR، في حين أن من mRNAs أو الانصهار ميرنا-مرنا قمنا بتصميم الاشعال لSYBR الأخضر. لالرنا الانصهار، كان التمهيدي إلى الأمام تسلسل ميرنا نفسها (مير-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT)، في حين كان العكس جينة محددة التمهيدي ~ 100 شركة بريتيش بتروليوم المصب من ميرنا في تسلسل مرنا (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT).
  3. جعل كدنا] من عينات الحمض النووي الريبي باستخدام إما التمهيدي القاسي لmiRNAs (استخدم 20-40 نانوغرام من RNA) وحده أو hexamers عشوائي لمرنا و / أو ميرناالأنواع -mRNA الانصهار (باستخدام 1 ميكروغرام من RNA). مزيج RNA والاشعال لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إضافة مزيج الناسخ العكسي (0.5 ميكرولتر عكس الناسخ، 0.5 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 1 dNTPs ميكرولتر (2.5 ملم لكل منهما)، 4 ميكرولتر 5X العازلة، 2 ميكرولتر 0.1M DTT، 1 ميكرولتر H 2 O).
    1. عينات تعمل على thermocycler قادرة على اكتشاف أي تحقيقات SYBR الخضراء أو TAQMAN. تم تشغيل SYBR الأخضر الكمي PCR 30 لجينات معينة باعتبارها خطوة 3 PCR، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وأدنى التمهيدي درجة الحرارة الصلب ناقص 5 درجات مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، لمدة 40 دورات، وذلك باستخدام SYBR التجاري الرئيسي مزيج الأخضر. تم تشغيل ميرنا الوقت الحقيقي PCR باعتباره من خطوتين PCR، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 40 دورات.
    2. تحديد فحوصات باستخدام طريقة ΔΔCt وتطبيع لهم ضد أي رب GTPase (PF08_0110) أو 18S الريباسي 31.

3: مقدمةمن الرنا الصغيرة إلى الملاريا طفيليات

  1. بيليه 300 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء في ترنسفكأيشن (250 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء، ما يقرب من 1.5 × 10 9 خلايا، وسوف تستخدم في نهاية المطاف) في وسائل الإعلام الملاريا الكامل بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق على الفرامل 1.
  2. غسل الكريات الحمراء مرتين مع RPMI وresuspend في cytomix كاملة (120 ملي بوكل، 0.15 ملي CaCl 2 و 10 ملي K 2 هبو 4 / KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.6 و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6، 2 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 7.6. 5 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة تعديلها مع KOH) في 50٪ الهيماتوكريت بعد الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق على الفرامل 1.
  3. نقل الخلايا إلى 0.2 سم كفيت electroporation.
  4. إضافة 10 ميكروغرام، أو مناسبة كمية من [أليغنوكليوتيد الاصطناعية المخصصة للcuvettes و resuspend الثقافات.
  5. ضبط electroporator إلى 310 V / 950 μF وتقديم النبض إلى كل كفيت.
  6. Resuspend و300 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء داخل كفيت في مرحلة ما قبل تحسنت سوء الكاملوسائل الإعلام والأغنية لوحة منها في 24 لوحات جيدة واحتضان عند 37 درجة مئوية في وعاء محكم مع مزيج غازات الدم الملاريا (3٪ O 2، 5٪ CO 2).
  7. بعد 4 ساعات، ويصيب كرات الدم الحمراء مع transfected النواشط أواخر متزامنة إلى الطفيل النهائي تقريبي من 1٪.
  8. إضافة كرات الدم الحمراء transfected طازجة كل 4-6 أيام على الثقافات المصابين وتحديد الطفيل٪ بحلول FACS باستخدام يويو-1 تلوين، كما هو مبين في الفقرة 4.

4: تحديد كرات الدم الحمراء microRNAs تأثير على الطفيلي معدل الاصابة

  1. أخذ 100 ميكرولتر من ثقافة معلق بواسطة micropipettor ومكان في أنبوب 1.7 مل microcentrifuge ل. يغسل مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge الطاولة بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. بيليه resuspend في 1 مل من 0.025٪ غلوتارالدهيد. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في RT.
    ملاحظة: عينات يمكن تخزينها هنا لعدة أسابيع في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، بيليه المصاب RBCS بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  3. بيليه resuspend في 1 مل من 0.015٪ سابونين. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إصابة بيليه كرات الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. Repeat.4.3. Resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 1 ميكرولتر (1،000X) وصمة عار DNA.
  4. تحديد درجات الطفيل على تدفق عداد الكريات، في 488 نانومتر الإثارة و~ 530 نانومتر (FL-1) الانبعاثات.
  5. أولا، بوابة قياس التدفق الخلوي على أساس FSC وSSC للتركيز على كرات الدم الحمراء. ثم قياس درجات الطفيل (كرات الدم الحمراء المصابة) في RBC بوابات كتبها مضان في القناة FL-1.
    ملاحظة: لاحقة الطفيليات المرحلة هي 10X أكثر الفلورسنت من الطفيليات مرحلة سابقة، و~ 100X فوق كرات الدم الحمراء غير المصابة. أيضا، وجمع على سرعة منخفضة يميل للحد من الضوضاء. وأخيرا، فقد تم مقارنة هذا النهج ل3-H هيبوزانتين التأسيس وتلطيخ بالغيمزا، على حد سواء كما ذكرت سابقا 13، وجميع التقنيات غافالبريد نتائج مماثلة.

5: البيوتين وضع العلامات وشطف من ميرنا-مرنا فيوجن المنتجات

  1. من أجل مباشرة أليغنوكليوتيد الاصطناعية المخصصة RNA مع desthiobiotin (DB-) مرتبطة تساهميا إلى نهاية 5 '.
  2. Transfect كرات الدم الحمراء غير المصابة مع Desthiobiotin مترافق (DB-) ميرنا ومعدلة ميرنا (المراقبة السلبية)، كما هو مبين في الخطوة 3.
  3. يصيب كرات الدم الحمراء مع transfected P. المنجلية الطفيليات إلى الطفيل تبدأ من 0.5٪ (الخطوة 1.1).
  4. استخراج الحمض النووي الريبي الطفيلي 4 أيام (96 ساعة) في وقت لاحق كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.
  5. احتضان 10 ميكروغرام من الطفيليات RNA مع 50 ميكرولتر معبأة حبات streptavidin وأضاف عبر micropipette، وتناوب على محور دوار أنبوب microcentrifuge لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  6. بيليه الخرز في 800 x ج لمدة 30 ثانية، ويغسل مع 20 ملي بوكل و1/1000 ريبونوكلياز المانع.
  7. أزل الرنا من الخرز المنافسة مع 2 مم البيوتين ومع 200 ميكرولتر العازلة RNA القبض على شطف (20 ملي بوكل، 1/1، 000 ريبونوكلياز المانع و 2 ملي البيوتين) في 4 درجة مئوية خلال الليل مع التناوب.
  8. تحديد درجة تخصيب أشار P. النصوص المنجلية باستخدام SYBR الأخضر QRT-PCR، والرنا الميكروي تخصيب (مراقبة إيجابية) من خلال TAQMAN QPCR كما هو مبين في الخطوة 2.

6: فصل Polysome تحديد الريباسي إشغال P. المنجلية

  1. وضع 5 مل من 15٪ محلول السكروز (400 ملي خلات البوتاسيوم، 25 ملي HEPES البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.2، 15 ملي خلات المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر سيكلوهيكسيميد، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF، 40 U / مل ريبونوكلياز المانع، و 15٪ سكروز ) إلى نابذة أنبوب SW41 (14 × 89 ملم).
  2. باستخدام حقنة 5 مل، إضافة 5 مل من 50٪ محلول السكروز (400 ملي خلات البوتاسيوم، 25 ملي HEPES البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.2، 15 ملي خلات المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر سيكلوهيكسيميد، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF، 40 U / مل ريبونوكلياز المانع، و 50٪ سكروز) تحت السكروز 15٪ باستخدام إبرة الصلب الطويلة، ثم قم بإزالة الإبرة.
    3. ختم الجزء العلوي من أنبوب التدرج مع parafilm، إمالة أنبوب ببطء على جانبها، في وضع مستقر لمنع المتداول، لذلك هو الكذب أفقيا على سطح الطاولة. الحفاظ على أنبوب على جانبها لا يقل عن 2 ساعة. في الوقت الذي تنتظر، ابدأ بالخطوة 6.5.
  3. بعد 2 ساعة، والميل ببطء الأنبوب مرة أخرى في وضع مستقيم ونقل أنبوب إلى جليد، والسماح لتبرد لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تحميل عينة (الخطوة 14).
  4. جمع ما يكفي من المتصورة ثقافة مرحلة الدم -infected لتوليد 100-500 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، أو ما يقرب من 100 مل الثقافة متزامنة في 3-5٪ الطفيل. إضافة 1/10 عشر أن حجم مستنبت يحتوي 10X (2 ملم) سيكلوهيكسيميد (فروج)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    1. ثقافات بيليه بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 7 دقائق مع أجهزة الطرد المركزي (الفرامل 1)، ثم يغسل مرتين مع درجة حرارة الغرفة 1X PBS تحتوي على 200 ميكرومتر فروج. Resuspend والثقافات الطفيلي في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 200 ميكرومتر فروج وتخزينها على الجليد.
  5. تقدير حجم الكرية RBC. إضافة تحلل العازلة (400 ملي خلات البوتاسيوم، 25 ملي HEPES البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.2، 15 ملي خلات المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر فروج، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF، 40 U / مل ريبونوكلياز المانع، 1٪ (ت / ت) IGEPAL CA -630، و 0.5٪ (ث / ت) DOC) إلى بيليه RBC إلى الحجم النهائي من 4.25 مل. احتضان المحللة في 4 ° C لمدة 10 دقيقة في حين تناوب.
  6. نقل المحللة إلى أنابيب microcentrifuge، ثم الطرد المركزي العينات في microcentrifuge في 16000 x ج و 4 ° C لمدة 10 دقيقة.
  7. إعداد وسائد السكروز بواسطة pipetting 1.25 مل من البرد 0.5 M الحل سادة السكروز (400 ملي خلات البوتاسيوم، 25 ملي HEPES البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.2، 15 ملي خلات المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر سيكلوهيكسيميد، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF، 40 U / مل ريبونوكلياز المانع، و 0.5 M السكروز) إلى نابذة أنبوب SW55 (13 × 51 ملم).
  8. طبقة بعناية 3.75 مل من طاف المحللة (من الخطوة 7) على رأس وسادة السكروز باستخدام حقنة والصغيرة (~ 27) إبرة قياس. ستورالبريد المحللة المتبقية (~ 500 ميكرولتر) في -80 ° C لاستخراج مجموع مستويات RNA، كما هو مبين في القسم 1.
  9. تحميل العينات إلى الدوار نابذة، قبل المبردة إلى 4 ° C، التي يمكن أن تعقد 13.2 مل أنابيب. الطرد المركزي العينات في 366،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 146 دقيقة.
  10. باستخدام ماصة، ونقل طاف في أنبوب 15ML المخروطية. تخزين طاف في -80 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي من حرة (غير منضم من قبل ريبوسوم) الرنا.
  11. resuspend الكرية الريبوسوم في 500 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق الريبوسوم (400 ملي خلات البوتاسيوم، 25 ملي HEPES البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.2، 15 ملي خلات المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر سيكلوهيكسيميد، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF، و 40 U / مل ريبونوكلياز المانع) قبل pipetting لمدة 5 دقائق.
  12. الطرد المركزي العينات في microcentrifuge في 16000 x ج و 4   ° C لمدة 10 دقيقة.
  13. مع الحفاظ على التدرج من الخطوة رقم 4 على الجليد، وإزالة Parafilm، ثم طبقة بعناية تعليق الريبوسوم على رأس باليود التدرجنانوغرام حقنة والصغيرة (~ 27) إبرة قياس.
  14. تحميل الأنبوب في نابذة فائقة السرعة الدوار قبل المبردة وأجهزة الطرد المركزي التدرجات تحميلها في 200،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 180 دقيقة. عندما يتم الانتهاء من زيادة ونقصان، طرد تخزين التدرجات في 4 ° C حتى جاهزة للتحميل على المجزئ.
  15. تحميل أنبوب نابذة فارغة في المجزئ التدرج (هذا يمكن أن يكون أنبوب المستخدمة في تشغيل السابق)، ثم يغسل بالماء ريبونوكلياز خالية لمدة 5 دقائق في 100 × 10 السرعة.
  16. أثناء غسل في الخطوة 6.16، تعيين حساسية كاشف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. A حساسية انطلاق جيدة هي 0.2، ولكن هذا قد يكون من الضروري تعديل في يدير في وقت لاحق بناء على إشارة A 254 (التي تختلف بناء على عدد الطفيليات، وما إلى ذلك).
  17. مرة واحدة يتم تعيين حساسية كاشف، تعيين إشارة خط الأساس إلى الصفر بينما المياه تتدفق من خلال كاشف.
  18. بعد غسل جامع جزء، عكس تدفق السوائل حتى خطوط فارغة ثم عينياوفه أنبوب نابذة فارغة.
  19. تشغيل 60٪ محلول السكروز من خلال المجزئ حتى خروجها من الجهاز إبرة.
  20. أدخل الأنبوب الذي يحتوي على التدرج الأول في الجزء العلوي من غرفة التحميل وتشديد الختم، مع الحرص على عدم الإفراط في تشديد. ثم، يخترق قاع الأنبوب مع الإبرة.
  21. إعادة تعيين سرعة تدفق السائل إلى 12.5 × 10 (التي يسيطر عليها التحكم مقبض سرعة تدفق على الجزء الأمامي من المضخة)، ثم قم بتعيين جامع جزء الآلي لجمع 18 كسور ثانية (~ 330 ميكرولتر / جزء) في أنابيب microcentrifuge.
  22. بدء الأمام تدفق محلول السكروز 60٪.
  23. عندما يسقط أول قطرة من الحل التدرج في أنبوب microcentrifuge، والبدء فورا كل من جمع جزء وتسجيلا حيا للإشارة A 254.
  24. مرة واحدة لوحظ انخفاض حاد في إشارة A 254، المقابلة لواجهة بين 50٪ و 60٪ على حلول السكروز، ووقف كل من تدفق السوائل وA 254 تسجيل.
  25. تخزين الكسور التدرج في -80   ° C لاستخدامها لاحقا.
  26. عكس تدفق السوائل في 100 × 10 السرعة حتى يصب محلول السكروز 60٪ من الأنبوب نابذة فائقة السرعة.
  27. إذا كان هناك تدرجات إضافية ليجزئ، وإزالة أنبوب نابذة فارغة من غرفة التحميل وإعادة تشغيل من الخطوة 6.21. إذا تم الانتهاء من جميع العينات، وغسل الجهاز كما كان يؤديها في الخطوات 6.16 و 6.19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التنميط العالمي من الرنا الميكروي البشري في P. المنجلية

استخدمت التقنيات المعروضة هنا لاستخراج microRNAs من الطفيليات في مجموعة متنوعة من الظروف. شيء واحد هو أن نلاحظ أن أجريت عمليات الاستخراج RNA لكرات الدم الحمراء غير المصابة كما هو مبين في 32، والتي غالبا ما كان بمثابة نقطة مرجعية للبيانات الرنا الميكروي المقدمة في كل من هذه المادة والدراسة الأصلية 29. أثبتت تلك الدراسات السابقة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مسح ميزانية الأسرة هي واحدة من المتغيرات الهيموجلوبين الأكثر شيوعا في المناطق الموبوءة الملاريا، إلى حد كبير لأن ذلك يوفر الحماية ضد الملاريا الحادة التي تسببها P. المنجلية. التقنيات اللازمة لتوصيف دور الرنا الميكروي البشري في تنظيم الجينات من P. وترد تفاصيل المنجلية طوال هذه المخطوطة. عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي مجموع في مثل هذه الطريقة لتشمل جميع الرنا صغيرة، وقبل تنفيذ إجراء الطفيلي تحلل بسيط نسبيا، وكانت قادرة على أن يتم تحديدها من خلال مجموع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإعلان.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة Doris Duke الخيرية ، وصندوق Burroughs Wellcome Fund ، و NIH R21DK080994 ، وصندوق المشروع التجريبي ل Duke Chancellor ، ومؤسسة روش لأبحاث فقر الدم ، ومؤسسة Bill and Melinda Gates Foundation. يتم دعم GL من قبل Duke's UPGG و NIH (Grant # 5R01AI090141-03) و KAW من قبل برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية > الكواشف - يجب أن تكون جميع الكواشف خالية من RNAse.< / قوي>
إيثيل بيروكربوناتSigmaD5758DEPC
المياه المعالجة DEPC (انظر إعداد الكاشف)
Yoyo-1 صبغة فلورسنت DNAThermo Fisher
Gene Pulser II المثقور الكهربائيBio-Rad
0.2 سم كوفيتات
4 م أسيتات البوتاسيومMallinckrodt6700
2 م هيبس البوتاسيومSigmaH0527درجة الحموضة 7.2
1 م أسيتات المغنيسيومSigmaM-2545
1 M dithiothreitolResearch Products InternationalD11000DTT
100 mM فينيل ميثيل سلفونات فلوريدسيجماP7626PMSF ، مذاب في الأيزوبروبانول
10٪ (v / v) Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
10٪ (وزن / حجم) منقوص الأكسجين الصوديومSigmaD-6750DOC
CycloheximideSigmaC-7698CHX
السكروزMallinckrodt8360-04
RNAseOUT (Invitrogen ، cat. no. 100000840)Invitrogen100000840
RPMI-1640 مع L/ L-glutamineCellgro10-040-CV
10٪ AlbuMAX IInvitrogen11020-039w / v في الماء المعقم
GentamicinGibco15750-060
مكمل HT (100x) (Invitrogen ، cat. رقم 11067030) 45
٪ (وزن / حجم) السكروز (سيجما ، رقم القط G8769)
1 M HEPES buffer (Gibco ، cat. no. 15630-080)
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ سيلجرو ، قطة. رقم 2109310CV)
قارورة فلتر فراغ Corning 500 مل (VWR ، cat. رقم 430769) شرائح
زجاجية (VWR ، cat. no. 48311-702) صبغة
Giemsa (50X) (VWR ، رقم القط m708-01) طقم
عزل mirVana miRNA (Ambion ، ThermoFisher Scientific).
5 'ميرنا ناضجة مترافقة مع البيوتين (يختلف التسلسل حسب الميرا المرسال الفائد) (دارماكون) مسحوق
البيوتين (سيجما ألدريتش) 1
م كلوريد
ستربتافيدين سيفاروز حبات عالية الأداء (GE Healthcare) مخزن
مؤقت لإعادة تعليق الريبوسوم (انظر إعداد الكاشف)
المخزن المؤقت للتحلل (انظر إعداد الكاشف) محلول
تدرج السكروز بنسبة 15٪ (وزن / حجم) (انظر إعداد الكاشف) 50
٪ (وزن / حجم) محلول تدرج السكروز (انظر إعداد الكاشف) وسادة
سكروز 0.5 متر (انظر إعداد الكاشف) 60
٪ (وزن / حجم) محلول مطاردة السكروز (انظر إعداد الكاشف)
وسائط زراعة خلايا المتصورة (انظر إعداد الكاشف) المخزن
المؤقت للغسيل لالتقاط الحمض النووي الريبي (راجع إعداد الكاشف) المخزن
المؤقت لشطف الحمض النووي الريبي (راجع إعداد الكاشف)
<قوي>إعداد الكاشف
<قوي>الحلول
<قوي > وسط زراعة خلايا المتصورة < / قوي > 500
مل RPMI-1640 مع L-glutamine
0.5 مل جنتاميسين
5 مل مكمل
2.5 مل 45٪ جلوكوز
25 مل 10٪ AlbuMAX I
12.5 مل 1 M HEPES
فلتر معقم مع قارورة فلتر فراغ 0.2 مم.
<قوي > وسط زراعة خلايا المتصورة تحتوي على 10x CHX< / قوي >
نفس الوصفة مثل وسائط زراعة خلايا المتصورة أعلاه ، مع إضافة:
2 ملي مولار يتم تحضير وسائط سيكلوهيكسيميد
كالمعتاد ، ثم أضف CHX إلى التركيز النهائي 2 ملي مولار والتصفية.
يضاف <قوي > 1x PBS يحتوي على cycloheximide < / strong>
Cycloheximide طازجا إلى 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ملي مولار ، ويحتفظ به عند 4 O< / sup>C حتى الاستخدام.
<قوي > مخزن مؤقت لإعادة تعليق الريبوسوم < / قوي >
400 ملي أسيتات
25 ملي مولار هيبس البوتاسيوم ، درجة الحموضة 7.2
15 ملي أسيتات
200 ملي سيكلوهيكسيميد (إضافة طازجة)
1 ملي مولار DTT (أضف طازجا)
1 ملي مولار PMSF (إضافة طازجة)
40 وحدة / مل RNaseOUT (إضافة طازجة)
<قوي > مخزن مؤقت للتحلل < / قوي >
نفس الوصفة مثل المخزن المؤقت لإعادة تعليق الريبوسوم أعلاه ، مع إضافة:
1٪ (حجم / حجم) Igepal CA-630
0.5٪ (وزن / حجم) DOC
<محاليل قوية > سكروز < / قوي >
نفس الوصفة مثل المخزن المؤقت لإعادة تعليق الريبوسوم أعلاه ، مع إضافة كميات متفاوتة من السكروز:
15٪ (وزن / حجم) السكروز لصنع محلول
تدرج السكروز بنسبة 15٪50٪ (وزن / حجم) سكروز لصنع 50٪ محلول
0.5 متر سكروز لصنع وسادة
على النحو الوارد أعلاه ، يجب إضافة cycloheximide و DTT و PMSF و RNaseOUT طازجة.
يتطلب محلول مطاردة السكروز بنسبة 60٪ السكروز والماء فقط ، ولا توجد مكونات
60٪ (وزن / حجم) السكروز في المياه المعالجة DEPC لصنع 60٪ من محلول
السكروز <قوي > RNA Capture Wash Buffer < / strong>
20 mM & nbsp ؛ KCl
5 وحدة / مل Rnase Out (Invitrogen)
<قوي > RNA Capture Elution Buffer < / قوي >
نفس وصفة RNA Capture Wash Buffer ، مع إضافة:
2 ملي بيوتين
<قوي>المعدات< / قوي>
SW55 Ti دوار الطرد المركزي الفائق (بيكمان ، القط رقم 342194) دوار
الطرد المركزي الفائق SW41 Ti (بيكمان ، القط رقم 331362) فائق
الوضوح < سوب > TM< / sup> & frac12 ؛ × 2 بوصة (13 × 51 مم) أنابيب الطرد المركزي الفائق ل SW55 (بيكمان ، القط رقم 344057)
Polyallomer 9/16 × 3 ½ ؛ في (14 × 89 مم) أنابيب الطرد المركزي الفائق ل SW41 (بيكمان ، القط رقم 331372)
الطرد المركزي الفائق (بيكمان)
إبرة حقنة فولاذية حادة ، 4 بوصات ، 16 جم (ألدريتش ، القط رقم Z261378) حقنة
1 مل مع 27 جم & frac12 ؛ إبرة (بيكتون ديكنسون ، رقم القط 309623)
حقنة 5 مل (بيكتون ديكنسون ، القط رقم 309646)
جهاز دوار أنبوب
نظام تجزئة تدرج الكثافة المبرد
TracerDAQ (حوسبة القياس) جهاز
دوار Eppendorf A-4-81 (Eppendorf ، القط رقم 022638807)
ثنائي التثقيب الكهربائيالبوتاسيومHTالبوتاسيومالمغنيسيوممتدرج من السكروزسكروز 0.5 مترأخرى مطاردة L8-80M جهاز Parafilm ، جهاز طرد مركزي دقيق من طرف إلى طرف ، (Teledyne Isco ، cat. no. 69-3873-179) طرد مركزي Eppendorf 5810R

المراجع

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
  3. Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
  4. Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
  5. Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
  6. Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
  7. Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
  8. Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
  9. Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
  10. Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
  11. Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
  12. Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
  13. Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
  14. Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408(2013).
  15. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360(2008).
  16. Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
  17. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
  18. Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
  19. Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
  20. Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
  21. Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
  22. Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108(2012).
  23. Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
  24. Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5(2003).
  25. Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
  26. Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J. Jr., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
  27. Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
  28. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128(2013).
  29. LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
  30. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
  31. Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
  32. Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
  33. Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
  34. Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
  35. Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جزيئات ميكرو آر إن إيه في كريات الدم الحمراءتحليل ملفات البوليسوماتترانسفكشن الحمض النووي الريبوزيتحليل الحمض النووي الريبوزي الصغيرالكشف عن النسخ الاندماجيةدراسة تنظيم الجيناتآلية مقاومة الملارياطريقة إثراء الحمض النووي الريبوزي
طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.