نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلقى التمثيل الغذائي المضطرب للميتوكوندريا اهتماما متجددا لأنه يلعب دورا مسببا في مجموعة من الأمراض. يتطلب التحقيق في التعديلات في مسارات التمثيل الغذائي نموذجا يمكن من خلاله التحكم في العوامل الخارجية بشكل جيد ، مما يسمح بنتائج قابلة للتكرار وذات مغزى. تستخدم العديد من الدراسات نماذج خلوية محولة لهذه الأغراض. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة التمثيل الغذائي التي تحدث في العديد من خطوط الخلايا السرطانية قد تؤدي إلى متغيرات مربكة. لهذا السبب ، فإن الخلايا الأولية مرغوبة ، على الرغم من أن تحقيق الكتلة الحيوية الكافية لدراسات التمثيل الغذائي قد يكون أمرا صعبا. نوضح هنا أنه يمكن استخدام الصفائح الدموية البشرية كمنصة لإجراء دراسات التمثيل الغذائي بالاشتراك مع تحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة. هذا النهج قابل للقياس الكمي النسبي ووضع العلامات النظيرية لاستكشاف نشاط مسارات التمثيل الغذائي المحددة. إن توافر الصفائح الدموية من المتبرعين الأفراد أو من بنوك الدم يجعل هذا النظام النموذجي قابلا للتطبيق على الدراسات السريرية وممكنا لتوسيع نطاقه. هنا نستخدم الصفائح الدموية المعزولة لتأكيد التحولات الأيضية التعويضية المحددة مسبقا استجابة لعقد الروتينون المركب. وبشكل أكثر تحديدا ، يصاحب انخفاض تحلل السكر زيادة في أكسدة الأحماض الدهنية للحفاظ على مستويات أسيتيل CoA. تظهر نتائجنا أنه يمكن استخدام الصفائح الدموية كنموذج يسهل الوصول إليه وذي صلة طبيا للتحقيق في تأثيرات الكائنات الغريبة الحيوية على التمثيل الغذائي الخلوي.
المقدمة
وقد تورط استقلاب الميتوكوندريا المختلة وظيفيا في مجموعة واسعة من الأمراض بما فيها التنكس العصبي، والسرطان، وأمراض القلب والأوعية الدموية 30. على هذا النحو، وقد انصب جهد كبير على تميز عيوب التمثيل الغذائي التي تسهم في التسبب بالمرض. يعتبر السائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) المعيار الذهبي لتقدير حجم التحاليل من مصفوفات بيولوجية معقدة، وغالبا ما تستخدم للدراسات التمثيل الغذائي 8. لكن، وكما هو الحال مع الدراسات الطبية الحيوية، وتحقيق نموذج للوصول واضحة المعالم ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر في كثير من الأحيان هو التحدي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أخلاقيات الإعلان: جميع البروتوكولات المتعلقة بمعاملة العينات البشرية اتباع المبادئ التوجيهية من جامعة بنسلفانيا جنة أخلاقيات البحوث البشرية.
1. إعداد المخازن و100X الحلول المالية
- إعداد 1 لتر من العازلة قاعدة تايرود. الجمع بين 8.123 غرام كلوريد الصوديوم، 1.428 غرام NaHCO 3، 0،466 جم CaCl 2 ∙ 2 H 2 O، 0.224 غرام بوكل، و0.095 ز MgCl 2. ضبط الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع DDH 2 O. فلتر تعقيم العازلة قاعدة تايرود.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإثبات فائدة هذه المنهجية قمنا مستنسخة إمكانية تعميم سبق وصفها التكيف الأيضي التعويضية الناجمة عن التعرض لروتينون. وقد تم تحديد هذه النتيجة سابقا في نماذج ثقافة الخلية ويهدف هذا التحقيق لاختبار إذا حدث هذا التحول الأيضي أيضا في الصفائح الدموية، والتي هي عديم النواة وليس عرضة للنفس الاعمال الفنية التجريبية كثقافة الخلية. تم تنفيذ هذا العمل مع الصفائح القديمة لمدة 6 أيام، من مركز الحوادث بن، الذي كان قد تعتبر قديمة جدا للتسريب البشري، على الرغم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا أثبتنا فائدة الصفائح المعزولة كمنصة لدراسة مضطرب استقلاب الميتوكوندريا. على وجه التحديد، فقد تميزت التكيف الأيضي ردا على تثبيط أنا معقدة من روتينون.
وسعت الدراسة النتائج ذكرت سابقا حول دور تثبيط أنا معقدة من روتينون في خطوط الخلايا إلى الصفائح الدموية البشرية. الأهم من ذلك، فقد كشف هذا أن تشكيل روتينون منعت أيضا الصفائح الدموية succinyl، لجنة الزراعة، حفز زيادة في الصفائح الدموية βHB، لجنة الزراعة ولم يكن لها.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
ونحن نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30ES013508 وT32ES019851.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >كاشف < / قوي > | |||
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | سيجما ألدريتش | 746398 | |
| بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) | سيجما ألدريتش | S5761 | |
| ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub> * H2< / sub>O) | سيجما ألدريتش | 223506 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | سيجما ألدريتش | P9541 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2< / sub>) | سيجما ألدريتش | 208337 | |
| الجلوكوز | سيجما ألدريتش | G8270 | |
| 13 < / sup>C6< / sub>-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| حمض البالمتيك | كايمان | 10006627 | |
| 13< / sup>C16< / sub>-Palmitic | Acid Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| ماء (H2< / sub>O) | فيشر ساينتفيك | W7-4 | (أوبتيما) |
| حمض الفورميك | فيشر ساينتفيك | 85171 | (أوبتيما) |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | 472301 | |
| الإيثانول | فيشر العلمي | 04-355-222 | |
| الميثانول | فيشر العلمي | A454-4 | (أوبتيما) |
| أسيتات الأمونيوم | فيشر Scientific | A639-500 | |
| 2 مل أنابيب إيبندورف BioExpress | C-3229-1 | ||
| قوارير LC (بلاستيك) | المياه | 186002640 | |
| 10 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاجية | Kimble Chase | 73785-10 | |
| الواحة ذات المرحلة الصلبة (SPE) | المياه | WAT094225 | |
| ماصات Pastuer | فيشر العلمي | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 حاضنة مغلفة بالماء | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| مطياف الكتلة الثلاثي كوادروبول | الحراري العلمي | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC العمود | Phenomenex | Luna C18 | 3 & mu ؛ حجم الجسيمات M ، 200 مم × 2 مم |
المراجع
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evide....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
