Method Article

تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

DOI:

10.3791/54102

⸱

June 26th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental, Diagnostic and Specialty Medicine - DIMES, University of Bologna, 2Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, University of Ferrara, 3Department of Life Sciences and Biotechnology, University of Ferrara, 4Department of Morphology, Surgery and Experimental Medicine and Laboratory for Technologies of Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف طريقة حساسة ودقيقة لقياس microRNAs الخالية من الخلايا باستخدام الكيمياء القائمة على الصبغة وتقنية PCR الرقمية بالقطرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعميم (من خالية من الخلايا) الرنا الميكروية (miRNAs) تم إصدارها من الخلايا في مجرى الدم. وقد تم ربط كمية من microRNAs محددة في الدورة الدموية إلى حالة المرض ولديه القدرة على أن تستخدم العلامات البيولوجية المرض. تم تطوير طريقة حساسة ودقيقة لتعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الكيمياء قائم على الأصباغ وقطيرة تكنولوجيا PCR الرقمية مؤخرا. على وجه التحديد، وذلك باستخدام مغلق الأحماض النووية (LNA) المستندة الاشعال ميرنا معين مع الفلورسنت صبغة الحمض النووي ملزم الأخضر في قطرات نظام PCR الرقمية متوافق أنه من الممكن الحصول على تقدير المطلق للmiRNAs محددة. هنا، نحن تصف كيفية أداء هذه التقنية لتقييم كمية ميرنا في السوائل البيولوجية، مثل البلازما والمصل، على حد سواء مجدية وفعالة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يتم إطلاق < p class = 'jove_content'>MicroRNAs (miRNAs) في الدورة الدموية بواسطة جميع خلايا الكائن الحي ، نتيجة للإطلاق النشط أو العمليات النخرية وموت الخلايا المبرمج. تم اكتشاف miRNAs الخالية من الخلايا في مجرى الدم إما كجزيئات حرة مستقرة أو مرتبطة بالبروتينات الدهنية أو مغلفة داخل الإكسوسومات والحويصلات الدقيقة 1-3. يعتقد أنها تعمل كمتواصل من خلية إلى خلية 4 ، وتتغير كميتها في وجود السرطان أو اضطرابات القلب أو أمراض المناعة الذاتية 5-7. ويعد تقديرها الكمي الدقيق والقابل للتكرار هو الأساس لتقييمها كمؤشرات حيوية للمرض. ومع ذلك ، لعدة أسباب موصوفة بالفعل في مكان آخر 8،9 ، يمكن أن يكون القياس الكمي للحمض النووي الريبي المرسال في المصل أو البلازما ، بالإضافة إلى سوائل الجسم الأخرى ، أمرا صعبا للغاية 10،11. لقد طورنا مؤخرا طريقة للقياس الكمي المطلق ل miRNAs المنتشرة ، بناء على بادئات LNA الخاصة ب miRNA وتقنية PCR الرقمية بقطرات صبغة مرتبطة بالحمض النووي (ddPCR) 12. تم تطبيق هذه المنهجية للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية لسرطان الثدي miRNA 13،14.

بعد تقسيم كل جزيء miRNA منسوخ عكسيا داخل قطرة بحجم النانو لتر ، من الممكن حساب رقم النسخة لكل miRNA في كل عينة ، مع حساب عدد قطرات الفلورسنت الخضراء ، وبالتالي الموجبة ، الفلورسنت. بمجرد حدوث تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تحقيق العد الإيجابي ، دون الحاجة إلى إنشاء منحنى قياسي أو مراعاة كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل في حساب الكمية المستهدفة ، كما يحدث مع RT-PCR (RT-qPCR). بالإضافة إلى ذلك ، أثبت ddPCR أنه أكثر حساسية ودقة من RT-qPCR في التقدير الكمي للميرنا المتداول 15. نقدم في هذه المقالة البروتوكول التفصيلي لهذه المنهجية ، ونناقش الخطوات الأكثر صلة ونأخذ على وجه التحديد النظر في عينات المصل والبلازما.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الرنا الميكروي من البلازما أو مصل

ملاحظة: البلازما وإعداد المصل هو خطوة ذات الصلة في تعميم ميرنا الكمي. لا يوجد أي إجراء المفضل لالبلازما وإعداد المصل. الشيء الوحيد المهم للنظر هو أن جميع العينات من نفس التجربة يجب معالجتها باستخدام بالضبط نفس العمل. نبدأ من المصل 200 ميكرولتر أو البلازما. الحمض النووي الريبي مجموع يمكن عزله عن المصل أو البلازما باستخدام مجموعات متاحة تجاريا.

1. بروتوكول لإجمالي RNA (بما في ذلك ميرنا) عزل

  1. عينات المصل / البلازما ذوبان الجليد على الجليد.
  2. إضافة 1 مل من تحلل الكاشف (على سبيل المثال، QIAzol) إلى 200 ميكرولتر المصل / البلازما.
  3. مزيج من قبل vortexing ووضع الأنبوب الذي يحتوي على جناسة على مقاعد البدلاء في RT لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة 3 ميكرولتر من حل نانومتر 4.16 من الاصطناعية ميرنا سل-مير 39-3p من C. ايليجانس.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم. هز أنبوب بقوة لمدة 15 ثانية. المركز الرابعأنبوب الإلكترونية على مقاعد البدلاء في RT لمدة 2 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية للحصول على فصل مراحل: المرحلة المائية العليا تحتوي على الحمض النووي الريبي.
  7. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد، نحو 700 ميكرولتر، وتجنب نقل أي مواد البيني البيضاء.
  8. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ومزيج من قبل انقلاب.
  9. الماصة حتى 700 ميكرولتر من العينة في عمود الدوران مصغرة وضعت على أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  10. كرر هذه الخطوة باستخدام عينة المتبقية.
  11. إضافة 700 ميكرولتر العازلة RWT إلى عمود الدوران مصغرة، إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 12000 x ج لغسل العمود. تجاهل التدفق من خلال.
  12. الماصة 500 ميكرولتر العازلة RPE في عمود الدوران مصغرة. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 12000 دورة في الدقيقة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  13. أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران مصغرة بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة حتى يجف عمود الدورانغشاء من الايثانول المتبقية.
  14. نقل عمود الدوران مصغرة لأنبوب 1.5 مل مجموعة جديدة والماصة 35 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز على الغشاء العمود.
  15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي.
  16. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: منذ تركيز الحمض النووي الريبي لا يمكن تحديده بدقة، استخدام وحدات التخزين الثابتة كمقياس للكمية المدخلات.

2. الرنا الميكروي النسخ العكسي

  1. ذوبان الجليد في النسخ العكسي (RT) مكونات المزيج كاشف: 5X عازلة رد فعل، nuclease خالية من المياه. مزيج عكس بلطف الأنابيب ومكان على الجليد. مباشرة قبل الاستعمال، وإزالة مزيج انزيم من الثلاجة ووضعها على الجليد. تدور باستمرار كل الكواشف.
  2. تحضير مزيج كاشف RT على الجليد كما هو موضح في الجدول رقم 1. إعداد لا يقل عن 10٪ مزيج تزيد.
  3. خلط رد فعل من قبل pipetting، ثم تدور إلى أسفل.
  4. احتضان لمدة 60 دقيقة في 42 ج.
  5. للحرارة إبطال نشاط ترحد ذاته الناسخ لمدة 5 دقائق في 95 ج.
  6. على الفور بارد إلى 4 درجات مئوية.
  7. تخزين كدنا] في -20 درجة مئوية.

3. [كدنا التخفيف

  1. تخفيف كمية من قالب [كدنا حاجة لردود الفعل ddPCR المخطط لها في المياه الحرة نوكلياز. تمييع رد فعل [كدنا بين 01:50 و 1: 500 في الماء، وتعتمد على الهدف ميرنا وفرة. تخزين [كدنا المخفف في -20 درجة مئوية. أثبت كدنا] المخففة لتكون مستقرة لمدة 3 أشهر على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

4. الجيل الرذاذ وPCR

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الجيل الحبرية في 8 عينات في وقت واحد. ليس مطلوبا من مكررات التقنية، ويرجع ذلك إلى استنساخ عالية من هذه التكنولوجيا يجب تشغيل 12،15 .A لا تحكم قالب (NTC) عينة في كل لوحة ولكل حالة ddPCR مختلفة.

  1. ذوبان الجليد وتتوازن مزيج الرئيسي (على سبيل المثال، EvaGreen ميكس ماجستير)، الرنا الميكروي مجموعة التمهيدي وكدنا] في RT.
  2. مزيج الموافق ميكس ماجستيرoroughly التي كتبها قلب الأنبوب عدة مرات. تدور أسفل كل الكواشف.
  3. تحضير مزيج ddPCR كما هو موضح في الجدول رقم (2). وعندما يتم تنفيذ ردود الفعل ddPCR متعددة، وإعداد ddPCR مزيج عمل-حل. إعداد لا يقل عن 10٪ مزيج تزيد.
  4. تجميعها مرة واحدة، تخلط جيدا وتدور باستمرار مزيج ddPCR.
  5. الاستغناء عن 12 ميكرولتر من ddPCR مزيج إلى 96 جيدا لوحة PCR أو أنابيب PCR.
  6. إضافة 8 ميكرولتر من قالب [كدنا المخفف إلى كل أنبوب / جيد.
  7. أدخل خرطوشة قطرة مولد في حامل.
  8. نقل 20 ميكرولتر من كل عينة على استعداد لآبار العينة (الصف الأوسط) من خرطوشة قطرة مولد بعناية مع تجنب فقاعات الهواء في أسفل البئر.
  9. ملء كل بئر النفط (الصف السفلي) مع 70 ميكرولتر من النفط قطرة المولد.
  10. ربط طوقا على حامل خرطوشة وإدراجه في مولد قطرة.
  11. إغلاق الغطاء لبدء توليد الحبر بما يتوافق والعلاقات العامة الشركة المصنعةotocol. عندما انتهى جيل قطرة، فتح الغطاء، وإزالة حشية المتاح. أعلى آبار خرطوشة تحتوي على قطرات.
  12. الماصة ببطء وسلاسة 40 ميكرولتر من محتويات ثمانية آبار العليا (قطرات) في عمود واحد من لوحة 96-جيدا PCR.
  13. ختم لوحة PCR مع احباط مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. استخدام pierceable الأختام احباط لوحة التي تتوافق مع الإبر في القارئ قطرة.
  14. تبدأ الدراجات الحرارية (PCR) في غضون 30 دقيقة من ختم اللوحة.
  15. أداء بروتوكول الدراجات وفقا للجدول 3.

5. القطرة القراءة

  1. السلطة على القارئ قطرة.
  2. نقل لوحة من cycler الحرارية للقارئ قطرة.
  3. وضع لوحة 96-جيدا PCR يحتوي على-PCR بعد قطرات في قاعدة حامل اللوحة.
  4. ضع الجزء العلوي من حامل لوحة على لوحة PCR. اضغط بحزم كل من علامات التبويب الإفراجوصولا الى تأمين لوحة PCR في حامل.
  5. بدء تشغيل البرنامج من جهاز الكمبيوتر نظام.
    1. انقر فوق إعداد لتعريف التجربة (الكمي المطلق) ثم انقر فوق تشغيل لبدء القراءة الحبرية.
    2. عندما قطرة قراءة كاملة، انقر على "تحليل" الزر لفتح وتحليل البيانات.
    3. استخدام السعة مؤامرة 2D في برامج التحليل لتحديد قطرات الإيجابية (أداة لاسو) (الشكل 1B).
    4. استخدم علامة التبويب الأحداث للتحقق من عدد من قطرات الإيجابية والشاملة. وحققت 21،000 قطرات عادة مع probeless ddPCR - مجموع عدد 18000.
    5. مرة واحدة ويتم اختيار قطرات إيجابية، تصدير قيم تركيز ميرنا باستخدام الخيار تصدير بتنسيق csv من علامة التبويب التركيز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القيمة المطلقة من miRNAs محددة لكل مل من البلازما أو مصل يمكن تحديد باستخدام صبغة الفلورسنت الحمض النووي ملزم الأخضر وقطيرة تكنولوجيا PCR الرقمية الشكل 1 يعرض عملية إيجابية-قطرات الاختيار، والذي يحدد تركيز ميرنا النهائي (نسخ / ميكرولتر ) في رد فعل التضخيم وتحسب على أساس برامج التحليل. قيمة كل ميرنا في الدم هو مختلف جدا، ويجري بعض الأنواع ميرنا أكثر وفرة من غيرها. باستخدام [كدنا المخفف 01:50 في رد فعل ddPCR فمن الممكن الحصول على عدد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs تعميم موجودة في الدم بتركيزات منخفضة للغاية وكمية من الحمض النووي الريبي التي يمكن استخلاصها من عينات البلازما والمصل منخفضة. لهذا السبب، فإن من الصعب تحديد مع تقنيات أخرى مثل ميكروأري وتسلسل الحمض النووي الريبي. وعلاوة على ذلك، هناك نقص معمم الاتفاق على تطبيع البيانات ووجود miRNAs الذاتية "المرجعية" في الدم. في هذا السياق، وهو تكنولوجيا حساسة مثل قطرة PCR الرقمي، قادرة على إحصاء عدد النسخ ميرنا لكل مليلتر من الدم أو البلازما حتى لو منخفض جدا، جذابة جدا. نحن تقرن ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم من تمويل من الاتحاد الإيطالي لأبحاث السرطان (جنة العلاقات الصناعية الاسترالية) لMF (MFAG 11676) وMN (برنامج الجزيئية الخاصة الأورام السريري - 5 بالألف ن 9980، 2010/15) ومن الوزارة الإيطالية للتعليم والجامعات و البحث FIRB 2011 إلى MN (مشروع RBAPIIBYNP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
miRNeasy Mini KitQiagen217004أعمدة لإجمالي الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك miRNA ، الاستخراج من المصل / البلازما
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3pتقنيات الحمض النووي المتكاملةالتسلسل المخصص: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA syn kit II ، 8-64 rxnsExiqon203301Kit للنسخ العكسي microRNA
MicroRNA LNA PCR مجموعة التمهيدي   ؛Exiqon204000-206xxx و 2100000-21xxxxxبادئات لتضخيم miRNA داخل القطرات
مولد قطرات QX200BioRad186-4002أداة تستخدم لقراءة القطرات
قارئ قطرات QX200BioRad186-4003أداة تستخدم لتوليد القطرات
برنامج QuantaSoftBioRad186-3007لجمع البيانات وتحليلها
PX1 PCR لوحة السدادةBioRad181-4000لوحة السدادة
DG8 خراطيش وحشيات مولد قطراتBioRad186-4008خراطيش تستخدم لخلط العينة والزيت لتوليد قطرات
QX200 ddPCR EvaGreen supermixBioRad186-4033 / 36PCR supermix
QX200 زيت مولد قطرات ل EvaGreen صبغBioRad186-4005زيت لتوليد القطرات
برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).
  2. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  3. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  4. Braicu, C., et al. Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology. Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).
  5. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  6. Guay, C., Regazzi, R. Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).
  7. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).
  8. Moldovan, L., et al. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).
  9. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers. Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).
  10. Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions. Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).
  11. Witwer, K. W. Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions. Clin Chem. 61, 56-63 (2015).
  12. Miotto, E., et al. Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).
  13. Ferracin, M., et al. Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients. Oncotarget. , (2015).
  14. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomarker Research. , (2015).
  15. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  16. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11, 809-815 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating MicroRNADroplet Digital PCRDNA binding DyeLNA based PrimersAbsolute QuantificationPlasma Serum AnalysisEvaGreen Master MixDroplet GenerationThermal CyclingQuantaLife Software

Related Articles