وتصف هذه الدراسة طرق للتعبير المشترك بوساطة T7 من جينات متعددة من البلازميد واحد في القولونية الإشريكية باستخدام نظام البلازميد بمغس.
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
وتصف هذه الدراسة طرق للتعبير المشترك بوساطة T7 من جينات متعددة من البلازميد واحد في القولونية الإشريكية باستخدام نظام البلازميد بمغس.
ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد للبيولوجيا التركيبية، ودراسة مجمعات البروتينات البروتينية، وتوصيف وتسخير المسارات الحيوية. في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء أوبيرونات الاصطناعية مولتيجين تحت سيطرة بوليميراز T7 الحمض النووي الريبي. هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. هنا، مجموعة من أربعة ناقلات ذات الصلة، بمغس-A، بمغس-هيسا، بمغس-K، و بمغكس-هيسك، مع امبيسلين أو كاناميسين مقاومة اختيار علامة (A و K) وإما امتلاك أو تفتقر إلى N- محطة هيكساهستيدين علامة (له) يتم الكشف عنها. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لبناء الأوبرونات الاصطناعية باستخدام هذا النظام المتجه جنبا إلى جنب مع البيانات المقابلة، تبين أن نظام القائم على بمغس تحتوي على خمسة جينات يمكن أن تكون شيدت بسهولة واستخدامها لإنتاج جميع البروتينات المشفرة الخمسة في الإشريكية القولونية . هذا الكيسإم والبروتوكول تمكن الباحثين من التعبير بشكل روتيني عن وحدات معقدة متعددة المكونات والمسارات في E. القولونية .
ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، لا سيما في تطبيقات البيولوجيا التخليقية، حيث يجب التعبير عن وحدات وظيفية متعددة 1 ؛ في دراسة البروتينات المجمعات البروتين، حيث التعبير وظيفة غالبا ما تتطلب تعبير مشترك 2 ، 3 ؛ وفي تحديد وتسخير المسارات الحيوية، حيث يجب التعبير عن كل جين في المسار 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تطوير عدد من النظم للتعبير المشترك، وخاصة في ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. الحصول على الجينات ذات الاهتمام
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
في هذه الدراسة، كان الهدف هو المشاركة في التعبير عن خمسة بروتينات من البلازميد واحد. وقد تم شراء الشظايا الاصطناعية المثلى المكونة من خمسة كودون والتي ترميز إما علامات هيكساهستيدين N- أو C- الطرفية تجاريا. تم تضخيم الجينات الاصطناعية عن طريق ير واستنساخها بشكل فردي في ناقلات ير حادة ومتسلسلة. لتوليد البلازميد بوليسيسترونيك، تم استنساخ الجينات الخمسة من الفائدة لأول مرة في البلازميد بمغس المناسب، بمغس-A. ويبين الشكل 2 P.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ويعتبر التعبير المشترك عن الجينات المتعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، خاصة في تحديد وإعادة تشكيل مسارات الأيض المعقدة المتعددة الأقطاب 3 و 4 و 5 . نظام بمغس يجعل مولتيجين شارك في التعبير في E. القولونية الروتينية 6 ، 7 ، 8 ويمكن الوصول إليها للباحثين متنوعة. في هذه الدراسة، أظهرت خمسة بروت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >إنزيمات < / قوي > | |||
| الفوسفاتيز القلوي ، معوي العجل (CIP) | نيو إنجلاند بيولابز | M0290S | |
| AvrII | نيو إنجلاند بيولابز | R0174S | |
| EcoRI | نيو إنجلاند بيولابس | R0101S | |
| NdeI | نيو إنجلاند بيولابز | R0111S | |
| XbaI | جديد إنجلترا Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recodes< / قوي > | |||
| 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي | نيو إنجلاند بيولابس | N3232L | |
| 4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل بروتين خال من البقع | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) خلايا | كيميائية خلية Comeptent محضرة في المنزل | ||
| B-PER كاشف استخراج البروتين البكتيري | فيشر Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP مزيج | Agilent Technologies | المزود بمجموعة | |
| استخراج هلام البوليميرازأوميغا | D2500-02 | E.Z.N.A استخراج جل ، مقدمة من VWR Cat 3: CA101318-972 | |
| جلايسين | فيشر ثيرمو سيانتيفيك | BP381-1 | |
| جسمه المضاد العلامة [HRP] ، mAb ، Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| الحليب الخالي من الدسم المبستر | البقالة | حليب البقالة الذي لا يحمل اسما كاف | |
| غشاء النيتروسليلوز | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | غشاء PT 0.45 & micro ؛ م 200 مم × 4 م ، مقدمة من VWR Cat #: CA10061-086 |
| طقم عزل الحمض النووي البلازميد | أوميغا | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I ، المقدم من VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | طلب من Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers Interintegrated | DNA Technologies تصميم | الاشعال حسب الحاجة للجينات المطلوبة | |
| تقنيات الحياة الجينية الاصطناعية | تصميم وتحسين حسب الحاجة | ||
| ورقة ترشيح لطخة سميكة | Bio-Rad | 1703932 | |
| قاعدة تريس | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue خلايا | خلية Comeptent محضرة في المنزل | ||
| <قوي>الاسم< قوي> | <قوي> الشركة< / strong> | رقم الكتالوج< / strong> | تعليقات< / strong> |
| Equipment< / strong> | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophorese |
| خلية جل تصوير | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| حاضنة فرن | فيشر ثيرمو سيانتيفيك | 11-690-650D | حاضنة متساوية الدرجة |
| الأولى شاكر | فيشر ثيرمو ساينتفيك | SHKE6000-7 | ماكس كيو 6000 ماكس كيو 6000 |
| بيرسونا شفرات | فيشر ثيرمو ساینتفيك | S04615 | |
| حزمة الطاقة | بيو راد | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR الدولية | M-10E ، 6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal ، مقدمة من Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| النقل الغربي | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن