مقالة منهجية

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

DOI:

10.3791/55452

⸱

أبريل 11, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة منهجية لإعداد 3D، قابلة للتحلل، السقالات خلية تشبه الرغوة على أساس الجانب سلسلة اللدائن الكريستال السائل حيويا (LCEs). تبين التجارب المجهري متحد البؤر التي LCEs مثل رغوة تسمح لمرفق الخلية، والانتشار، والمحاذاة التلقائية للmyoblasts C2C12s.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم إعداد خطوة بخطوة ل3D، قابلة للتحلل، مثل رغوة خلية سقالة. والتي عبر ربط كتلة النجم المشارك البوليمرات يضم وحدات الكولسترول كمجموعات الجانبية سلسلة قلادة، مما أدى إلى smectic-A (SMA) اللدائن الكريستال السائل (LCEs) التي أعدت هذه السقالات. السقالات تشبه الرغوة، أعدت باستخدام قوالب معدنية، ميزة microchannels المترابطة، مما يجعلها مناسبة كما السقالات زراعة الخلايا 3D. الخصائص المشتركة للهيكل منتظم من رغوة المعادن ونتيجة المطاط الصناعي في سقالة خلية 3D تعزز العالي ليس فقط تكاثر الخلايا بالمقارنة مع الأفلام التقليدية التي يسهل اختراقها قالب، ولكن الإدارة أيضا أفضل من النقل الجماعي (أي المواد المغذية والغازات والنفايات ، وما إلى ذلك). طبيعة القالب المعدني تسمح للتلاعب السهل من الأشكال رغوة (أي، لفات أو الأفلام) ولإعداد السقالات أحجام المسام المختلفة للدراسات مختلفة من الخلايا مع الحفاظ على interconnecتيد طبيعة المسامية من القالب. عملية الحفر لا يؤثر على كيمياء اللدائن، والحفاظ على طبيعتها حيويا والقابلة للتحلل. وتبين لنا أن هذه LCEs smectic، عندما نمت لفترات زمنية واسعة، وتمكين دراسة بنيات الأنسجة ذات الصلة ومعقدة سريريا مع تعزيز نمو وانتشار الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك العديد من الأمثلة من المواد الاصطناعية البيولوجية وحيويا لتطبيقها في دراسات الخلايا وتجديد الأنسجة التي تهدف إلى مرفق الخلية وانتشار 1، 2، 3، 4، 5. وكانت هناك أمثلة قليلة من المواد حيويا، والمعروفة باسم اللدائن الكريستال السائل (LCEs)، يمكن أن يستجيب للمؤثرات الخارجية مع متباين الخواص الجزيئية طلب 6 و 7. LCEs هي مواد المحفزات متجاوبة التي تجمع بين الخواص الميكانيكية ومرنة من اللدائن مع وظيفة البصرية وترتيب الجزيئية من البلورات السائلة 8 و 9. يمكن LCEs تجربة تغييرات في الشكل وتشوه الميكانيكية، وسلوك مرن، والخصائص البصرية ردا على STIM الخارجيةاولي (أي.، الحرارة، والإجهاد، والضوء، وما إلى ذلك) 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. وقد أظهرت دراسات سابقة أن البلورات السائلة (خطابات الاعتماد) يمكن الشعور نمو وتوجيه الخلايا 4، 17. ومن ثم من الممكن أن نفترض أن LCEs قد تكون مناسبة للتطبيقات البيولوجية والطبية ذات الصلة، بما في ذلك السقالات الخلية والمحاذاة. لقد ذكرت سابقا إعداد smectic الأفلام حيويا، قابلة للتحلل، ويلقي مصبوب، وLCEs رقيقة يضم "نوع السويسري الجبن" مورفولوجيا التي يسهل اختراقها 6، 18. ونحن على استعداد أيضا LCEs حيويا خيطي مع التشكل كروي كما السقالات لنمو الخلايا 19 <سوب>، 20. ويهدف عملنا في ضبط الخواص الميكانيكية للمواد بحيث تتطابق مع تلك الأنسجة من الفائدة 21. أيضا، وتركز هذه الدراسات على فهم التفاعلات المطاط الصناعي خلايا، فضلا عن الاستجابة الخلوية عندما اللدائن تخضع للمؤثرات الخارجية.

كانت التحديات الرئيسية في جزء منه إلى تكييف المسامية من LCEs للسماح لمرفق الخلية وتخلل من خلال مصفوفة المطاط الصناعي والنقل الجماعي أفضل. مسامية من هذه الأفلام رقيقة 6 سمحت تخلل الخلية من خلال الجزء الأكبر من المصفوفة، ولكن لم تكن كل المسام مترابطة كليا أو كان حجم أكثر انتظاما (متجانسة) المسام. نحن بعد ذلك تقريرا عن حيويا اللدائن LCE خيطي مع الأشكال التضاريسية الكروية. هذه اللدائن خيطي سمحت للمرفق وتكاثر الخلايا، ولكن تراوح حجم المسام فقط 10-30 ميكرومتر، والتي منعت أو استخدام هذه محدودةاللدائن مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا 19 و 20.

الأعمال السابقة التي الكونغ آخرون. المتعلقة بتشكيل الرغاوي الجرافين باستخدام "الأضاحي" قالب معدني أظهرت أن رغوة الجرافين التي تم الحصول عليها كان لها التشكل التي يسهل اختراقها العادية جدا التي يمليها قالب معدني اختيار 22. تقدم هذه المنهجية السيطرة الكاملة على المسامية وحجم المسام. في الوقت نفسه، على تطويع والمرونة من القالب المعدني تسمح لتشكيل قالب مختلف الأشكال قبل إعداد الرغوة. تقنيات أخرى، مثل الرشح المواد 23، النموذجيه الغاز 24، أو ألياف نسج الكهربائية 25 و 26 كما تقدم إمكانية إعداد المواد المسامية، لكنها أكثر استهلاكا للوقت، وفي بعض الحالات، يقتصر حجم المسام ل فقط عدد قليل من ميكرومتر. رغوةتشبه LCEs 3D أعدت باستخدام قوالب معدنية تسمح لتحميل خلية العالي؛ تحسين معدل انتشار. شارك في زراعة؛ وأخيرا وليس آخرا، وتحسين إدارة النقل الجماعي (أي المواد الغذائية، والغازات، والنفايات) لضمان تنمية الأنسجة الكاملة 27. تظهر مثل رغوة LCEs 3D أيضا إلى تحسين المواءمة الخلية؛ وهذا هو الأرجح فيما يتعلق المعلقات LC الاستشعار عن نمو الخلايا والتوجه الخلية. وجود الأنصاف LC داخل LCE يبدو لتعزيز التوافق خلية فيما يتعلق موقع خلية داخل سقالة LCE. خلايا محاذاة داخل الدعامات من LCE، في حين لوحظ أي اتجاه واضح حيث تنضم الدعامات معا (تقاطعات) 27.

وعموما، لدينا LCE منصة خلية سقالة كوسيلة دعم الخلية تتيح فرصا لضبط التشكل المطاط الصناعي وخصائص المرونة وتحديدا توجيه محاذاة (الفرد) أنواع الخلايا لخلق أمر والترتيبات المكانية سخلايا مماثلة لو المنظومات الحية. وبصرف النظر عن تقديم سقالة قادرة على الحفاظ وتوجيه نمو الخلايا على المدى الطويل وانتشار، LCEs تسمح أيضا للتجارب الحيوية، حيث يمكن تعديل توجيه الخلايا والتفاعلات على الطاير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الخطوات التالية ل3D LCE إعداد مثل رغوة باستخدام 3-ذراع كتلة نجم من البوليمرات وتظهر في الشكل 1. لتوصيف النووي بالرنين المغناطيسي (NMR)، يتم تسجيل الأطياف في الكلوروفورم بالديوتيريوم (CDCl 3) في درجة حرارة الغرفة على بروكر DMX 400 ميغاهيرتز الصك وداخليا المشار القمم المتبقية في 7.26. تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) الأطياف يتم تسجيلها باستخدام بروكر المتجهات 33 FT-IR مطياف باستخدام الكلي وضع الانعكاس الموهن. لكل خطوة من بروتوكول التالية، من المهم أن ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).

1. توليف α-كلورو-ε-caprolactone (الأحادي) (وفقا لإجراءات في جيروم وآخرون. 28)

  1. قبل البدء في تجميع وتنقية 27 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic على النحو التالي:
    1. في 800 مل من الماء المقطر، إضافة 1،28 غرام من الصوديومالفوسفات أحادي القاعدة الهيدرات و8.24 غرام من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مائى. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك) والاحتياطي 30 مل من هذا الحل. هذا هو الحل العازلة.
    2. باستخدام قمع فصل، ويحل حامض 3-chloroperbenzoic في 35 مل من ايثر. غسل حل العضوي مع 10 مل من محلول منظم (المعد في الخطوة 1.1.1). تكرار غسل ثلاث مرات.
    3. إضافة 3 غرام من كبريتات الصوديوم مباشرة إلى حل العضوي. هذا عامل التجفيف تمتص الماء من المحلول العضوي.
    4. تصفية الحل لإزالة عامل التجفيف. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية.
  2. إذابة 18.5 غرام من تنقية حامض 3-chloroperbenzoic في 150 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف عن طريق اثارة في حمام بالموجات فوق الصوتية. هذه العملية تستغرق عادة 20 دقيقة. وضع الحل داخل قمع فصل.
  3. داخل الرقبة اثنين، دورق كروي،حل 13،1 غراما من 2 chlorocyclohexanone في 15 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف باستخدام محرك مغناطيسي تحت غاز النيتروجين. الحفاظ على اثارة.
  4. تناسب قمع فصل يحتوي على محلول حمض 3-chloroperbenzoic (من الخطوة 1.2) إلى قارورة اثنين الرقبة في الخطوة 1.3. مسح نظام مع غاز النيتروجين. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث يسقط محلول حمض chloroperbenzoic قطرة قطرة في حل 2-chlorocyclohexanone (1 قطرة كل البعض الثاني) وتستمر اثارة الخليط تحت غاز النيتروجين لمدة 96 ساعة.
  5. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لترسيب ثانوية م حامض -chlorobenzoic (م -CBA).
  6. تصفية حمض -chlorobenzoic م (م -CBA) ويغسل الحل المتبقي مع حلول المشبعة من ثيوكبريتات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم.
  7. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. تنقية أصفر باهت، LIQU لزجمعرف عن طريق التقطير تحت ضغط منخفض عند 2.3 عربة و 96 درجة مئوية.
  8. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام 1 قمم H NMR التالية. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 4،75-4،68 (م، 1H، C H ClCO)، 4،37-4،26 (م، 1H، C H 2 O)، 4،18-4،05 (م، 1H ، C H 2 O)، و2،06-1،58 (م، 6H، -C H 2 -) 6، 27.

2. تجميع α-ثلاثة تسليح ستار كتلة كوبوليمر (SBC-αCl) من خلال حلقة بالتطعيم افتتاح (شارما وآخرون. (6) وأمسدن وآخرون. 29)

  1. قبل التوليف، silanize أمبولة 20 مل من ملئه مع (/ ت ت) حل 2٪ من 1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltriethoxysilane في التولوين والتحريك لمدة حوالي 24 ساعة. شطف مع ايزوبروبيل وجففها عن طريق وضعها في الفرن على 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 30.64 غرام من المقطر ε-caprolactone، 0.5 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 0.25 مل من الجلسرين إلى أمبولة. باستخدام مزيج دوامة لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 4.90 غرام من D، L -lactide إلى أمبولة وتخليصها مع النيتروجين. ضع أمبولة في الفرن على 120 درجة مئوية لإذابة D، L -lactide. هذه العملية تستغرق عادة حوالي 2 ساعة. مزيج مرة أخرى باستخدام دوامة للتأكد من أن جميع محتويات مختلطة جيدا وإضافة 66 ميكرولتر من القصدير (II) 2-ethylhexanoate (القصدير (أكتوبر) 2) إلى أمبولة.
    ملاحظة: D، L سوف -lactide يبرد أثناء هذه العملية، وسوف تحتاج إلى إعادة تسخينه في الفرن لتذوب.
  4. بقوة مزيج واحد آخر مرة باستخدام دوامة والاحمرار مع النيتروجين.
  5. إغلاق أمبولة مع سدادة مطاطية. وضع إبرة متصلة فراغ أنبوب (الفراغ المنزل عادة ما يكون بما فيه الكفاية) من خلال سدادة مطاطية. بدوره على فراغ، وباستخدام لهب، تذوب الرقبة طويلة من الزجاج، والتواء ببطء حتى زمعشوقة ينهار على نفسه. كن حذرا حتى لا تذوب سدادة مطاطية. مرة واحدة في أمبولة هو اللهب مختومة، وضعه في حمام الرمل، فرن، أو عنصر التسخين المناسب في 140 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  6. إخراج أمبولة واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
  7. كسر أمبولة في علامة مغلقة وحل سائل لزج للغاية وذلك بإضافة 10 مل من ثنائي كلورو ميثان. نقل حل لقمع فصل.
  8. إعداد قارورة تحتوي على 100 مل من الميثانول الباردة (المبردة باستخدام الجاف حمام الثلج / الأسيتون عند درجة حرارة حوالي -78 ° C). إصلاح قمع فصل (الخطوة 2.7) على رأس القارورة. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث عن اثنين من قطرات تسقط كل الآخرين الثاني (قطرة قطرة).
  9. جمع راسب أبيض عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) وجففها في فرن فراغ ما بين 50 و 60 درجة مئوية.
  10. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 5،29-5،03 (م، COC H C H 3)، 4،43-4،25 (م، C H الكلور)، 4،24-4،12 (م، C H 2 O)، 4،11-4،03 (ر، J = 4.6 هرتز، C H 2 O)، 3،80-3،68 (م، C H C H 2)، 3،09-2،64 (اسعة، S، O H)، 2.39 (ر، J = 4.5 هرتز، H ألفا)، 2.33 (ر، J = 5.1 هرتز، H ألفا)، و1،77-1،25 (م، C H 2، C H 3)؛ FT-IR (1 / λ [سم -1]): 2932 (ق)، 2869 (م)، 1741 (ق)، 961 (ق)، 866، و 735 (م) 6، 27.
    ملاحظة: لإعداد 3D LCE أكثر ماء، وإعداد كتلة كوبوليمر الخطية (LBC) بدلا من SBC، وبعد إجراء عصابة فتح البلمرة (شرطة عمان السلطانية) المذكورة أعلاه.
    1. إضافة 0.3 غرام من البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 3.15 ز ε-caprolactone، 1.0 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 5.0 غرام من D، L-lactide إلى مزيج قارورة silanized.

3. تعديل الاصطناعية من α-CL-ثلاثة الذراع SBC إلى αN 3 ثلاثة والذراع SBC (SBC-αN 3) (وفقا لشارما وآخرون. 6)

  1. في قارورة ذهابا وأسفل وتحت النيتروجين، ويحل 5 غرام من SBC-αCl في 30 مل من N الجاف، N '-dimethylformamide.
  2. إضافة 0.22 غرام من أزيد الصوديوم والسماح للرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: أزيد الصوديوم السامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
  3. إزالة N، -dimethylformamide N 'تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 11 مللي بار و 40 درجة مئوية. حل الخليط في 30 مل من التولوين. أجهزة الطرد المركزي في حل ثلاث مرات في 2800 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة الملح تشكيلها. تتبخر التولوين تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 77 مللي بار و 40 درجة مئوية.
  4. مراقبة نجاح استبدال أزيد باستخدام 1 H NMR وFT-IR القمم.
    ملحوظة: 1 H NMR الطيف مماثل إلى الأصل SBC-αCl، باستثناء ظهور الذروة في 3.90 جزء في المليون ذات الصلة إلى مجموعة أزيد. FT-IR (1 / λ [سم -1]): 2928، 2108 (ق، أزيد)، 1754 (ق)، 1450 (ق)، 960 (م)، 865 (ق)، 733 (ق)، و 696 (م).

4. توليف الكوليسترول 5 Hexynoate (LC شاردة) (وفقا لشارما وآخرون. (6) ودونالدسون وآخرون. 30)

  1. في قارورة ذهابا والقاع، ومزيج 3 غرام من حمض 5-hexynoic و 130 مل من ثنائي كلورو ميثان. بارد 0 درجة مئوية باستخدام حمام جليدي.
  2. في قارورة ذهابا وأسفل أخرى، مزيج 8.28 غرام من N، N '-dicyclohexylcarbodiimide، 10.3 غرام من الكولسترول، و 0.2 غرام من 4 dimethylaminopyridine.
  3. نقل 5-hexynoic حامض حل قطرة قطرة إلى قارورة تحتوي على خليط الكوليسترول في الدم والحفاظ على الخليط النهائي في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. يسمح هذا المزيج على الاحماء لدرجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  5. إزالة الناتجة يعجل dicyclohexylurea عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح الدرجة 415 وتخلص منه.
  6. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. حل هذه البقايا التي تم جمعها في 150 مل من الهكسان.
  7. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 335 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 350 مل من الايثانول إلى بقايا زيتية لجمع المنتج النهائي. غسل من البيض الصلبة شكلت مع الإيثانول وتجفيف المنتجات الصلبة في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية.
  8. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 5.39 (د، J = 4.7 هرتز، 1H، C H = C)، 4،70-4،58 (م، 1H، C H OCO)، 2.44 (ر، J = 2.5 هرتز، 2H، C H 2 CO)، 2.34 (م، 2H، C H 2-C H =)، 2.31 (م، 2H، C H 2 C H 2 -COO)، 2.28 (ق، 1H، HC≡C)، 2.27 (د، J = 2.3 هرتز، 2H، ≡CC H 2)، 2،07-1،06 (م، 2H، C H 2، C H)، 0.94 (ق، 3H، C H 3)، 0.89 (د، J = 1.8 هرتز، 3H، C H 3 C H)، و0.88 (د، J = 1.8 هرتز، 6H، C H 3 -C H)، 0.67 (ق، 3H، C H 3). FT-IR (1 / λ [سم -1]): 2،830-2،990 (واسعة وقوية الذروة)، 2104 (م)، 1695 (ق)، 1428 (م)، 1135 (م)، 999 (ق)، 798 (ق)، و 667 (ق).

5. تعديل الاصطناعية من α-N 3 ثلاثة والذراع SBC إلى ألفا-الكوليسترول-ثلاثة الذراع SBC (SBC-αCLC) عن طريق رد الفعل أزيد-آلكاين Huisgen سيكلو إضافة ( "اضغط على" رد الفعل) للحصول على SBC-تشول (وفقا ل شارما وآخرون. 6)

  1. في قارورة ذهابا والقاع، ويحل 1 المولي يعادل SBC-αN 3 (1.5 غرام) في 100 مل من رباعي هيدرو الفوران المقطر الطازجة (THF). إضافة 1.2 يعادلها الموليطن من الكوليسترول 5 hexynoate (1.94 ز)، أي ما يعادل 0.1 المولي من النحاس (I) يوديد (0.06 ز)، و 0.1 يعادل المولي من ثلاثي الإيثيلامين (0.03 ز). يحرك الخليط بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية تحت النيتروجين.
  2. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 357 مليبار و 40 درجة مئوية.
  3. حل الخليط المتبقي في 80 مل من ثنائي كلورو ميثان وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2800 x ج في درجة حرارة الغرفة لإزالة المواد المتفاعلة والمنتجات الجانبية.
  4. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 7.54 (ق، CH = C-التريازول)، 5،43-5،34 (م، C = CH الكوليسترول)، 5،10-5،06 (م، COCHCH 3)، 4.68 -4.55 (م، O-CH الكوليسترول)، 4،24-4،19 (م، CH 2 O)، 4،18-4،13 (ر، J = 5.0 هرتز، CH 2 O)، 4،11-4،05 (ر، J = 4.4 هرتز، CH 2 O)، 2،47-2،41 (ر، J = 4.9 هرتز، كوتش 2)، 2،31-2،25 (م، كوتش 2)، 2،07-1،02 (م، CH 2 ، CH 3)، 1،05-1،03 (ق، CH 2، CH 3)، 0،96-0،92 (د، J = 3.3 هرتز، CH 2، CH 3)، 0،91-0،87 (اليوم، J = 1.9 هرتز، J = 1.8 هرتز، CH 3)، و0،71-0،68 (ق، CH 3). FT-IR (1 / λ [سم -1]): 3260 (ق)، 2920 (ق)، 1710 (ق)، 1460 (ق)، 1370 (ق)، 1240 (م)، 1190 (ق)، 733 (ق)، و 668 (ق).

6. تجميع 2،2-مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (Crosslinker، BCP) (وفقا لقاو وآخرون. 27 وAlbertsson وآخرون. 31)

  1. في قارورة ذهابا والقاع، وإعداد محلول يحتوي على 10.8 غراما من 2 مكرر (4-هيدروكسي-cyclohexyl) البروبان و 52 مل من حمض الخليك.
  2. تحضير محلول يحتوي على 11 غرام من أكسيد الكروم في 50 مل من حمض الخليك و 8 مل من الماء المقطر. إضافة هذا الحل قطرة قطرة إلى حل أعدت في الخطوة 6.1 مع الحفاظ على درجة حرارة خليط بين 17 و 20 درجة مئوية (على سبيل المثال، فيحمام الماء)؛ هذه العملية تستغرق قطرة قطرة 2 ساعة. وبمجرد اكتمال العملية، والسماح للحل ليقلب لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة 50 مل من 2-بروبانول. تحريك الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  4. التركيز على حل البنفسجي الغامق تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 137 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 300 مل من الماء المقطر لترسيب. يجب أن يكون راسب ضوء الأرجواني.
  5. الترشيح الناتج الخام باستخدام ورق الترشيح الصف 415. غسل المواد الصلبة مع ~ 250 مل من الماء المقطر أو حتى الصلبة يصبح أبيض.
  6. حل مادة صلبة في 15 مل من البنزين في 40 ° C والسماح لها أعد بلورة عند 25 درجة مئوية.
  7. إضافة 8.34 غرام من كيتون ثنائي الجاف حله في ثنائي كلورو ميثان الجاف ومحلول يحتوي على 6.0 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic في 75 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى قارورة.
  8. ارتداد الحل عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  9. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لترسيب م -chlorobenzoic ثانوية حامض.
  10. إزالة م حامض -chlorobenzoic عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) والتركيز على حل تحت ضغط منخفض.
  11. يغسل المنتج الخام فسكوزي مع 200 مل من 2 heptanone وتجفيف راسب في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية خلال الليل.
  12. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 4،42-4،37 (اليوم، J = 14.2، 7.4 هرتز، 2H، C H 2 OC = O)، 4،21-4،15 (ر، 2H، J = 11.3 هرتز، C H 2 OC = O)، 2،80-2،75 (دي دي تي، J = 14.3، 6.5، 1.6 هرتز، 2H، C H 2 COO)، 2،63-2،57 (ترينيداد وتوباغو، J = 13.3، 2.1 هرتز، 2H، C H 2 COO)، 2،04-1،93 (M، 4H، -C H 2 CH 2 OC = O)، 1،70-1،56 (م، 4H، -C H 2 C H 2 COO)، 1،48-1،38 (م، 2H، - C H C (CH 3) 2)، و0.84 (ق، 6H، C H 3 C-).

    13. 7. إنشاء المسامية 3D المرنة سقالة عن طريق إما Hexamethylene الدي إيزوسيانات (HDI) أو 2،2 مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (BCP) 27 كما Crosslinkers (وفقا لقاو وآخرون. 27)

    1. إعداد ثلاث ذراع المطاط الصناعي خليط باستخدام 0.75 غرام من SBC-αCLC بإضافة 0.25 مل من HDI (أو 0.45 مل من BCP) و 0.24 مل من المقطر مونومر ε-caprolactone. إضافة 60 ميكرولتر من القصدير (أكتوبر) 2. في حالة استخدام BCP بدلا من HDI، مزيج SBC-αCLC وBCP باستخدام الدوامة ووضعها في الفرن على 140 درجة مئوية حتى يذوب BCP تماما ويذوب (هذه الخطوة يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 2 ساعة). مرة واحدة وقد تم حل BCP، إخراجها من الفرن و، والقصدير (أكتوبر) 2، ودوامة.
    2. إعداد "الأضاحي" قالب النيكل رغوة بقطع 1 × 4 سم معدن قطعة. لفة من أحد طرفي قصيرة بحيث لفة الأخيرة هي حوالي 1 × 1 سم معدن قطعة (انظر الشكل 4).
      3. <لى> ضع رغوة النيكل في قارورة زجاجية أو الألومنيوم حزمة احباط ويصب الخليط المعد في الخطوة 7.1 لتغطية كامل الرغوة لمدة 2 دقيقة. إزالة الخليط الزائد مع الماصة باستور. ترك الأمر بين عشية وضحاها في الفرن عند 80 درجة مئوية.
    3. تقشر رقائق الألومنيوم أو كسر الزجاج. باستخدام شفرة حلاقة، حلق المطاط الصناعي في جميع أنحاء رغوة المعادن للكشف عن المعادن النيكل.
    4. إعداد 1 M الحديد (III) كلوريد (FeCl 3) حل في 100 مل من الماء. ضع رغوة في قارورة وإضافة 70 مل من FeCl 3 الحل. يحرك المزيج لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة، وتغيير FeCl 3 حل كل يوم. قبل كل تغيير، وإثارة الرغوة مع الماء المؤين عن 0.5 ساعة.
      ملاحظة: عادة ما يتم الانتهاء من عملية الحفر بعد ثلاثة أيام. لضمان أن يتم الانتهاء من عملية الحفر، إجراء اختبارات الضغط عن طريق اللمس حتى يشعر الرغاوي لينة. المقاومة رغوة لاختبارات ضغط اللمس يدل على وجود قالب معدني المتبقية.
    5. شطف ELASTعمر رغوة مع الايثانول ومكان في فراغ فرن بين عشية وضحاها في 40 ° C.
    6. توصيف المواد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، الكالوري التفاضلية المسح الضوئي (DSC)، اختبارات ضغط الميكانيكية، والتحليل الوزني الحراري (TGA) 27.
      ملاحظة: للحصول على إعداد 3D LCE أكثر ماء، استبدل SBC مع LBC (التأكد من أن LBC يحتوي أيضا على شاردة LC) باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 7.5.

    8. البذر من المطاط الصناعي سقالة مع خلايا SH-SY5Y العصبية والثقافة عن طريق تقنيات معقمة

    1. تعقيم المطاط الصناعي قبل غسله مرتين مع 1 مل من الايثانول 70٪. أداء أشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة ويغسل مع 1 مل من الايثانول 70٪. شطفه مرتين مع 1 مل من الماء المعقم و 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضع اللدائن في لوحات ثقافة 24-جيدا.
    2. إعداد المتوسطة نمو الخلايا لSH-SY5Y تحتوي على 90٪ Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) supplemented مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين (القلم بكتيريا).
    3. بعد فرز الخلايا باستخدام الكريات، وإعداد 1.5 × 10 5 خلايا SH-SY5Y علقت في 100 ميليلتر من متوسط النمو (حل البذور). إضافة الحل على رأس اللدائن، مع التأكد من تشكيل الهبوط.
    4. احتضان اللدائن المصنفة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة 2 ساعة لتعزيز التصاق الخلية. إضافة 0.5 مل من متوسط ​​النمو. احتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    5. تغيير المتوسطة كل يوم بعد الغسيل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.

    9. التصوير المجهري المرنة تعبيد

    1. إصلاح الخلايا المزروعة في اللدائن مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. شطف مع 3 مل من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل ووضع المطاط الصناعي مع الخلايا الثابتة في صحن الثقافة مع ساترة المرفقة.
      تحذير: PFA سامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
    2. ستافي عينات ثابتة بنسبة 0.1٪ من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    3. على الفور صورة اللدائن باستخدام متحد البؤر المجهري مع دابي مضان، والحصول على مداخن صورة التي تمتد العينة.
      ملاحظة: هنا، تم الحصول على مداخن صورة باستخدام الهدف 20X 60X وهدف.
    4. تحليل مداخن البصرية صورة متحد البؤر باستخدام يماغيج 32.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين هذا التقرير طريقة إعداد LCE 3D التي يسهل اختراقها كما سقالة للثقافة الخلية باستخدام قالب معدن النيكل. يدل على 3D LCE حصلت شبكة معقدة متداخلة القناة التي تسمح للتسلل خلية سهلة، وكذلك النقل الجماعي أكثر ملاءمة 27. وجد أن الخلايا قادرة على اختراق كامل شبكة قناة مترابطة وهي أيضا قادرة على محاذاة داخل LCE. هنا، رغوة النيكل المعدنية (99٪ نيكل، كثافة 860 غرام / سم 2) وقد تم اختيار التالية نهجا مماثلا لإعداد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم مؤخرا دراسة اللدائن البلورية السائلة كما السقالات خلية حيويا بسبب استجابتها المحفزات. وقد ثبت أنها تكون منصات مثالية كما السقالات الخلية. ومع ذلك، عامل مهم أن نأخذ في الاعتبار عند إعداد وتصميم سقالة LCE جديدة غير المسامية. إدراج المواد الصلبة القابلة للترشح 23 أو الغازات لا يؤدي دائما في المسامية متجانسة أو المسام مترابطة تماما. استخدام قالب المعادن التي يمكن أن يكون محفورا من لا يقدم فقط فرصة أن يكون لها هيكل داخلي أكثر تنظيما ومنتظم، ولكنه يسمح أيض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر جامعة كينت ستيت (تعاوني منحة بحثية ودعم مبادرة لطب التجديدي في ولاية كينت - ReMedIKS) للدعم المالي من هذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyltriethoxysilaneAlfa AesarL16606عامل السيلانة
2-مكرر (4-هيدروكسي سيكلوهكسيل) البروبانTCIB0928 < / a>كاشف
2-كلوروهكسانون   ؛Alfa AesarA18613كاشف
2-هيبتانون سيجما ألدريتشW254401المذيب
2-بروبانول  سيجما ألدريتش278475مذيب
3-حمض الكلوروبيربنزويك ، كاشف m-CPBASigma Aldrich273031
4-dimethylaminopyridineAlfa AesarA13016Reagent
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole، DAPI InvitrogenD1306وصمة عار نووية
5-حمض الهيكسينويك  Alfa AesarB25132-06كاشف
حمض الخليكVWR36289مذيب
الأسيتونسيجما ألدريتش34850كحول مذيب
200 دليل على ACS الصف   ؛VWR71001-866كاشف
البنزينألفا إيسارAA33290المذيب
&epsilon ;-caprolactone Alfa AesarA10299-0Eكاشف
الكلوروفورمVWRBDH1109مذيب
الكوليسترولسيجما ألدريتشC8503كاشف
الكروم (السادس) أكسيدسيجما ألدريتش232653كاشف
النحاس (I) يوديدستريم كيماويات100211-060كاشف
< م > < م > ، < م > لتر < / م > لاكتيد Alfa AesarL09026كاشف
ثنائي كلورو الميثانسيجما ألدريتش320269مذيب
ثنائي إيثيل الأثير  EMD MilliporeEX0190المذيب
< م > N ، N < / em > - ثنائي ميثيل فورماميدسيجما ألدريتش270547المذيب
Dulbecco ' s تعديل النسر المتوسط, DEME CORNING Cellgo10-013خلية
الوسائط الإيثانولAlfa Aesar33361مذيب
الفورمالديهايد  SIGMA Life ScienceF8775مصل
بقري الجنين المثبت ، FBS   ؛ورق ترشيح HyCloneSH30071.01Media Component
، الصف 415 ، نوعي ، كريبVWR28320ترشيح
الجلسرينSigma AldrichG5516العقدة المركزية (3 أذرع)
هيكساميثيلين ثنائي أيزوسيانات ، HDISigma Aldrich52649Crosslinker
Iron (III) كلوريد   ؛Alfa Aesar12357عامل النقش
كحول الأيزوبروبيلVWRBDH1133مذيب
الميثانولAlfa AesarL13255المذيب
< م > N ، N < / em > ثنائي سيكلوهيكسيل كاربوديميدألدريتشD80002المذيب
< م > N ، N < / em > ثنائي ميثيل فورماميدسيجما ألدريتش270547المذيب
قالب معدني النيكلالعناصر الأمريكيةNi-860قالب رغوة
خلايا الأورام الأرومية العصبية (SH-SY5Y)ATCCCRL-2266خط الخلية
البنسلين ستربتومايسين   ؛المضادات الحيوية15140122الحرارية العلمية
البولي إيثيلين جلايكول 2000 ، PEGAlfa AesarB22181كاشف
أزيد الصوديوم   ؛VWR97064-646كاشف
بيكربونات الصوديومAMRESCO865ملح التجفيف
كلوريد الصوديومBDHBDH9286ملح التجفيف
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدراتفيشر ScientificS-374ملح التجفيف
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات أحادي القاعدةSigma AldrichS9638ملح التجفيف
كبريتات الصوديومسيجما ألدريتش239313ملح التجفيف
رباعي هيدروفورانألفا إيسار41819مذيب
ثيوسلفات دي الصوديومAMRESCO393ملح التجفيف
القصدير (II) 2-إيثيل هيكسانواتألدريتشS3252كاشف
تولوينألفا إيسار22903مذيب
ثلاثي إيثيل أمينسيجما ألدريتش471283كاشف
التربسينHyCloneSH30042.01انفصال الخلية
أوليمبوس FV1000

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة