مقالة منهجية

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

DOI:

10.3791/55812

⸱

يونيو 14, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة الإجراء التجريبي وتحليل البرمجيات لمقايسة موقع التكامل ثنائية الاتجاه التي يمكن أن تحلل في وقت واحد المنبع والمصب ناقلات الحمض النووي تقاطع المضيف. يمكن استخدام منتجات ير ثنائية الاتجاه لأي منصة تسلسل المصب. البيانات الناتجة هي مفيدة لمقارنة عالية الإنتاجية، الكمية من أهداف الحمض النووي متكاملة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد مقايسات التكامل (إس) عنصرا حاسما في دراسة مواقع تكامل الفيروسة الرجعية وأهميتها البيولوجية. في دراسات العلاج الجيني للفيروسات الرجعية الأخيرة، استخدمت مقايسات إس، بالاقتران مع تسلسل الجيل التالي، كأداة تتبع الخلايا لتوصيف سكان الخلايا الجذعية النسيلي الذين يتقاسمون نفس الشيء. لمقارنة دقيقة من استنساخ الخلايا الجذعية ريبوبولاتينغ داخل وعبر عينات مختلفة، حساسية الكشف، استنساخ البيانات، والقدرة الإنتاجية العالية للمقايسة هي من بين الصفات فحص الأكثر أهمية. ويوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا وسير عمل تحليل البيانات لتحليل إس ثنائي الاتجاه. المقايسة ثنائية الاتجاه يمكن أن تتسلسل في وقت واحد كل من المنبع والمصب تقاطعات ناقلات المضيف. وبالمقارنة مع النهج التقليدية لتسلسل إس أحادي الاتجاه، فإن النهج ثنائي الاتجاه يحسن إلى حد كبير معدلات الكشف عن داعش وتوصيف أحداث التكامل عند طرفي tانه يستهدف الحمض النووي. ويحدد خط أنابيب تحليل البيانات الموصوفة هنا بدقة وتعدد متواليات إس المتطابقة من خلال خطوات متعددة من المقارنة ترسم متواليات إس على الجينوم المرجعي وتحدد أخطاء التسلسل. باستخدام إجراء الفحص الأمثل، قمنا مؤخرا بنشر أنماط إعادة إحياء مفصلة الآلاف من الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسك) استنساخ التالية زرع في ماكاك ريسوس، مما يدل للمرة الأولى على نقطة زمنية دقيقة من إعادة التركيب هسك والتغاير الوظيفي ل هسس في نظام الرئيسيات. يصف البروتوكول التالي الإجراء التجريبي خطوة بخطوة وسير العمل تحليل البيانات التي تحدد بدقة وتحدد متواليات إس متطابقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات القهقرية تدخل الحمض النووي الجيني في الجينوم المضيف في مواقع مختلفة. هذه الخاصية الفريدة من نوعها، والتي قد تسهم في تطوير السرطانات وغيرها من أشكال المرضية الفيروسية، لديها فائدة سخرية من جعل هذه الفيروسات قابلة للتحويل إلى الهندسة الخلوية للعلاج الجيني والبحوث البيولوجيا الأساسية. موقع التكامل الفيروسي (إس) - الموقع على الجينوم المضيف حيث يتم دمج الحمض النووي (الفيروس) الأجنبية - له آثار هامة على مصير كل من الفيروسات المتكاملة والخلايا المضيفة. وقد استخدمت مقايسات إس في مختلف البيئات البحثية البيولوجية والسريرية لدراسة اختيار موقع الاندماج الفيروسي والامراض، وتطوير السرطان، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، وعلم الأحياء التنموي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . حساسية الكشف منخفضة، ضعف استنساخ البيانات، ومتكررة انتقال التلوث هي من بينالعوامل الرئيسية التي تحد من تطبيق مقايسات داعش على الدراسات الحالية والمخطط لها.

وقد تم تطوير العديد من تقنيات تحليل نظم المعلومات. مقايسات موقع الانزيم القائم على الانزيم، بما في ذلك تفاعلات البوليميراز المتسلسل (لم) 5 ، عكس ير 6 ، والخطي التضخيم بوساطة (لام) ير 7 ، هي الأكثر استخداما على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن استخدام إنزيمات تقييد موقع معين يولد تحيزا خلال استرجاع داعش، مما يسمح فقط لمجموعة فرعية من إنتغرومز (الحمض النووي الأجنبي دمجها في الجينوم المضيف) في محيط موقع تقييد ليتم استردادها 4 . وقد أدخلت أيضا تقنيات الفحص التي تقيِّم أكثر شمولا ناقلات إس في السنوات الأخيرة. هذه المقايسات توظيف استراتيجيات مختلفة، بما في ذلك مو بوساطة ترانسبوسون ير 8 ، نونستريكتيف (نر) -LAM ير 9 ، نوع إي تقييد انزيم- مهضم 10 ، القص الميكانيكية 11 ، و ير القائم على هيكسامر ير (إعادة خالية ير) 12 ، لتجزئة الحمض النووي الجيني وتضخيم إس. التكنولوجيات الحالية لديها مستويات مختلفة من حساسية الكشف، وتغطية الجينوم، وخصوصية الهدف، والقدرة الإنتاجية العالية، وتعقيد إجراءات الفحص، والتحيز في الكشف عن الترددات النسبية للمواقع المستهدفة. ونظرا للصفات المتفاوتة للمقايسات الحالية ومجموعة متنوعة من الأغراض التي يمكن استخدامها، ينبغي اختيار نهج الفحص الأمثل بعناية.

ويوفر هذا العمل إجراءات تجريبية مفصلة وسير العمل تحليل البيانات الحاسوبية لمقايسة ثنائية الاتجاه التي تحسن إلى حد كبير معدلات الكشف وتسلسل دقة الكمي من خلال تحليل في وقت واحد من المنبع والمصب من الحمض النووي الهدف المتكامل (انظر الشكل 1 للحصول على وجهة نظر التخطيطي إجراءات الفحص ). ويوفر هذا النهج أيضا(على سبيل المثال، دقة ازدواجية الموقع المستهدف والاختلافات في التسلسلات الجينومية للإضافات في المنبع والمصب). وقد استخدمت طرق ثنائية الاتجاه الأخرى في المقام الأول لاستنساخ وتسلسل كلا طرفي الحمض النووي الهدف 11 ، 13 ، 14 . هذا الفحص هو الأمثل على نطاق واسع لانتاجية عالية والتقدير الكمي استنساخه من استنساخ ناقلات ملحوظ، وذلك باستخدام طريقة لم-ير راسخة ورسم الخرائط التحليل الحاسوبي، ولقياس كم تقاطعات المنبع والمصب. وقد أثبت التحليل ثنائي الاتجاه مع إنزيم تقعي مفيدة لكمية عالية الإنتاجية الكمي في الدراسات الجينية الخلايا الجذعية العلاج قبل السريرية 2 ، 15 . تصف هذه الورقة طريقة معدلة باستخدام القاطع الأكثر تواترا (رساي / كفيكي - موتيف: غاك) الذي يضاعف tانه فرص الكشف عن إنتغرومز مقارنة مقايسة تقيي . يتم وصف إجراءات التحليل التجريبي وتحليل البيانات التفصيلية التي تستخدم إنزيمات غتاك موتيف ل لنتيفيرال (NL4.3 ومشتقاته) و غاما-ريتروفيرال (بمكس ناقلات) ناقلات تحليل إس. وترد أوليغونوكلأوتيدس المستخدمة في الفحص في الجدول 1 . ويرد في البرنامج التكميلي نص برمجي داخلي لتحليل تسلسل نظم المعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد المنبع (يسار) - والمصب (يمين) -junction تسلسل المكتبات

  1. إعداد رابط الحمض النووي:
    1. إعداد 10 ميكرولتر رابط حل الحمض النووي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LINKER_A أوليغوس (النهائي: 20 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LINKER_B أوليغوس (النهائي: 20 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5 M (النهائي: 1M)، و 4 ميكرولتر من المياه نوكليس خالية في أنبوب ير. انظر الجدول 1 لتسلسل الوصلة.
    2. احتضان حل الحمض النووي رابط في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في أداة ير، ووقف تشغيل البرنامج، وتحويل ير أداة خارج السلطة. ترك حل رابط في الصك لمدة 30 دقيقة لتبريد ببطء دنا رابط. يمكن تخزين حل الحمض النووي رابط في 4 درجات مئوية.
  2. لتر محددة البيوتين التمهيدي التمديد:
    1. استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي لتحديد تركيز الحمض النووي وقيم 260/280 نانومتر من الحمض النووي الجيني من في الجسم الحيأو في التجارب المختبرية. تمييع 1-2 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الجيني إلى الحجم النهائي من 170 ميكرولتر من حل الحمض النووي الجيني باستخدام المياه نوكليس خالية.
    2. إعداد 200 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر هيف-1 محددة البيوتين الاشعال (L- بس و R-بس في الجدول 1 : مجموعه 10 ميكرولتر لأربعة الاشعال للفيروسات محددة)، 20 ميكرولتر من 10X ترموستابل الحمض النووي البلمرة العازلة، 4 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 3 ميكرولتر من 2.5 U / ميكرولتر الحمض النووي البلمرة الحمض النووي، و 163 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني.
      ملاحظة: لنواقل غاماريتروفيرال (ناقلات بمكس)، واستخدام 5 ميكرولتر كل من اثنين 10 ميكرومتر بمكس الاشعال البيوتين محددة (L-بب و R-بب: ما مجموعه 10 ميكرولتر) بدلا من أربعة الاشعال البيوتين هيف-1 محددة أعلاه.
    3. تقسيم الحل إلى أربعة أنابيب ير (كل 50 ميكرولتر) وتنفيذ دورة تمديد واحدة تحت الشرط التالي: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 56 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 72 درجة مئوية لمدة 5دقيقة، و 4 درجة مئوية للتخزين.
    4. تجمع جميع ردود الفعل ير أربعة إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل واتبع إجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من العازلة شطف (5 أضعاف المياه المخفف شطف عازلة المنصوص عليها في عدة). المضي قدما فورا مع الخطوة 1.3.1 أو تخزين الحمض النووي إلوتد في -20 درجة مئوية.
  3. رساي و كفيكي الهضم
    1. إعداد 100 ميكرولتر رد فعل الهضم بإضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي (من الخطوة 1.2.4)، 10 ميكرولتر من 10X العازلة A، و 2 ميكرولتر (20 U) من إنزيم رساي. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير.
    2. إضافة 1 ميكرولتر (10 U) من إنزيم كفيكي إلى رد فعل واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في أداة ير. الشروع فورا في الخطوة 1.4.1
  4. نهاية حادة:
    1. إعداد خليط 4.5 ميكرولتر تحتوي على 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي البلمرة أنا كبير (كلينو) جزء و 2 ميكرولتر من 10 مل دنتبس. النقل 181؛ L من الخليط إلى عينة الحمض النووي من الخطوة 1.3.2. وسوف يكون حجم الكلي 102 ميكرولتر. مزيج جيدا من فورتيكسينغ واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. الشروع فورا في الخطوة 1.6.1.
  5. إعداد الخرز ستريبتافيدين:
    1. باختصار دوامة الحل حبة ستريبتافيدين ونقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل جديد. إزالة طاف باستخدام موقف المغناطيسي وغسل الخرز مع 200 ميكرولتر من حل ملزم.
    2. ريسوسبيند الخرز في 100 ميكرولتر من حل ملزمة ووضع أنبوب بعيدا عن موقف المغناطيسي. الشروع فورا في الخطوة 1.6.1.
  6. ستريبتافيدين حبة ملزمة:
    1. نقل 100 ميكرولتر من الحمض النووي عينة (الخطوة 1.4.1) إلى 100 ميكرولتر إعادة تعليق حبة الحل (الخطوة 1.5.2) وتخلط بعناية عن طريق بيبتينغ لتجنب أي رغوة من الحل. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على عجلة دوارة أو الأسطوانة.
    2. استخدام موقف المغناطيسي لالتقاط الخرز وتجاهل طاف. غسل الخرز مرتين في 400 ميكرولتر من محلول الغسيل ومرتين في 400 ميكرولتر من 1X T4 الحمض النووي ليغاز العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه).
    3. ريسوسبيند الخرز في 200 ميكرولتر من 1X T4 الحمض النووي ليغاز العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه) ووضعه بعيدا عن موقف المغناطيسي. الشروع فورا في الخطوة 1.7.1.
  7. ربط الرابط:
    1. إعداد 400 ميكرولتر حل رد فعل ربط في أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل عن طريق خلط 0.5 ميكرولتر من رابط الحمض النووي (الخطوة 1.1.2)، 10 ميكرولتر من 10X T4 دنا يغاز العازلة، 20 ميكرولتر من 5X T4 الحمض النووي يغاز العازلة (التي تحتوي على 25٪ البولي ايثيلين غليكول)، 5 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4، 164.5 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس، و 200 ميكرولتر من الخرز إعادة تعليق (الخطوة 1.6.3). وضع أنبوب التفاعل على عجلة الدورية واحتضان في رت (22 درجة مئوية) لمدة 3 ساعات (أو 16 ° كو / N).
    2. غسل حبات مرتين مع حل الغسيل ومرتين مع 1X عازلة الحمض النووي البلمرة العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه) باستخدام موقف المغناطيسي.
    3. ريسوسبيند الخرز في 50 ميكرولتر من 1X الحمض النووي البلمرة ير البلمرة العازلة ووضعه بعيدا عن موقف المغناطيسي. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.8.1 أو تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يوم واحد.
  8. قبل التضخيم من كل من الحمض النووي مفترق اليسار واليمين:
    1. إعداد 200 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 1L التمهيدي، 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 1R التمهيدي، 20 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي Link1 (الجدول 1)، 10 ميكرولتر من 10X عازلة الحمض النووي البلمرة عازلة، 4 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 8 ميكرولتر (20 U) البوليميراز الحمض النووي الحرارية، و 88 ميكرولتر من المياه نوكليس خالية من الخرز إعادة تعليق (50 ميكرولتر) من الخطوة 1.7.3.
    2. قسامة خليط التفاعل في 4 أنابيب ير (كل 501؛ L) وتنفيذ ير مع الشرط التالي: 94 درجة مئوية الحضانة لمدة 2 دقيقة. 25 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. بركة كل 4 ردود الفعل ير إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل واتبع إجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة.
    4. تحديد تركيز الحمض النووي و 260/280 نانومتر القيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي. يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للخطوة التالية. المضي قدما في الخطوات 1.9.1 / 1.10.1 (اختياري) أو مباشرة مع الخطوات 1.11.1 / 1.12.1.
  9. إزالة الجانب الأيسر الداخلي أمبليكون الحمض النووي (اختياري):
    1. نقل ما يصل إلى 100 نانوغرام من ير الحمض النووي المنتج من الخطوة 1.8.4 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل وضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر باستخدام المياه نوكليس خالية.
    2. إعداد رد فعل انزيم تقييد تستهدف على وجه التحديد الجانب D الداخلي من الجانب الأيسرنا أمبليكون.
      ملاحظة: قد تختلف حالة رد الفعل اعتمادا على اختيار الانزيم. على سبيل المثال، عند إزالة الحمض النووي الداخلي من الجانب الأيسر من ناقلات لنتيفيرال القائم على NL4.3، إضافة 1 ميكرولتر من بويي ، 2 ميكرولتر من العازلة B، و 7 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس . احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.11.1 أو تخزين في -20 درجة مئوية.
  10. إزالة الجانب الأيمن من الحمض النووي الداخلي أمبليكون (اختياري):
    1. المضي قدما كما هو الحال في الخطوة 1.9.1.
    2. إعداد رد فعل انزيم تقييد تستهدف على وجه التحديد الجانب الأيمن من أمبليكون الحمض النووي الداخلي.
      ملاحظة: على سبيل المثال، عند إزالة الحمض النووي الداخلي الجانب الأيمن من ناقلات لنتيفيرال القائم على NL4.3، إضافة 1 ميكرولتر من سفوي ، 2 ميكرولتر من العازلة B، و 7 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس . احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.12.1 أو تخزين في -20 درجة مئوية.
  11. اليسارالتضخيم -junction محددة:
    1. إعداد 50 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق خلط 5 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 1.8.4 (أو من الخطوة الاختيارية 1.9.2)، 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 2L التمهيدي (النهائي: 1 ميكرومتر)، 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي Link2 (النهائي: 1 ميكرومتر)، 5 ميكرولتر من 10X العازلة الحمض النووي البلمرة الحرارية، 1 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 2 ميكرولتر (5 U) من البوليميراز الحمض النووي، و 27 ميكرولتر من نوكليس خالية ماء.
    2. تنفيذ ير مع الشرط التالي: 94 درجة مئوية الحضانة لمدة 3 دقائق. 8-15 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي تضخيم في -20 درجة مئوية. * يقترح رقم دورة الأمثل.
    3. اتبع الإجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة. تحديد تركيز الحمض النووي والقيم 260/280 نانومتر.
  12. تضخيم خاص بمفتاح معين:
    1. جميع الإجراءات متطابقة مع "التضخيم-- تقاطع-- محددة التضخيم" (الخطوات 1.11.1-1.11.3)، باستثناء استخدام الاشعال مختلفة؛ استخدام التمهيدي الحق تقاطع محددة (2R التمهيدي، انظر الجدول 1 ) في هذه الخطوة.
  13. ير أمبليكون طول اختبار الاختلاف:
    1. تحليل ير الاختلافات أمبليكون طول عن طريق أداء 2٪ الاغاروز هلام الكهربائي أو الشعري الكهربائي ( الشكل 2 ).
      ملاحظة: هذا هو خطوة أساسية لتأكيد الانتهاء من إجراءات الفحص وإجراء تقييم تقريبي لأنماط إس استنادا إلى أنماط الفرقة ير. ويمكن استخدام أمبليكون ير المنقى من الخطوات 1.11.3 و 1.12.3 لمختلف منصات تسلسل الحمض النووي. المضي قدما في إجراءات إعداد العينات المناسبة لسلسلة الكلاسيكية إنهاء (سانجر) التسلسل أو الجيل القادم التسلسل. قد يتم تخزين الحمض النووي في -20 درجة. C.

2. التحليل التسلسلي إس التسلسل

  1. إعداد ملفات البيانات:
    1. إعداد ثلاثة ملفات بيانات المدخلات: ملف البيانات تسلسل صيغة فاستا (Test_data.fa في البيانات التكميلية)، ملف تسف لعناصر البحث عن المتجهات و لينكر تسلسل (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv في البيانات التكميلية)، وملف تسف لتقييد المعلومات انزيم (Enzyme.tsv في البيانات التكميلية).
      ملاحظة: مطلوب هذه الملفات ل ديمولتيبليكسينغ، وتقليم ناقلات وتسلسل رابط، وإزالة متواليات ناقلات الداخلية ( الشكل 3A ). يتم تقديم تعليمات مفصلة خطوة بخطوة لتنفيذ سير العمل الحسابي في ملف README.txt في البيانات التكميلية.
  2. التحليل الحسابي:
    1. تشغيل ديمولتيبليكسينغ وتقليم البرامج النصية.
      ملاحظة: سيتم معالجة تسلسل الخام لإزالة ديمولتيبليكسينغ و تريمينg من المتجهات، لينكر، وتسلسل التمهيدي (انظر ستيب-1 في ملف README.txt التكميلي).
    2. تشغيل الأمر تعيين (انظر الخطوة 2 في ملف README.txt) لتعيين تسلسل معالجتها على الجينوم المرجعي باستخدام أداة محاذاة بلاست (بلات؛ www.genome.ucsc.edu).
    3. تشغيل النص البرمجي تحليل إس الكمي (انظر الخطوة 3 في الملف README.txt).
      ملاحظة: سيتم إنشاء ملفي إخراج (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt و final_count.txt). ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن استراتيجيات رسم الخرائط والتسلسل في "الملف README.txt في البيانات التكميلية وفي المنشورات السابقة 2 ، 15 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبار ثنائي الاتجاه إس ولدت أحجام مختلفة من أمبليكونس ير لكل من المنبع (يسار) والمصب (يمين) تقاطع المضيف ناقلات ( الشكل 2 ). حجم أمبليكون ير يعتمد على موقع أقرب عزر غتاك المنبع والمصب من إنتغروم. وأنتج الفحص أيضا أمبليكونس ير الحمض النووي الداخلية: تسلسل فيروسات بالقرب من المسالك المتعددة البوليبور وموقع التمهيدي ملزمة تم تضخيمها في نفس الوقت خلال اليسار واليمين تقاطع ير، على التوالي. يمكن تصور العصابات أمبليكون ير من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقايسة ثنائية الاتجاه تمكن التحليل المتزامن لكلا من تسلسل تقاطع الحمض النووي في اتجاه المنبع (يسار) والمصب (يمين) المضيف المضيف، ومفيد في عدد من العلاج الجيني، والخلايا الجذعية، وتطبيقات البحوث السرطان. استخدام الانزيمات موتيف غتاك (رساي و كفيكي) ونهج ير ثنائي الاتجاه يحسن بشكل كبير من فرص الكشف عن إنتغروم (أو السكان النسيلي) عند مقارنته مع تسا-عزف السابقة المقايسات القائم على تقي 2 ، 15 وغيرها أحادي الاتجاه لم-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R00-HL116234، U19 AI117941، و R56 HL126544؛ مؤسسة العلوم الوطنية منحة دمس-1516675؛ المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (نرف-2011-0030049، نرف-2014M3C9A3064552)؛ وبرنامج مبادرة كريب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارةAgilent600424PicoMaxx Polymerase
عازلة بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارةAgilent600424PicoMaxx Polymerase Buffer
Deoxynucleotide (dNTP) مزيجنيو إنجلاند BiolabsN0447LdNTP (10 ملي مولار لكل منهما)
أنابيب PCRالشريط VWR International53509-304PCR مع الأفراد أغطية مرفقة
2 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق المنتجات الحيوية الجزيئية3453أنابيب الطرد المركزي الدقيقة
طقم تنقية PCRQiagen28106
RsaI  ؛إنزيم تقييد نيو إنجلاندبيولابس R0167L
CviQIنيو إنجلاند بيولابسR0639Lإنزيم التقييد
العازلة Aنيو إنجلاند بيولابسB7204SNEB CutSmart العازلة
DNA Polymerase I جزء كبير (klenow)  نيو إنجلاند BiolabsM0210LBlunting
streptavidin حل الخرزInvitrogen  60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
حل ملزمةInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
محلول الغسيلInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
حامل مغناطيسيThermoFisher12321DDynaMag & trade ؛ -2 مغناطيس
T4 DNA ligaseنيو إنجلاند بيولابيسM0202LT4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase bufferNew England BiolabsB0202ST4 DNA ligase تفاعل عازلة
5X T4 DNA ligase bufferInvitrogen   ؛46300-018T4 DNA ligase buffer مع البولي إيثيلين جلايكول -8000
UV-Vis مقياس الطيف الضوئيفيشر ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIIنيو إنجلاند BiolabsR0151Lإنزيم التقييد
sfoIجديد إنجلاند BiolabsR0606Lإنزيم التقييد
Buffer Bنيو إنجلاند BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
الحمض النووي المتكاملةللمياهالخالية من النوكليز 11-05-01-14
الرحلان الكهربائي الشعريQiagen9001941QIAxcel الرحلان الكهربائي الشعري
Veriti 96 بئر سريع التدوير الحراريفيشر 4375305 PCRأداة
عجلة دوارة (أو أسطوانة)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
حجم الحمض النووي علامةQiagen929559حجم QX (100 - 2,500 نقطة أساس)
حجم الحمض النوويQiagen929554حجم QX (50 - 1,500 نقطة أساس)
علامات محاذاة الحمض النوويQiagen929524QX علامة محاذاة الحمض النووي
الحمض النوويغير متوفرعينةمن الحمض النووي الجيني من التجارب في الجسم الحي أو في المختبر
محلول أنابيب تقنيات الحراري علامة علامة علامة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150(1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543(2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284(2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة