مقالة منهجية

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

DOI:

10.3791/55903

⸱

يونيو 16, 2017

 ,  , 
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التطورات الحديثة في القدرة على التلاعب وراثيا خطوط الخلايا الجسدية تنطوي على إمكانات كبيرة للبحوث الأساسية والتطبيقية. هنا، نقدم نهجين ل كريسبر / Cas9 ولدت إنتاج خروج المغلوب وفحص في خطوط الخلايا الثدييات، مع وبدون استخدام علامات للاختيار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أحدث نظام هندسة الجينوم كريسبر / Cas9 ثورة في علم الأحياء من خلال السماح بالتحرير الدقيق للجينوم مع القليل من الجهد. يسترشد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سغرنا) التي تمنح خصوصية، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في المكان المستهدف. يمكن أن يؤدي دنا كسر إما غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) أو التماثل الموجهة إصلاح (هر). يمكن أن نيج إدخال الحذف الصغيرة أو الإدراج التي تؤدي إلى الطفرات التحول الإطار، في حين أن تقرير التنمية البشرية يسمح للاضطرابات أكبر وأكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من خلال اقتران أسس أساليب كريسبر / Cas9 مع خيارين لاختيار / المصب المصب. نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار مستقل الفرز، حيث يتم تقييم إنتاج البروتين من قبل نقطة إمونوبلوت بطريقة عالية الإنتاجية. يستخدم نهج تقرير التنمية البشرية اثنين من المواقع سغرنا قطع التي تمتد الجين من الفائدة. جنبا إلى جنب مع قالب هر المتاحة، يمكن لهذه الطريقة تحقيق الحذفمن عشرات كيلو بايت، بمساعدة من علامة المقاومة للاختيار المدرجة. وتناقش التطبيقات والمزايا المناسبة لكل طريقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوفر التعديلات الوراثية المستقرة ميزة على الطرق العابرة للاضطرابات الخلوية، التي يمكن أن تكون متغيرة في كفاءتها ومدتها. أصبح التحرير الجينومي شائعا على نحو متزايد في السنوات الأخيرة بسبب تطور نوكليسيس محددة الهدف، مثل نوكليسيس الزنك الاصبع 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، النسخ المنشط مثل نوكليسيس المستجيب (تالينس) 6 ، 7 ، 8 ، 9 و نوكليسيس الموجهة من الحمض النووي الريبي المستمدة من متفاوتة، متداخلة بانتظام يتكرر متناوب قصيرة (كريسبر) النظام 10 .

يتم تعديل آلات التحرير كريسبر / Cas9 من جهاز المناعة التي البكتيريا واستخدام الحفريات للدفاع ضد العدوى الفيروسيةأس = "كريف"> 11 ، 12 ، 13 . في هذه العملية، يتم دمج قصيرة، 20-30 نت أجزاء من تسلسل الفيروسية الغازية في مكان الجينومية كما "الفواصل" يحيط بها وحدات تكرار 14 ، 15 . النسخ اللاحق وتجهيز الحمض النووي الريبي يولد الرنا الصغيرة المرتبطة كريسبر 16 (كرناس) أنه، جنبا إلى جنب مع الحمض الريبي النووي النقال عبر تفعيل 17 (تراكرنا)، والتجمع مع المستجيب إندوسلياز كاس 9. وبالتالي فإن الحمض الريبي النووي النووي توفر خصوصية لاستهداف Cas9، وتوجيه المجمع لتسلسل تسلسل الحمض النووي الفيروسي التكميلي ومنع المزيد من الإصابات 18 ، 19 . أي تسلسل "بروتسباسر" في الحمض النووي المستهدف يمكن أن تكون بمثابة مصدر للحمض الريبي النووي الذواب، طالما أنها مباشرة 5 'إلى بروتسباسر قصيرة عزر المجاورة (بام)، نغ في حالة S. القيثريات Cas9 20. عدم وجود تسلسل بام بالقرب من فاصل في المكان المضيف كريسبر يميز بين الذات وغير الذاتي، ومنع استهداف المضيف. بسبب عالميتها ومرونتها، وقد تم تكييف هذا النظام البيولوجي بقوة لتعديل الجينومية، بحيث أن ما يقرب من أي موقع الحمض النووي المجاورة بام يمكن استهدافها. في هذا الإصدار، تعديل تنصهر مزيد من الحمض الريبي النووي الذواب و تراكرنا إلى عنصر واحد رنا (سغرنا) المكون الذي يتم تحميله في البروتين Cas9 21 .

عند التعبير عن Cas9 و سغرنا في خلايا حقيقيات النواة، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في الموضع المستهدف. في غياب منطقة مناسبة من تسلسل مثلي، الخلية بإصلاح هذا كسر عبر غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) 22 ، 23 ، 24 ، والتي عادة ما يقدم الحذف الصغيرة أو، نادرا، والإدراج. عند استهداف فتحإطار القراءة، والإصلاح المرجح أن يؤدي إلى فرامشيفت متعدية التي تنتج منتج البروتين غير وظيفية. في المقابل، عندما قدمت مع قالب خارجي مع مناطق واسعة من التماثل، والخلية قد إصلاح كسر مزدوج حبلا عن طريق التماثل الموجه إصلاح 25 ، 26 . هذا الطريق يسمح لحذف دقيقة أكبر، واستبدال أو الإدراج في الجينوم، إلى جانب إدخال علامات اختيار قابلة للإعجاب 27 .

هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من قبل أي من هذين الأسلوبين كريسبر / Cas9 ( الشكل 1A ). نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار الاختيار المستقل، وبالتالي يتطلب إعداد مقدما قليلا. عند استخدام هذا الأسلوب، دليل رنا مكملة ل إكسونس بالقرب من نهاية 5 'من النص، والتي من المرجح أن تنتج خروج المغلوب، يجب أن تصمم. منذ موديفيكاتالأيونات إلى الجينوم في هذه الحالة هي صغيرة، ويستند فحص لاستنساخ خروج المغلوب على البقع نقطة، حيث يتم تقييم المنتج البروتين بطريقة عالية الإنتاجية. نحن نستخدم الجيل من 1-بروتين (ELAVL1) خطوط خروج المغلوب إيلاف كمثال على ذلك. النهج الثاني يعتمد على التماثل الموجه إصلاح (هر) ويستخدم اثنين من سغرنا قطع المواقع التي تمتد الجين أو المنطقة من الفائدة، مما يسمح لحذف عشرات من كيلو بايت. A البلازميد مع منطقتين من التماثل التي تحيط مواقع الانقسام يوفر قالب بديل ( الشكل 1B )، وإدخال علامة المقاومة للاختيار الذي يزيد من كفاءة توليد خروج المغلوب. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لإدخال تعديلات الجينات مع الأسلحة التماثل مصممة بشكل صحيح. في هذه الحالة، ودمج جزء جديد من الحمض النووي يسمح لفحص ير القائم ( الشكل 1C ). هنا، ونحن نستخدم جيل من أفراد الأسرة بميليو رنا ملزمة ملزمة 2 (PUM2) خطوط خروج المغلوب كمثال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحديد مناطق التماثل حول الحذف المطلوب

ملاحظة: ضروري فقط في حالة استخدام التحرير القائم على التحديد.

  1. حدد منطقتين، في البداية 1.5-2 كيلو بايت، على جانبي المكان الحذف المطلوب، والتي سوف تكون بمثابة الأسلحة التماثل في قالب هر ( الشكل 1A ). تحديد المناطق التي تفتقر بسيي مواقع الاعتراف على أي من حبلا (غتكتك) لتسهيل الاستنساخ. إذا كانت مواقع بساي لا مفر منها، استخدم نوع انزيم مقيد من نوع بديل (بسمبي، سابي، ببسي) وعدل المواقع المقابلة في البلازميد المستلم (pUC19-بساي)، بلاسميد المانح للعلامة المقاومة (بولدن-نيو أو بولدن-هيغرو)، و التماثل الذراع ير المنتج يتدلى.

2. جيل من Cas9-سغرنا التعبير البلازميدات

  1. تحديد موقع (مواقع) الاستهداف للطفرات. لطريقة قطع واحدة، وخالية من الاختيار، الهدف 5 'إكسونس الترميز القريبة لزيادة احتمال عدم فوطفرة وظيفية. بالنسبة لطريقة قطعتين، حدد اثنين من المواقع التي تمتد على قدر كبير من الجين حسب الضرورة.
    ملاحظة: في تجربتنا، يتم إنشاء حذف ما يصل إلى 53 كيلو بايت بكفاءة.
  2. المدخلات 200 إلى 300 نقطة أساس من تسلسل المنطقة المستهدفة في أداة تصميم crispr.mit.edu. للاستنساخ القائم على الاختيار، واستخدام 200-300 نقطة أساس من مناطق التماثل التي تم تحديدها القريبة من لوكوس الحذف ( الشكل 1A ). حدد 2-3 من سغرناس أعلى مرتبة في المنطقة المستهدفة لحساب الاختلافات في نشاطهم، وعزل الحيوانات المستنسخة مستقلة التي لا تشترك في نفس الآثار المحتملة خارج الهدف.
  3. لتصميم أوليغونوكلأوتيدس دوبلكس مع المتراكمة المناسبة لإدراج في البلازميد التعبير، حذف تسلسل بام نهاية (نغ) وإلحاق 5-كاسك المتراكمة تليها G إلى الأعلى حبلا أوليغو. بالنسبة للحصان السفلي قليلا، إلحاق 5-آاك المتراكمة إلى تسلسل الهدف تكملة العكسي، تليها 3'-C، كما إيلمرهف أدناه:
    figure-protocol-1
  4. إدراج أوليغونوكلأوتيدس الاصطناعية المقابلة ل سغرناس في البلازميد pSpCas9 (بب) باستخدام غولدن غيت الاستنساخ 28 كما هو موضح في بروتوكول مختبر تشانغ 29 .

3. الجيل من قالب إصلاح التماثل الموجهة البلازميدات

ملاحظة: ضروري فقط في حالة استخدام التحرير القائم على التحديد. يتكون قالب إصلاح التماثل الموجهة البلازميد من كاسيت المقاومة للأدوية يحيط بها منطقتين التي هي مكملة للجينوم خارج المواقع المستهدفة اثنين سغرنا ( الشكل 1B ).

  1. من مناطق التماثل الأوسع المحددة في الخطوة 1.1، حدد 800-1،000 بب 26 لا أكثر من 5-10 نقطة أساس بعيدا عن مواقع قطع Cas9 تصميم، لتكون بمثابة الأسلحة التماثل ( الشكل 1A ). تأكد من عدم تضمين سغرناموقع الهدف و بام في الأسلحة التماثل، وهذا سوف يسبب كريسبر / Cas9 الانقسام من البلازميد قالب نفسها. إذا كانت الأسلحة التماثل لا تحتوي على مواقع بسي الداخلي، واستخدام مواقع سغرنا بديلة.
  2. ير تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي الجيني باستخدام عالية الدقة الحمض النووي البلمرة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام الاشعال إلى الأمام وعكس مع 5 'تسلسل إضافي الذي يدخل مواقع بسي (غتكتك) وتجاوز فريدة من نوعها على طرفي منطقة التماثل. يجب أن تحتوي على متراكب تسلسل المناسبة لتوليد الصحيح ترتيب التجميع والتوجه، كما هو موضح أدناه ( الشكل 1B ):
    اليسار التماثل الذراع فب المتراكمة: 5 'غتكتكا غك
    اليسار الذراع التناظرية رب رباط: 5 'غتكتكت كاسغ
    ذراع التماثل الأيمن فب المتراكمة: 5 'غتكتكا غك
    ذراع التماثل الأيمن رب يتدلى: 5 'غتكتكت كاك
  3. تحقق الأسلحة التماثل ل أمبليف المناسبةعن طريق الهلام الكهربائي قبل المضي قدما.
  4. تجميع اليمين واليسار منطقة التماثل الذراع مع كاسيت المقاومة في قالب البلازمايد هر من قبل غولدن غيت الاستنساخ 28 . استخدام بولدن-نيو أو بولدن-هيغرو البلازميدات 30 كمصدر لأشرطة المقاومة لوكسب-فلانكيد (لوكسب-بك-نيو-با-لوكسب أو لوكسب-بك-هيغ-با-لوكسب). استخدام pUC19-بساي، وتعديل pUC19 مع مواقع بسي في منطقة الاستنساخ متعددة والقضاء على مواقع بسي في أماكن أخرى، والمتجه المتلقي (المتاحة عند الطلب). استخدم نسبة 1: 1: 1: 1 للإدراج الثلاثة والمتجهات.
    1. إعداد خليط التفاعل التالي 30 :
      حق التماثل الذراع ير المنتج 0.06 بمول (30-40ng)
      اليسار التماثل الذراع ير المنتج 0.06 بمول (30-40ng)
      بولدمن-نيو البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) 1 &# 181؛ L
      pUC19-بساي البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) 1 ميكرولتر
      2X T7 الحمض النووي ليغاز العازلة 5 ميكرولتر
      بساي (10 U / ميكرولتر) 0.75 ميكرولتر
      T7 الحمض النووي ليغاز (3000 U / ميكرولتر) 0.25 ميكرولتر
      ماء تصل إلى 10 ميكرولتر
    2. استخدام المعلمات ثيرمويكلر التالية: 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كرر لمدة 30 دورات.
    3. علاج المنتج الاستنساخ مع إكليوكلياز لكل تعليمات الشركة المصنعة لهضم بعيدا أي الحمض النووي الخطي المتبقية.
    4. تحويل خليط التفاعل إلى سلالة E. القولونية المختصة وفقا للبروتوكول الموردة مع الخلايا، لوحة على الأطباق التي تحتوي على الأمبيسلين.
  5. لتحديد الحيوانات المستنسخة مع التجمع القالب الصحيح، تنفيذ البكتيرياالمستعمرة ير لتضخيم المناطق الفرعية الذراع التماثل من إدراج تجميعها (كما إدراج كله قد تكون كبيرة جدا لتضخيم موثوق بها). استخدام التلميع التمهيدي واحد إلى تسلسل البلازميد المرافقة والتمهيدي الثاني مكمل لحافة كاسيت المقاومة ( الشكل 1B ، تسلسل شائع لكل من نيو و هيغرو إدراج)، وتوليد منتج تعتمد على الجمعية التي هي ما يقرب من 200 نقطة أساس أطول من ذراع التماثل الوارد:
    pUC19-بصال-ليفت: 5 'غكتغتاتغتغغاتغتاغ
    المقاومة-اليسار: 5 'آاغكتكتكاك
    pUC19-بساي-رايت: 5 'غكتاتكاغكتغغا
    المقاومة-اليمين: 5 'آغاكاتاغاغكاتغغ
    1. اختيار المستعمرات البكتيرية مع المسواك العقيمة وتعليق البكتيريا في 20 ميكرولتر المياه. الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتدور باستمرار في الطرد المركزي على الطاولة في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق. مكان فورا على الجليد.
    2. إعداد خليط ير التالية 31 </ سوب>:
      تمييع قالب المستعمرة 1.25 ميكرولتر
      10X العازلة رد فعل طق 1.25 ميكرولتر
      20mM دنتبس 0.25 ميكرولتر
      10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.25 ميكرولتر
      10 ميكرومتر عكس التمهيدي 0.25 ميكرولتر
      طاق البلمرة 0.25 ميكرولتر
      ماء 9 ميكرولتر
    3. استخدام المعلمات ثيرمويكلر التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (95 درجة مئوية 30 ثانية، 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة / كيلو بايت)، كرر لمدة 25 دورات، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. تحقق المنتج ير لحجم أمبليكون الصحيح من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
    5. اختياريا، مينيبريب الحمض النووي البلازميد من المستعمرات الفردية مع الصحيح إدراج حجم وتسلسل ثه المناطق تسلسل بواسطة سانجر التسلسل مع الاشعال التضخيم المذكورة أعلاه.

4. ترنسفكأيشن من مكونات كريسبر في الخلايا المستزرعة

  1. قبل ترنسفكأيشن: ثقافة خلايا T-REx293 في وسائل الاعلام دمم تستكمل مع فبس 10٪ عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
  2. الخلايا لوحة على 6 لوحات جيدا وتنمو إلى ما يقرب من 70٪ كونفلنسي. قم بتضمين بئر للتحكم غير المصرح به.
  3. خلايا ترانسفيكت مع 2.5 ميكروغرام البلازميد الكلي باستخدام بروتوكول ترنسفكأيشن التجارية. في موازاة ذلك، والحفاظ على السيطرة غير مترجمة.
    ملاحظة: طريقة ترنسفكأيشن والكفاءة تختلف تبعا لنوع الخلية. تحديد طريقة ترنسفكأيشن المناسبة للنظام قبل التجربة.
    1. ل ترنسفكأيشن من الخلايا مع التحديد، واستخدام 0.75 ميكروغرام Cas9-سغرنا 1 (قطع اليسار)، 0.75 ميكروغرام Cas9-سغرنا 2 (قطع الحق)، و 1.0 ميكروغرام قالب إعادة التركيب مثلي.
    2. ل ترانسفكتيعلى الخلايا دون اختيار، واستخدام 2.5 ميكروغرام Cas9-سغرنا البلازميد.

5. اختيار المخدرات

  1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وعلاج الخلايا مع الدواء المناسب (نيوميسين / هيغروميسين). إجراء اختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة غير مترجمة يموت (عادة 3-5 أيام للنيو، 7-14 يوما ل هيغرو).
    ملاحظة: استخدام تركيزات 500 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل لنيوميسين و هيغروميسين، على التوالي ل T-REx293 الخلايا. بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى، قد يكون من المفيد إجراء المعايرة السابقة للدواء على الخلايا غير المصابة لتحديد التركيز الفعال.

6. عزل السكان كلونية

  1. تنمو الخلايا إلى 100٪ كونفلنسي في البئر الأصلي بعد الاختيار. خلايا البذور إلى 96 لوحات جيدا في كثافة 0.33 خلايا لكل بئر.
    ملاحظة: البذر ثلاث لوحات 96 جيدا هو نقطة انطلاق جيدة لضمان عزل أكثر من استنساخ واحد صحيح، ولكن قد تكون هناك حاجة أكثر أو أقل ديبتنتهي على سغرنا وكفاءة هر.
  2. مراقبة المستعمرات على مدى 2-4 أسابيع، حتى المستعمرات مرئية للعين. اختيار المستعمرات مرئية مع طرف ماصة معقمة والبذور في الآبار الجديدة لتشجيع النمو أحادي الطبقة. عند استخدام خلايا التعليق، يمكن استخدام أقل كثافة البذر حتى لضمان نسبة أكبر من آبار مستعمرة واحدة.

7. فحص المرشحين

  1. فحص المرشحين دون استخدام اختيار: نقطة وصمة عار
    1. تنمو الحيوانات المستنسخة الفردية إلى 50-100٪ كونفلنسي. طرد أحادي الطبقة من الخلايا عن طريق بيبتينغ داخل البئر.
    2. قسامة 90 ميكرولتر من إجمالي 100 ميكرولتر الحجم إلى أنبوب ميكروسنتريفوج نظيفة. تدور أسفل في 6000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وإزالة وسائل الإعلام، ويليه خلية بيليه في 10 ميكرولتر من 1X تحلل العازلة أو 1X سدز تحميل العازلة (5X: 250 ملي تريس كل درجة الحموضة 6.8، 8٪ سدز، 0.1٪ بروموفينول الأزرق، 40٪ الجلسرين، 100 ملي دت). إضافة 90 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة إلى ما تبقى من الخلايا في ويلل مواصلة الانتشار.
    3. ماصة 1 ميكرولتر من المحللة الخلية على غشاء نيتروسليلوز الجافة لتشكيل نقطة. لطخة كل عينة مرتين على اثنين من الأغشية منفصلة، ​​وخلق اثنين من أنماط متطابقة من العينات.
    4. منع الأغشية في الحليب 5٪ في تبست (تريس مخزنة المالحة + 0.01٪ توين 20: 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 جرام بوكل، 3 جرام قاعدة تريس، ما يصل إلى 1 لتر الماء المقطر، ودرجة الحموضة 7.4) 31 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ( مع هزاز، هنا وطوال الإجراء).
    5. لطخة باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين المستهدف على غشاء واحد، والجسم المضاد الأساسي لبروتين السيطرة (توبولين، غابد، أو أي بروتين آخر لا يتوقع أن تتغير) من جهة أخرى. استخدام التخفيف الأساسي الأجسام المضادة الأولية (0.2 ميكروغرام / مل ل ELAVL1 و 0.1 ميكروغرام / مل ل Pum2 في هذه الحالة) في تبست + 5٪ الحليب. احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. يغسل 3 مرات مع تبست لمدة 5 دقائق.
    7. احتضان كل غشاء مع الأجسام المضادة الثانوية هرب مترافق المناسب في Tبست + 5٪ حليب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. يغسل 3 مرات مع تبست لمدة 5 دقائق.
    9. تطبيق حل الركيزة التوهج (انظر الجدول المواد) التالية تعليمات الشركة المصنعة وصورة الغشاء النشاف على تصوير كيميائي الرقمية.
    10. تحديد كثافة شدة لبروتينات الهدف والسيطرة باستخدام البرنامج المناسب.
    11. القضاء على المرشحين مع انخفاض إشارة البروتين السيطرة، وحساب نسب تطرح الخلفية من الهدف للسيطرة على شدة البروتين للمرشحين المتبقية. حدد المرشحين مع أدنى نسب للمرور ومزيد من التحقق من صحة من قبل لطخة غربية.
  2. فرز المرشحين مع استخدام اختيار: مستعمرة ير
    1. جمع الخلية المحللة باستخدام مجموعة الإعدادية دنا (انظر الجدول المواد ).
      1. تكرار المستعمرات الفردية في 96 بئر جديدة وتنمو حتى 100٪ كونفلنسي.
      2. إزالة وسائل الإعلام من مجموعة واحدة من الحيوانات المستنسخة، أو ريسوسبيند الخلايا في 30 ميكرولتر من العازلة استخراج من عدة. نقل إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل نظيفة.
      3. تسخين الحل إلى 96 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
      4. إضافة 30 ميكرولتر من العازلة الاستقرار من عدة. اخلط جيدا.
    2. تحديد ويلديب و مونوالليك / بياليليك خطوط متحولة من قبل مستعمرة ير.
      1. تصميم مجموعتين منفصلتين من الاشعال ير (للجانب الأيسر والأيمن من الموضع المستهدف) لتضخيم المناطق حول الأسلحة التماثل على أساس إما ناجحة أو غير ناجحة التكامل كاسيت المقاومة ( الشكل 2C ). على كل جانب، استخدم التمهيدي المشترك (الأحمر) أن يلد خارج ذراع التماثل. استخدامه مع التمهيدي اقتران المقابلة التي هي مكملة للتسلسل الذاتية، التي تمتد منطقة التماثل (الأزرق)، لاختبار أليل من نوع البرية. استخدام التمهيدي اقتران آخر، مكملة ل كاسيت المقاومة إدراج (انظر الاشعال في القسم2.3)، لاختبار الطفرة المطلوبة.
      2. (مستحسن) التحقق من صحة مجموعات التمهيدي باستخدام المحللة الخلية من السكان الخلية السائبة اختيار الأصلي، لأنها سوف تحتوي على خليط من كلا وت الأليلات متحولة ( الشكل 2D ).
      3. إعداد خليط التفاعل التالي:
        خلية المحللة 0.5 ميكرولتر
        10x كود العازلة 1.25 ميكرولتر
        25mM MgSO4 0.75 ميكرولتر
        2 مل دنتبس 1.25 ميكرولتر
        10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.375 ميكرولتر
        10 ميكرومتر عكس التمهيدي 0.375 ميكرولتر
        البلمرة كود 0.25 ميكرولتر
        ماء 7.75 ميكرولتر
      4. استخدام الظروف ثيرمويكلر التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، (95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، تم التمهيدي لمدة 10 ثانية، 70 درجة مئوية لمدة 20 ثانية / كيلو بايت) كرر لمدة 25 دورات.
      5. تصور المنتج ير من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
    3. كرر اختبار ير مستعمرة لكل جانب من التكامل المتوقع. تحديد وتوسيع المرشحين التي تظهر وجود التكامل وليس منتج تسلسل الذاتية للمنطقة المحذوفة.
    4. التحقق من صحة المرشحين إيجابية من قبل لطخة غربية و / أو رت-قر.

8. تحقق من طفرة الجينوم بواسطة التسلسل

  1. عزل الحمض النووي الجيني من خطوط الخلايا متحولة عن طريق الفينول استخراج الكلوروفورم 31 .
  2. ير تضخيم المنطقة المستهدفة سغرنا، وذلك باستخدام الاشعال مع 5 'المتراكمة التي تضيف بساي تقييد المواقع إلى كل نهاية.
    ملاحظة: بالنسبة لاستنساخ تحريرها مع تقرير التنمية البشرية، حيث كلا الأليلات قد تكون متطابقة، يمكن تسلسل ير المنتج مباشرة.
  3. استنساخ المنطقة تضخيمها في pUC19-بساي بواسطة الاستنساخ غولدن غيت.
  4. تحويل خليط التفاعل إلى سلالة E. القولونية المختصة.
  5. مينيبريب دنا البلازميد من 6-10 المستعمرات الفردية وتسلسل المنطقة المستنسخة من قبل سانجر التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوليد خطوط خروج المغلوب ELAVL1، كان الأجسام المضادة قوية المتاحة، لذلك تم إجراء تحرير باستخدام سغرناس واحد ( الشكل 1A ، يسار)، تليها نقطة إمونوبلوت. تم ترانزفكتد ثلاث سغرناس بشكل مستقل لمقارنة الكفاءة واستبعاد الآثار المستهدفة في الحيوانات المستنسخة الناتجة. بعد جمع ونشاف الليسيات الخلية من السكان النسيلي على اثنين من الأغشية النتروسليلوز، تم البحث عن البقع لكلا ELAVL1 و PUM2 (كتحكم التطبيع) ( الش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد سمح نظام كريسبر / Cas9 بتوليد كفاءة من التعديلات الجينومية المستقرة، التي توفر بديلا أكثر اتساقا لطرق التلاعب العابرة الأخرى. هنا، قدمنا ​​طريقتين لتحديد السريع من كريسر / Cas9 خروج المغلوب الجينات في خطوط الخلايا الثدييات. كلا الأسلوبين تتطلب القليل من المواد الخلوية، لذلك يمكن أن يتم الاختبار في المراحل المبكرة من الثقافة النسيلي، وتوفير الوقت والكواشف. لزيادة كفاءة كلتا الطريقتين، نوصي اختبار سغرناس متعددة، كما تختلف الكفاءة تبعا للتسلسل والموقع الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يعترفوا جيسيل سانشيز، ميغان لي، وجيسون إستيب للمساعدة التجريبية، و ويفنغ قو و شيمي تشن لتبادل الكواشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المختصة الإشريكية القولونية< / em> الخلايا
البلازميد الإعدادية
pSpCas9 (BB) البلازميدAddgene42230Ran et al.< / em> 2013 ، استنساخ sgRNAs
BbsI إنزيمThermoFisherFD1014Ran et al.< / em> 2013 ، استنساخ sgRNAs
T7 DNA ligaseNEBM0318LRan et al.< / em> 2013 ، استنساخ sgRNAs
Tango BufferThermoFisherBY5Ran et al.< / em> 2013 ، استنساخ sgRNAs
PlasmidSafe exonucleaseEpicenterE3105KRan et al.< / em> 2013 ، استنساخ sgRNAs
Q5 بداية ساخنة عالية الدقة بوليميرازNEBM0494Aتضخيم HA
pUC19-BsaIبلازميد pUC19 المعدل ، موقع BsaI الحالي المتحور وإدخاله موقعان متجهين للخارج بعد هضم BamHI / EcoRI
pGolden-NeoAddgene51422كاسيت المقاومة
pGolden-HygroAddgene51423كاسيت المقاومة
BsaI إنزيمNEBR3535Sبناء ذراع التماثل
T7 DNA ligaseNEBM0318L
PlasmidSafe exonucleaseEpicenterE3105K
أعوادالبكتيرية PCR
Taq البوليميرازمستعمرة البكتيرية PCR
HEK293 الخلايا
DMEMCorning10-013-CV
FBSCorningMT35010CV
Penicillin-Strep (اختياري)Gibco15140-122
6 ألواح آبارBioLite12556004
TransIT-LTI كاشف التعداءMirusMIR2300لشفط الدهون فقط
Opti-MEMThermoFisher31985062لشفط الدهون فقط
G418 (Neomycin)Sigma AldrichA1720-5G
HygromycinSigma AldrichH3274-250MG
96 لوحة بئرThermoFisher12556008
Passive Lysis Buffer ، 5xPromega
1x SDS تحميل وصفة عازلةموصوفة في بروتوكول
غشاء النيتروسليلوزBio-Rad162-0115
TBSTوصفة موصوفة في بروتوكول
الحليب المجفف
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermoFisher34075للأجسام المضادة الثانوية المترافقة ب HRP
Extracta DNA prep ل PCRQuantabio95091-025
KOD polymeraseNovagen71316
الأسنان البشرية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة