ويتألف من مناطق متميزة وظيفيا وجزيئيا، بما في ذلك منتظمة، والبقعة، والشبكية الطرفية شبكية العين البشرية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استخدام الخزعات لكمه والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية لتشريح وجمع هذه المناطق الشبكية متميزة لتحليل البروتين المتلقين للمعلومات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
شبكية العين البشرية تتألف من نيوروريتينا الحسية والكامنة وراء ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE)، الذي الرصاصية بشدة على الطبقة تشورويد الأوعية الدموية. مناطق مختلفة من الشبكية تختلف تشريحيا وجزيئيا، تسهيل مهام فريدة من نوعها، ومما يدل على وضعية للمرض. تحليل البروتين لكل من هذه المناطق والطبقات يمكن أن توفر أفكاراً حيوية في العملية الجزيئية للعديد من الأمراض، بما في ذلك ضمور بقعي أجيريلاتيد (AMD) ومرض البول السكري والزرق. ومع ذلك، فصل مناطق الشبكية وطبقات ضروري قبل أن يمكن إنجاز تحليل كمية البروتين. هنا، نحن تصف طريقة للتشريح وجمع المناطق الشبكية نقري والقرنية، والأجهزة الطرفية والكامنة وراء مجمع RPE-المشيمية، والتي تنطوي على خزعات لكمه الإقليمية والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية. يمكن استخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أحادي الأبعاد، فضلا عن تحليل البروتين المتلقين للمعلومات، مثل السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، لتحديد البروتينات في كل طبقة الشبكية تشريح، الكشف عن المؤشرات الحيوية الجزيئية لأمراض الشبكية.
المقدمة
الشبكية و RPE المشيمية هي الأنسجة المعقدة التي توضح الاختلافات الإقليمية الهامة في التعبير البروتين والوظيفة الفسيولوجية والمرضية مخطوطا1،2. على سبيل المثال، تظهر الأمراض مثل تنكس بقعي أجيريلاتيد (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية المصلي وسط كل الترجمة مميزة داخل منتظمة أو البقعة الشبكية الطرفية1،3، 4،6. نقدم هنا، طريقة تثبت الشبكية متميزة كيف يمكن تذوق المناطق بشكل مستقل. والهدف العام لهذا الأسلوب تقديم دليل موثوق به لجمع عينات الأنسجة من المناطق نقري والقرنية والطرفية RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين. الأساس المنطقي لتطوير واستخدام هذا الأسلوب أنه من خلال تحليل البروتين هذه المناطق الشبكية محددة، قد اكتسبت رؤى الجزيئية في الوظائف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لهذه المناطق الهامة.
وعود هذا النهج الكشف عن أساس البروتين مخطوطا المرض الإقليمي النسبي، وتيسيرا لتحديد أهداف علاجية محددة جديدة. وفي الواقع، وفرت التحقيقات البروتين الجسم الزجاجي وتفاعلاته مع الشبكية أفكاراً رئيسية في التركيب الجزيئي ووظيفة الأنسجة السليمة والمريضة5،،من78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، تفتقر إلى تحليل البروتين مقارنة واضحة لمناطق الشبكية متميزة. التقنية سوف تساعد على دعم هذه الدراسات اللازم، وتوفير مزايا أكثر من غيرها من الأساليب بإظهار نهج جمع أنسجة يمكن الاعتماد عليها واستنساخه. أكثر من ذلك، النهج الوصول للغاية، مع الاستفادة من الحجم العادي ومتاحة بسهولة الأنسجة لكمه أدوات خزعة. ويؤكد لدينا تقنية مناسبة جمع وتخزين الأنسجة للبروتين التجهيز، مما يجعل من الاعتبارات الهامة للبروتين الاستقرار وتدهور. وهكذا، هذا الأسلوب الأنسب للمحققين النظر في المصب التحليل الجزيئي لعوامل البروتين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذه الدراسة تمت الموافقة بجامعة آيوا ' s "مجلس المراجعة المؤسسية"، وتتمسك بالمبادئ المنصوص عليها في "إعلان هلسنكي".
1-فوفيل والقرنية خزعة لكمه
- المفتوحة وفراشة العين البشرية، مثل أن تتكون من 4 اللوحات المنفصلة من الأنسجة، كما هو موضح في منشور سابق. 5
- بدءاً بعين بشرية بوتيرفليد توضع في طبق بتري، مركز أداة خزعة لكمه 4 ملم أكثر منتظمة، اضغط لأسفل، ولفه بلطف حتى يتم إجراء شق حول منتظمة. بعد ذلك، تولد
- شق حول البقعة بالتوسيط والضغط أسفل أداة خزعة لكمه جلد 8 مم داخل الأروقة البقعة، وتطبيق ضغط لطيف والمتداول. هذا وسوف تنتج الطوق الخارجي، والثانية من الأنسجة المحيطة بالأول-
2. لكمه خزعة الشبكية الطرفية
- استخدام لكمه الجلد 4 مم خزعة أداة لجعل سلسلة من اللكمات في الشبكية المحيطية، خارج الممرات. هنا، جعل اللكمات اثنين لكل رفرف رباعي-
ملاحظة: بعد أن تصنع جميع اللكمات والعين سوف يكون اثنين من اللكمات متحدة المركز في الوسط، تمثل منتظمة والبقعة، واللكمات اثنين في قاعدة كل رفرف مجموعها 8 اللكمات في الشبكية المحيطية.
3. منتظمة وجمع خزعة البقعة
- الأنسجة جاهز الآن لجمع وجمع جميع خزعات الأنسجة في منفصلة [ميكروفوج] أنابيب وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تخزين جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- استخدام ملقط Colibri منحنى 0.12 للاستيلاء على حواف أنسجة شفافة منتظمة الشبكية. جمع ورفع وفصل الأنسجة نقري من RPE-المشيمية الأساسية- وبالمثل، استخدم
- الملقط Colibri 0.12 إلى فهم الحلقة الخارجية لانسجة البقعة شفافة. إذا كان يزال مربوطا الأنسجة للأنسجة المجاورة أو المصدر، استخدام مقص وستكوت بعناية تقليم الحافة، التقاط مجرد عنصر الشبكية وتشريح بعيداً من أي أنسجة العصب البصري وشملت لكمه.
4. جمع الشبكية الطرفية
- استخدام الملقط Colibri 0.12 منحنية بلطف فصل الأقراص نسيج الشبكية المحيطية RPE-المشيمية ومكان داخل الفردية [ميكروفوج] أنابيب الأساسية-
- في حالة جل الزجاجي المتبقية، استخدام الملقط رفع وفصل هلام بعيداً بقدر الإمكان قبل جمع نسيج الشبكية. مرة واحدة قد أزيلت الشبكية، RPE-المشيمية المصطبغة لا يزال أدناه.
5. نقري وجمع RPE-المشيمية البقعة
- الاستخدام 0.12 Colibri الملقط لفهم حواف الأنسجة المشيمية RPE الظلام التي تقع تحت مجال منتظمة إزالة. فصل هذا النسيج بعناية من الصلبة وجمع-
- استخدام الملقط نفسه، فهم حواف الطوق الخارجي للأنسجة المشيمية RPE الظلام الكامنة في مجال إزالة البقعة الصفراء. عناية منفصلة هذا النسيج من الصلبة العينية باستيعاب الحواف في نقاط مختلفة حول الحلبة وسحب خفيفة. في نهاية المطاف، سوف تكون أخرجت حلقة الأنسجة المشيمية RPE ويمكن الحصول عليها-
ملاحظة: الملقط الثانوية في الجهة المقابلة يمكن أن تكون مفيدة في معالجة الأنسجة المشيمية RPE أثناء الإزالة. مقص ويسكوت مثل نسيج الشبكية، يمكن أن تستخدم للمساعدة في إزالة أي أنسجة كان غير قطعي تماما باستخدام الأداة لكمه.
6. جمع المشيمية RPE الشبكية الطرفية
- استخدام الملقط Colibri 0.12 قشر بعيداً RPE-المشيمية في المناطق الطرفية لكمه 8-
- وضع الأنسجة المشيمية RPE في [ميكروفوج] أنابيب كما في السابق، وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تبقى جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
7. مقص التشريح
ملاحظة: إذا كانت شفرة خزعة لكمه مملة أو أداة خزعة لكمه لم يدفع ما يكفي من الثابت، قد لا توجد في الأنسجة المحيطة عمليات التطهير قطع.
- في هذه الحالات، سيتم سحب الأنسجة بعيداً بقدر الإمكان، ومن ثم استخدام مقص وستكوت تقليم وفصل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن معالجة الشبكية والأنسجة المشيمية RPE بطرق مختلفة لتناسب تحقيق فردية. بعد جمع، والباحث سوف تمتلك عينات من الشبكية والأنسجة المشيمية RPE من منطقة نقري والبقعة الخارجي، والشبكية الطرفية (الشكل 1). على وجه التحديد، سوف تشمل لكمه المنطقة نقري منتظمة وبارافوفيا وكمية صغيرة من بيريفوفيا المجاورة. لكمه القرنية يشمل ما تبقى من منطقة بيريفوفيل، فضلا عن كمية صغيرة من منطقة قرب الطرفية المتاخمة. وأخيراً، عينة اللكمات المحيطية في المناطق الطرفية منتصف والمتطرف-الطرفي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بعد الأنسجة يتم جمع ومعالجة عينة ومعالجة الاعتبارات الحاسمة14. يفضل حفظها في النتروجين السائل على التثبيت الكيميائي، كما هذا الأخير قد ينتج عنه تلف لهيكل البروتين، التي يمكن أن تحرف تحليل المتلقين للمعلومات. بالإضافة إلى ذلك، يفضل الحفاظ على النتروجين السائل للأساليب التي لا تنطوي على تجميد عينات. جدير بالذكر أن فيرير et al. أظهرت فروق كبيرة في مستويات البروتين بين العينات الدماغ الحفاظ على 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة، مقارنة بتلك التي تخزن في 0 ° ج15. علاوة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
VBM تدعمها المنح المعاهد الوطنية للصحة [K08EY020530، R01EY024665، R01EY025225، R01EY024698، و R21AG050437], "دوريس ديوك الخيرية منحة من مؤسسة" #: 2013103، وإجراء البحوث لمنع العمى (تجمع الشعب البوروندي)، نيويورك، نيويورك. طن متري وغف معتمدة من قبل المعهد الوطني للصحة منح T32GM007337.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أداة خزعة لكمة الجلد مقاس 4 مم | Miltex | REF 33-34 | |
| خزعة لكمة الجلد مقاس 8 مم | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Fallps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge Tubes | Eppendorf | # 022364111 | 1.5 مل |
| النيتروجين السائل | Praxair، Inc. | 7727-37-9 [ص] |
المراجع
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759(2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140(2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567(2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405(2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
