مقالة منهجية

كامل الخلية التيارات الناجمة عن تطبيق نفخة GABA في الدماغ شرائح

DOI:

10.3791/56387

⸱

أكتوبر 12, 2017

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا تقنية النفخ، التي يمكن أن تدار من خلال تسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك الكواشف الدوائية، وتسليط الضوء على جوانب مختلفة من الميزات التي تعتبر حاسمة لنجاحه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشيع استخدام الإدارة الدوائية عند إجراء تصحيح كامل الخلية-المشبك تسجيل شرائح المخ. واحدة من أفضل الطرق لتطبيق المخدرات أثناء تسجيل الكهربية هو أسلوب النفخ، التي يمكن استخدامها لدراسة تأثير الكواشف الدوائي على أنشطة الخلايا العصبية في الدماغ شرائح. أكبر ميزة للنفخ التطبيق أن تركيز المخدرات حول موقع تسجيل يزيد من سرعة، وبالتالي منع الحساسية مستقبلات الغشاء. الاستخدام الناجح للتطبيق نفخة ينطوي على اهتمام دقيق للعناصر التالية: تركيز الدواء، ومعلمات ميكروبيبيتي نفخة، المسافة بين طرف ميكروبيبيتي النفخ والعصبية المسجلة، والمدة و الضغوط الدافعة النفخة (جنيه لكل بوصة مربعة، psi). توضح هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لتسجيل التيارات كامل الخلية الناجمة عن النفخ غاما – حمض أمينوبوتيريك (GABA) إلى خلية شريحة القشرية بريفرونتال. جدير بالذكر أن يمكن تطبيق نفس الإجراء مع تعديلات طفيفة إلى مناطق أخرى في الدماغ مثل في قرن آمون وفي المخطط، واستعدادات مختلفة، مثل الثقافات الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير تقنية التصحيح-المشبك، أداة أساسية للتحقيق في إشارات كهربائية في الخلايا العصبية، في السبعينات1،2. ميزة رئيسية لهذا الأسلوب أنه يوفر المعرفة في علاجات كيفية معينة (مثلاً، الدوائي) قد تغير في وظائف الخلايا العصبية أو قنوات في الوقت الحقيقي3. التقييم الدوائي لوظيفة الخلايا العصبية أثناء تسجيل في شريحة الدماغ كامل الخلية يتطلب تطبيق المخدرات مثل يضع أو الخصوم من مستقبلات محددة، على الخلايا العصبية التي يجري تسجيلها. يسمح هذا الأسلوب بتحديد التعديلات الخلايا العصبية التي تحدث بعد تطبيق دواء معين، مما يؤدي إلى فهم أفضل للخصائص الفسيولوجية والمرضية ل الخلايا العصبية4. على الرغم من أن الإدارة الدوائية يمكن أن تجري عن طريق أما نضح5 أو نفخة6، هذا الأخير هو تقنية متفوقة. وبخاصة: (ط) نفخة تطبيق سرعة الزيادات المخدرات تركز حول العصبية المسجلة إلى مستوى أن يتم منع الحساسية مستقبلات الغشاء؛ (ثانيا) حجم المخدرات ينفخ منخفض للغاية، حتى لا يكون هناك تأثير ضئيل على الحل حمام، مما يقلل من أي آثار غير مرغوب فيها من المواد الكيميائية التي تدار على شرائح المخ؛ وبالتالي (ثالثا) البروتوكول نفخة يمكن تعيين وحفظها، مما يجعل هذه التجربة استنساخه بدقة؛ (الرابع) التطبيق نفخة يمثل الاستخدام الاقتصادي ليضع/الخصوم، خاصة عندما تكون هذه الكواشف باهظة الثمن أو يصعب الحصول عليها.

وهنا سوف نركز على تسجيل كامل الخلية التيارات الناجمة عن النفخ GABA في الدماغ حادة استعداد شرائح، إعداد يحتوي على ميزة الدوائر الدماغ الحفاظ عليها جيدا نسبيا. كيف ندير التيارات المثبطة التي يسببها النفخ7 سوف تكون الموضحة في هذه المقالة. باستخدام السيزيوم (Cs+)-على أساس الحلول الداخلية، ويحمل الخلايا العصبية في 0 mV، سوف نقدم GABA-نفخة أثارت التيارات بوستسينابتيك المثبطة (ايبسكس) مع التفاصيل التقنية المناسبة. باستخدام نموذج الفأر من الاكتئاب الناجم عن حقن lipopolysaccharide (LPS)8، نظهر أن ايبسك انخفض انخفاضا كبيرا السعة التي أثارت من قبل نفخة غابا في شرائح من لبس حقن الفئران مقارنة بعناصر التحكم المركبة. هدفنا أن هذه المادة ينبغي أن تظهر كيف تقنية النفخ قابلاً للتطبيق على نطاق واسع لدراسات تهدف إلى تقييم تأثير أي مواد كيميائية أو مركبات أو المخدرات على أنشطة الخلايا العصبية في الدماغ شرائح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإسكان

الحيوانية وجميع الحيوان أجريت التجارب وفقا للإجراءات التي أقرتها "لجنة أخلاقيات" البحوث الحيوانية في جامعة جنوب الصين عادي، وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان" أنشئ المعهد الوطني الصحة-

1-"إعداد الحلول"

  1. إعداد 500 مل من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القياسية (قام)، التي تحتوي على المكونات المذكورة في الأعمال المنشورة لدينا 7 كما هو موضح في الجدول 1. قنينة
    1. استخدام الزجاج نظيفة مع المياه لإعداد حل قام طازجة. ملاعق مع المياه النظيفة والجافة قبل استخدام لإضافة كلوريد الصوديوم، بوكل، نة 2 بو 4، ناكو 3، MgSO 4، د-الجلوكوز، وإضافة كاكل 2 بعد وجود bubbled الحل مع 95% O 2/5% CO 2 الخليط لدقيقة ~ 20 (كما هو مفصل في الجدول 1) إلى 500 مل من المياه. يقلب حتى يذوب تماما.
      2. مسح
    2. تأكد من قام الكامل دون أي هطول الأمطار. ثم قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4. فقاعة مع خليط غازات تتكون من 95% O 2 و 5% CO 2 ل ~ 20 دقيقة
  2. تحضير 250 مل من محلول قطع شريحة التي تحتوي على المواد الكيميائية 7 المبينة في الجدول 2.
    1. إضافة بوكل، مجكل 2، نة 2 بو 4، ناكو 3، choline·Cl، د-الجلوكوز وإضافة كاكل 2 آخر كما هو مبين في 1.1.1، إلى 250 مل مياه وحل كما هو موضح في 1.1.1 و 1.1.2-
      2. شركة
    2. بعد محتدما مع 95% O 2/5% 2، ضع الحل في ثلاجة لمدة 15-20 دقيقة حتى يصبح الحل قطع المثلج والمجمد جزئيا.
      ملاحظة: نحن نستخدم هذا الحل قطع عند صنع شرائح من شهر 1-2--الفئران القديمة؛ وقد تختلف الصيغة للفئران التي مضى عليها أكثر من شهرين.
    3. "لبس إعداد" حل بيذوب في المحلول الملحي متساوي التوتر خالية من الذيفان العقيمة (0.9% كلوريد الصوديوم). ويدار لبس إينترابيريتونيلي (0.5 ملغ/كغ) وبدء تسجيل ح 2 لاحقاً.

2. إعداد شريحة قشرة Prefrontal

  1. تأخذ الحل قطع خارج الثلاجة ومجانسة للحصول طين. وضع الحل على الجليد وفقاعة باستمرار مع 95% O 2/5% CO 2-
  2. باستخدام مقص كبير وحاد، بسرعة قطع رأس ماوس ك وصف 9 وفورا وضع رأسه في كوب مليئة المثلج (0-4 درجة مئوية) قطع الحل.
  3. قص الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط في اتجاه والذيلية الآنف مع مقص جيد وإزالة أجزاء الجمجمة الجانبية. إزالة الدماغ مع ملعقة الجميلة والإسقاط إلى الحل قطع الجليد.
    ملاحظة: الخطوات 2، 2، 2-3 يجب أن يتم سريعاً (من الناحية المثالية < 1 دقيقة)-
    4. ضع
  4. الدماغ على غطاء طبق بيتري 9 سم مملوءة بالجليد. شطف في الدماغ مع الحل قطع الجليد. قطع المخيخ ولمبة شمي مع شفرة حلاقة.
  5. تطبيق cyanoacrylate الغراء للعينة حامل فيبرتوم. وضع كتلة الدماغ بعناية في قطره الغراء، روسترال الجانب الأعلى، وتزج فورا في حل قطع الجليد.
  6. ضبط صاحب بليد فيبرتوم بزاوية مقدارها 15 درجة فيما يتعلق بالطائرة الأفقي وإعداد 350-ميكرومتر شرائح المخ الاكليلية (تواتر الاهتزاز بليد = 85 هرتز، سرعة = 0.1 mm/s).
  7. باستخدام ماصة، نقل الشرائح إلى غرفة الإنعاش مليئة قام، احتضانها ح 1 (في RT) مع السطح المستمر من 95% O 2/5% CO 2-

3. تسجيل التصحيح كامل الخلية

  1. جعل زجاج البورسليكات ميكروبيبيتيس لاستخدامها كتسجيل كهربائي أو نفخة ميكروبيبيتيس وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة في "دليل العمليات ساحبة". لتسجيل كهربائي، مقاومات نصيحة في حدود 4-6 م Ω، في حين قد ميكروبيبيتيس نفخة أقطار نصيحة في النطاق 2-5 ميكرومتر.
    2. إضافة مانع قناة نا + (ت، 1 ميكرومتر)، كتلة قناة نا + بسرعة ومن ثم إمكانات العمل، قام
  2. والحفاظ على معدل تدفق ثابت لهذا الحل من 2-3 مل/دقيقة في قاعة التسجيل، بمضخة تمعجية إلى غرفة وتطلع منه. فقاعة قام مع 95% O 2/5% CO 2 باستمرار لضمان بقاء الشرائح.
  3. نقل شريحة الدماغ في قاعة التسجيل باستخدام ماصة باستور معدلة نصيحة الجميلة التي قطعت لتتناسب مع حجم شريحة. تغطي الشريحة بنقطة ربط شريحة البلاتين بخيوط النايلون متوازية متباعدة ≥ 2 مم إلى جانب عقد الشريحة على المنصة-
  4. ملء ميكروبيبيتي التسجيل مع حل داخلي 7 (الجدول 3)، وملء ميكروبيبيتيس نفخة مع GABA في 10 ميكرومتر، 50 ميكرون، و 100 ميكرومتر (حله في قام)، أو قام بمراقبة المركبات-
  5. لمنع انسداد بالحطام، تطبيق الضغط الإيجابي الخفيفة استخدام المحاقن 1 مل قبل غمر مسرى التسجيل في قام. استخدام ميكرومانيبولاتور تحت مجهر (4 x الهدف العدسة)، ضع ميكروبيبيتي الكهربائي ونفخة التسجيل حيث تظهر التلميحات في وسط صورة الفيديو في جهاز العرض ( الشكل 1 أ)-
    6. ضبط التركيز المجهر (عدسة الهدف x 40) بينما يخفض تدريجيا ميكروبيبيتي نفخة
  6. ووضعه فوق العصبية التسجيل بزاوية مقدارها 45 درجة. الحفاظ على المسافة بين طرف ميكروبيبيتي النفخ والعصبية سجلت بين 20-40 ميكرومتر ( الشكل 1 ب). ببطء وبعناية نهج العصبية مع مسرى تسجيل وثم حرر الضغط الإيجابي. تطبيق شفط ضعيفة وقصيرة من خلال الأنبوب متصل بحامل الكهربائي لإنشاء ختم جيجا أوم.
    7. MV
  7. الحفاظ على الجهد في 0. بعد تشكيل ختم جيجا أوم، تعويض سريع وبطيء السعة يدوياً أو تلقائياً. ثم تطبيق شفط قصيرة وقوية من خلال الأنبوب المذكور أعلاه للحصول على وضع كامل الخلية.
    8. وضع
  8. إييبسك سجل في الجهد-المشبك. تطبيق ضغط الغاز منخفض (النيتروجين، 4-6 psi) إلى ميكروبيبيتي النفخ استخدام بيكوسبريتزير التي تسيطر عليها مولد خطوة جهد الرئيسي 8 لتسليم غابا فردي أو زوجي نفث ( الشكل 2).
  9. تغيير مدة النفخ الحصول على أفضل النتائج إييبسك ( الشكل 3)، وقياس إييبسك في نموذج الاكتئاب الناجم عن لبس ( الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية النفخ يسمح للباحثين لدراسة أثر المخدرات على مستقبلات خاصة على سطح خلية معينة. في هذه المقالة، نحن نركز على التيارات توسط مستقبلات GABA. ويبين الشكل 1 ميكروبيبيتيس النفخ والتسجيل. للقضاء على أي تأثير على الخلايا العصبية المسجلة من الضغوط المادية المتولدة عن النفخة، قام ونفث السكروز (الشكل 2أ) تستخدم كعناصر تحكم. يمكن منع رد فعل نفخة غابا (أسود) بواسطة مثبط مستقبلات GABA، مثل بيكروتوكسين10

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطبيق نفخة يستخدم على نطاق واسع لتقييم مستقبلات بوستسينابتيك الدالة3،،من47، ولكن يتطلب مراقبة دقيقة في كل تجربة. يصف لنا هنا إجراء إشراك لقط تصحيح كامل الخلية، مما يدل على نفخة غابا الناجم عن إيبسكس (أي، ايبسكس) في الدماغ القشرية بريفرونتال شرائح. مقاومة مسرى التسجيل هو MΩ حوالي 5، بينما قطر تلميح ميكروبيبيتيس نفخة على وشك الضغط 2-5 ميكرومتر. نفخة بين 4-6 psi: هذا النطاق أمر بالغ الأهمية، ارتفاع ضغط قد يسبب تلف الخلايا العصبية، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر المنظمات التالية: الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (31171018، 31171355)، والعلوم والتكنولوجيا شعبة من قوانغدونغ (2013KJCX0054)، (مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ 2014A030313418، 2014A030313440)، ومن قوانغتشو العلوم والتكنولوجيا المكتب (201607010320).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الماصات الدقيقة الزجاجية البورسليكاتأدوات مصراعBF150-86-101.50 مم القطر الخارجي ؛ 0.86 مم القطر الداخلي
Micropipette PullerShutter InstrumentsMODEL P-97 & nbsp ؛مجتذب الماصة الدقيقة المشتعلة / الحاجب
أجهزة المعالجة الدقيقةأدوات مصراعMP-285
مكبر للصوت الذي تسيطر عليه الكمبيوتر     الجزيئيةMulticlamp 700B
نظام الاستحواذ الرقمي الأجهزة الجزيئيةDigidata 1440A
كاميرا التصويرنيكون  2115001معدات الفحص
المجهري نيكون Eclipse FN1 
ماجستير 8صباحاMaster-8 محفز
قطاعة الاهتزازLeicaVT 1000S
شفرة الحلاقةجيليت74-SFLYING EAGLE
شاشة فيديوباناسونيكWV-BM 1410
502 الغراءديلي7146الغراء سيانواكريليت
شنغهاي JIA PENG CorporationBT100-1F
كاميرا فيديوأوليمبوس أمريكا الطبيةOLY-150
نقل بيبيتسبيولوجيكس30-0138A1
الأجهزة النبض مضخة التمعج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GABA IPSC

مقالات ذات صلة