Method Article

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

DOI:

10.3791/56459

⸱

October 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. 1 يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج8) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)9، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية10 ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.

قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.

الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.

1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL)

  1. "باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات 6، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل الرغامى 13 .
    ملاحظة: يؤدي الحصول الضامة عموما بعض التنشيط لهذه الخلايا. يتم الحصول على الضامة من المرضى الذين يحتاجون القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة وليست جميع المواضيع قد تكون مناسبة لتحليل ميتس (هذا سوف تحتاج إلى تحديد لكل مشروع على حدة).
    1. تأخذ الحل بال وتدور إلى أسفل (ز 500 x لمدة 10 دقائق) للنموذج بيليه ويغسل مرتين مع الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع مصل العجل الجنين 5% و 1% ل الجلوتامين) في درجة حرارة الغرفة، وثم تضعف الخلايا في 4 مل من الثقافة ميدي أم-
    2. إذا لزم الأمر، طلب رسميا العد التفاضلية؛ ومعظم الخلايا (عموما > 80%) سوف تكون الضامة 6.
      ملاحظة: هذا سوف عموما أن يؤديها خدمة علم الأنسجة سريرية استخدام مظهر مورفولوجك ل أنواع خلايا مختلفة 6-
    3. تنفيذ خلية سنخية قابلة للحياة الاعتماد على الحل بال باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير-
      ملاحظة: الحل بال يتم الحصول عليها من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1، 1-
    4. إضافة 1-4 × 10 5 الضامة إلى لوحات 24-جيدا في كوفيرسليبس في 500 ميليلتر للثقافة المتوسطة كل بئر وإجازة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية؛ وسوف تلتزم الخلايا كوفيرسليبس. بالنسبة للعينات البشرية، إضافة المضادات الحيوية (مثل البنسلين وستربتوميسين، 10 4 U/mL) لمنع التلوث البكتيري.

2. الفلورة التالي/مجهرية من "الضامة بال"

ملاحظة: يتم التقيد بها الخلايا على كوفيرسليبس كما هو مذكور أعلاه.

إزالة متوسط الثقافة
  1. وغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد/فوق يودات/يسين (حزب العمال التقدمي) 2% للحد الأدنى 10
  2. يغسل خلايا بإيجاز في برنامج تلفزيوني، وثم بيرميبيليزي في 0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني عن 20 دقيقة
  3. كتلة الخلايا مع سيرا دجاج 10% في 5% البقري ألبومين المصل (BSA) المخفف في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة
  4. إينكوباتي مع مراقبة الابتدائي وايستب الأجسام المضادة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد تفاصيل أكثر تحديداً في الجدول للمواد) على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للعينات BAL، علامة محددة من الضامة عادة غير مطلوب.
  5. بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وكذلك احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  6. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع المتوسطة المستندة إلى DAPI المتصاعدة للتصور استخدام مجهر [كنفوكل] (كما ذكر أعلاه) في الليزر الجسيمات 405، 488، 561 و 647 نانومتر و 40 س، غ 1.0 النفط الهدف.

3. عينات أنسجة الرئة

ملاحظة: في فيفو الدراسات أنسجة الرئة، دراسة العينات بعد التعرض ذات الصلة (مثلاً، كما هو مبين في س ' سوليفان et al. 7)-التعرض الأكثر ملاءمة لهذه التجربة هي الكائنات الدقيقة المعدية، خاصة البكتيريا. سلالات الماوس التي يمكن أن تستخدم لهذا الأسلوب من C57BL/6 أو بالب/ج الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، والوزن ز 25-30، وذكر-

  1. يوثانيزي الفئران، عن طريق حقنه داخل الكيتامين (400 مغ/كغ) وإكسيلازيني (40 مغ/كغ). فتح تجويف الصدر وفضح الرئتين والقلب باستخدام الملقط الجراحي والمقص.
    1. بث برنامج تلفزيوني الحار باستخدام إبرة عيار 21 في البطين الأيمن لتغسل الدم من هذه السفن لمدة 30 ثانية، ثم ضخ 10 مل من 2% حزب العمال التقدمي مثبت لمدة 30 s (في البطين الأيمن).
    2. استخدام برنامج تلفزيوني الحارة (42 درجة مئوية) للغسل تجويف الصدر مفتوحة. التنبيب القصبة الهوائية بإبرة عيار 21 وقطعة من أنابيب 0.8 ملم قطع بحجم، وحقن 800 ميليلتر من المعالجون مسبقاً (إلى 42 درجة مئوية)، ذوبان منخفضة نقطة 3% [اغروس] الحل.
    3. التعادل قبالة القصبة الهوائية مع الحرير مجدول (4.0 جامعة جنوب المحيط الهادئ). ضع مؤشر ترابط حول القصبة الهوائية، أسفل نقطة الإدراج من القنية، وضمان الحصول عليها عن طريق تراكم عقده بسيطة. أن يصلب [اغروس]، إدارة برنامج تلفزيوني المثلج حول الرئتين. إزالة الرئتين والقلب ككتلة من تجويف الصدر باستخدام مقص وتشريح كليلة. إزالة الرئة كل على حدة ومن ثم إصلاحها لهم ح 16 في 2% حزب العمال التقدمي أو الفورمالين في 4 ° C.
    4. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تقطيع الأنسجة. وكانت هذه الأساليب للحصول على أنسجة الرئة هو موضح سابقا 13-
  2. لتحضير أنسجة الرئة نماذج استخدام الخطوات التالية.
    1. فيكس الرئة الأنسجة (مستأصل في الخطوة 3، 1) الأنسجة في 10% فورمالين الطبيعية معزولة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. نقل إلى الإيثانول 75% ووضع في معالج أنسجة على دورة ح 12، (2.5 ح في 75% EtOH، ح 3 في EtOH المطلق، ح 3.5 في 3B المذيبات، وعن ح 3 في البارافين).
    2. Embed في البارافين القياسية لإنشاء ثابت من الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين كتل (FFPE) التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة-
      ملاحظة: في هذه المرحلة، عموما مريحة لقطع المقاطع الرئة للشرائح القياسية.
    3. قطع المقاطع الرئة FFPE في 4-5 ميكرون سمك باستخدام مبضع وجبل على المتهمين، المغلفة الشرائح كما تم وصفه سابقا قبل س ' سوليفان et al. 7
    4. لتحميل الشرائح ووضع 3 قطرات متوسطة المتصاعدة على 60 مم × 24 مم كوفيرسليبس (الحجم 1.5)، وعكس الشريحة ساترة وطرد المتوسطة الزائدة. مغلقة بأحكام ختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-

4. إعداد/الفحص المجهري "عينات أنسجة الرئة"

  1. لإزالة الشمع وترطيب بريتريت عينة أنسجة الرئة FFPE مع مستضد استرجاع الحل. الشرائح فب
    1. الفرن الجاف لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم وضع الشرائح في الحل زيلين نفط 30 دقيقة ونقل إلى الحل الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشطف بماء الصنبور.
    2. مكان في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة، ورهنا باسترجاع مستضد هير في طنجرة الضغط لمدة 10 دقائق في 10 m/mol/L تريس، 1 ملمول/يدتا pH 9.0. باردة ل 20 دقيقة أغسل مرتين في مياه الحنفية لمدة 5 دقائق في الروك، ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في الروك.
    3. كتلة مع المصل الدجاج 10% في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  2. وصمة عار في الأنسجة.
    1. لتحديد ميتس في الضامة، إضافة الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية في تمييع 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة عن كميات الضد في الجدول للمواد). أغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الروك.
      2. أضداد
    2. تحقيق كشف فلوري بالحضانة مع الثانوية المقابلة في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأضداد:: (1) الدجاج المضادة الماوس 488 (الأخضر) والماعز (2) الدجاج لمكافحة 594 (أحمر) والماوس المضادة (3) حمار 647 (الأحمر الآن)-
    3. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع تصاعد المحتوية على DAPI المتوسطة لتلطيخ الكروماتين.
  3. الحصول على الصور الفلورية باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح رئيس تعلق مجهر مقلوب.
    1. تثير الإعداد مع 405، 488، 561، و 647 نانومتر الليزر. التقاط صور بكسل-512 × 512 طائرة واحدة بالنقر فوق خط تسلسلي، والاستواء زر (في المتوسط سطر 2) استخدام 20 X 0.1 الهواء NA و NA 40 × 1.0 النفط الأهداف.
    2. الحصول على مالا يقل عن عشرة حقول لعرض كل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (أي، 10 عالية الطاقة الحقول لعرض (هفوف) لعنصر التحكم، 10 لحفز عينة، إلخ، لكل الماوس)-
      ملاحظة: للحصول على عينة تمثيلية من الميدان كله، نظام مصفوفة يمكن استخدامها في الحقل الذي يتم تقسيم إلى أقسام مختلفة و لكل عينة مختلفة تستخدم نفس مصفوفة لتحديد الحقول من طريقة العرض (مثلاً، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام، وتتخذ من المركز وزوايا 4، هفوف اثنين)-

5. التصوير ميتس ثلاثية الأبعاد (3-D)

ملاحظة: كما ميتس هياكل ثلاثية الأبعاد، بأخذ z-المكدس متعددة الصور، والتي يتم تشكيلها، قد تعطي معلومات قيمة-

  1. المقطع العينات الرئة من كتل البارافين، في 200 ميكرومتر استخدام فيبرتوم في سعة تعيين 1.8 ملم والسرعة من 0.1-0.5 ملم/س.
  2. كتلة أنسجة الرئة مع 20 ٪ مصل كل منهما (10% مصل العجل الجنين والمصل الدجاج 10 ٪)، وثم بيرميبيليزي في تكملة برنامج تلفزيوني و 3.75% 100 تريتون العاشر ح 7 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.
  3. وصمة عار المقاطع ح 16 عند 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في مجلدات ميليلتر 200 في أنابيب ميكروسينتريفوجي (جسم التركيزات المذكورة في الجدول للمواد)-
  4. أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، 3 مرات لمدة 10 دقيقة قبل تفرخ مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
  5. وصمة عار أقسام الرئة ل DAPI (1:5، 000) في الحل لمدة 20 دقيقة، قبل إضافة كشوف غطاء للمجهر الشرائح في برنامج تلفزيوني.
  6. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب ال (40 × 1.3 غ) مجهزة 405 نانومتر، 440 نانومتر، 473 نانومتر، 543 نانومتر، و 635 نانومتر الليزر.
  7. سجل ثلاثية الأبعاد z-رزمة من 0.54 ميكرون سمك مع تقطيع ض الأمثل لهدف النفط غ 40 × 1.3.
    ملاحظة: تتنوع البرمجيات المستخدمة تبعاً للمجهر الفردية. مثال عن كيف يمكن استخدام البرنامج مجهر واحد يرد في التكميلية الملف 1-

6. صورة التحليل

ملاحظة: تحليل العينات يتطلب استخدام برمجيات تحليل التصوير محددة وأمثلة مذكورة في الجدول للمواد. في حين يعتمد على برنامج معين يستخدم تحليل النتائج، النقاط المدرجة أدناه هامة-

  1. عينات "التحليل بال"
    1. تعريف عدد الضامة باختيار قناة الأزرق ل DAPI وتعيين حجم الحد أدنى للخلايا (مثلاً، > 18 ميكرومتر في القطر). باستخدام البرمجيات ذات الصلة، وقياس مجموع الضامة كل حقل-
    2. حساب عدد الخلايا التي تحتوي على ميزات يلتقي بوجود خارج الخلية الكروماتين الكشف عنها بواسطة DAPI مع التعبير المشترك عن علامات أخرى (مثلاً، MMP12، PAD2 و H3Cit)-
      ملاحظة: يعتمد عدد العلامات التي يمكن تحليلها على العدد من أجهزة الليزر المتوفرة، ولكن من الناحية المثالية بالإضافة إلى DAPI، اثنين على الأقل من علامات أخرى ينبغي إدراجها. أخرى أقل معلمات محددة للتعبير MET (مثلاً، عدد الخلايا التي تحتوي على الكروماتين خارج الخلية، ونواة موسع) يمكن استخدامها-
    3. لمقارنة التعبير MET في بال تحليل عينات (بين التحكم والدخان، والدخان/الدناز معاملة مجموعات)، الحد ني الضامة ال 100 كل عينة.
    4. لقياس الأجسام المضادة الثانوية وايستب التحكم في مستويات الأسفار؛ وقياس الحد ني خلايا 100 في كل عينة لهذه الأسفار. قياس مستوى متوسط من الأسفار الخلفية لكل علامة (مثلاً، H3Cit) باستخدام البرامج القياسية.
    5. إلى تعريف تعبير MET، عد الخلايا مع النمط الظاهري نموذجي (مثلاً، الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9) وكل MET، لقياس مستوى الأسفار علامات (مثلاً، H3Cit و MMP9). استبعاد الخلايا المنتجة ميتس إذا لم يكن على تلطيخ فوق عنصر التحكم في الخلفية وايستب.
    6. تحليل للعينات بال البشرية، كحد أدنى من 100 خلية لكل عينة للنسبة مئوية الضامة التي تجعل ميتس. للحصول على نماذج مورين، تحليل الخلايا أصغر وصعوبة تحديد ميتس، عدد أكبر من الخلايا لكل عينة (مثلاً، الضامة 200)-
  2. تحليل عينات أنسجة الرئة
    1. لتحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة، استخدم علامة بلعم محددة مثل F4/80-
    2. تحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة باستخدام التعريب المشارك F4/80 في الخلايا التي تعبر عن الكروماتين خارج الخلية مع معلمات أخرى كما هو موضح في القسم 6.1.
    3. تحديد مستويات الخلفية الفلورية في عينات مع الأجسام المضادة الثانوية وعناصر التحكم ايستب. استبعاد ميتس من التحليل أن لا تتجاوز الخلفية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا الكروماتين خارج الخلية مع الوسطاء أعرب المشترك الأخرى، مثل البروتياز H3Cit والحبيبة. الخلية في المراحل السابقة، لا يزال لديه شكل كروي تقريبا مع فخ خارج الخلية وأعرب عن. في مراحل لاحقة، وتشكيل MET تتميز ب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات14. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم تنشيط الإجراء BAL عموما الضامة و ولذلك فمن المتوقع أنه سيكون هناك ميتس موجودة في العينات تنشيط الأمم المتحدة. الضامة BAL عادة ملتصقة جداً. عموما لا الضامة BAL ستحتاج إلى علامة معينة كما هذه الخلايا هي نوع الخلية المهيمنة ويمك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب قد لا الكشف جعل فيما يتصل بهذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة موناش والصحة الوطنية، ومجلس البحوث الطبية، والرئة موناش ومعهد النوم. الكتاب أود أن أشكر موظفي "المناعة السريرية" في الصحة موناش، جودي كالاهان وأليكس فوشيه، كيرستين الجاس وكامدن لو من موناش الصغرى التصوير (MMI) للحصول على تعليمات مع المجهرية [كنفوكل] التصوير، وتقر الكتاب المرافق MMI جامعة موناش. يعترف الكتاب المرافق، وتقديم المساعدة العلمية والتقنية من "منهاج علم الأنسجة موناش".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوية >عينات بشرية: الأجسام المضادة الأولية < / قوية >
أرنب مضاد للإنسان H3Cit (Citrulline R26) AbcamAB510310 ميكروغرام / مل
أرنب مضاد للإنسان MMP12Novus البيولوجيNB110-572141: 100 تركيز غير قابل للقياس
الكمي الفأر المضاد للإنسان MMP9Novus البيولوجيAB1199061: 200 استسقاء ، بدون تركيز بالنظر
إلى الأرنب المضاد للإنسان PADI2 / PAD2AbcamAB164787 ميكروغرام / مل
فأر مضاد للإنسان PADI4 / PAD4AbcamAB12808610.1 ميكروغرام / مل
الأغنام المضادة للإنسان NELifeSpan BioscienceLS-B424425 ug / ml
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>تعليقات < / قوية >
< قوية > عينات من الفأر: الأجسام المضادة الأولية < / قوية >
الماعز مضاد للفأر MMP9AbcamAF90910 ميكروغرام / مل
أرنب مضاد للفأر H3Cit (Citrulline R26) AbcamAB510310 ميكروغرام / مل
الفئران المضادة للفأر F4 / 80داخلي (ورم هجين)في المنزل20 ميكروغرام / مل
الأغنام المضادة للإنسان المضادة للإنسان HNE / NEالياقوت BioscienceLS-B424425 ميكروغرام / مل
فأر مضاد للإنسان وخجول ؛ وخجول. وخجول. وخجول. PADI4 / PAD4AbcamAB12808610.1 ميكروغرام / مل
شرائح سوبر فروست بلس MenzelS41104A
Dapi-prolong goldالمجسات الجزيئيةP36931
Triton-X 100Sigma-Aldrich85111
كلوريد الأمونيومSigma-AldrichE9434
Name< / strong> الشركة< / strong> رقم الكتالوج< / strong>تعليقات< / strong>
الأجسام المضادة الثانوية < / strong>
دجاج مضاد للأرانب AF 488 /تقنيات الحياةA-21441
الدجاج المضاد للأرانب AF 594تقنيات الحياةA-21442
الدجاج المضاد للماعز AF 594الحياة تقنياتA-21468
الدجاج المضاد للفأر AF488تقنيات الحياةA-21200
الحمار المضاد للأغنام AF 594تقنيات الحياةA-11018
الدجاج المضاد للفأر AF 647تقنيات الحياةA-21463
الحمار المضاد للأغنام AF 594تقنيات الحياةA-11016
النمط المتشاوي
أرنب IgGفي المنزل
أرنب IgGفي المنزل
ماوس IgG1BD Bioscience550878
أرنب IgGفي المنزل
ماوس IgG2aBioLegend400201
الأغنام IgGفي المنزل
<قوي > الاسم < قوي><قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوجComments
Software Programs
ImarisBitplane
Image JNIH
لمتوسط شدة الفلورفورات يمكن استخدام تطبيق مكتبي قياسي مثل Microsoft Excel
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
مجاهر
C1 مجهر المسح الضوئي متحد البؤرNikon
FV1200 مجهر المسح الضوئي متحد البؤرأوليمبوس
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue sources
Human BAL من جناح تنظير القصبات في مركز
موناش الطبيعينات الفئران BAL وأنسجة الرئة من قسم علم الأدوية بجامعة ملبورن.
nameCompanyCatalog NumberComments
Media
RPMISigma-Aldrichr8758
مصل ربلة الساق الجنينيةSigma-AldrichF0926
L-glutamineSigma-AldrichG7513
NameCompanyCatalog NumberComments
أخرى كواشف < / strong>
Sudan الأسودسيجما ألدريتش199664
المثبت بارافورمالدهيد / دوريات / ليسين (PLP)سيجما ألدريتش27387
زيلينسيجما ألدريتش214736
الكيتامينسيجما ألدريتشK2753
الفورمالين الطبيعيسيجما ألدريتش42904
البارافينسيجما ألدريتش327204
أغاروزسيجما ألدريتشA2576
مذيب 3BHi-Chem2026
Coverslips 12 ملSigma-AldrichS1815
Coverslips 60 × 24 ملSigma-AldrichC6875
NameCompanyCatalog NumberComments
الفئران< / قوي>
c57 أسود 6منصة أبحاث حيوانية موناش (MARP)
BALB / cMARP
التحكم في

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1(2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371(2015).
  7. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360(2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macrophage Extracellular TrapsConfocal MicroscopyExtracellular ChromatinCitrullinated HistonesGranule ProteasesPeptidyl Arginase DeiminaseBronchoalveolar LavageParaformaldehyde FixativeDAPI StainingImage Analysis Software

Related Articles