يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني

7.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

ديسمبر 26, 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

المخدرات تستند إلى جسم قد أحدثت ثورة في علاج أمراض التهابات. بالإضافة إلى وجود تأثيرات مباشرة على أهداف محددة، يمكن تنشيط الأجسام المضادة الضامة لتصبح للالتهابات. هذا البروتوكول يصف بلعم الالتهابات كيف يمكن تفعيل المقررة في المختبر، باستخدام الماوس نخاع العظم الضامة، و الحية، استخدام الضامة البريتوني.

الملخص

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية متجولة، الشروع في الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض، ويسهم في رد الشفاء والأنسجة. الضامة نفس القدر من الأهمية في إيقاف تشغيل الاستجابات التحريضية. وقد أظهرنا أن الضامة حفزت مع الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg) يمكن أن تنتج كميات كبيرة من سيتوكين المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (إيل-10)، وانخفاض مستويات السيتوكينات الموالية التحريضية ردا على lipopolysaccharides البكتيرية ( لبس). IVIg هو جسم الشاملين، المقام الأول Gs (IgGs)، الغلوبولين المناعي المجمعة من البلازما من 1,000 أكثر من المتبرعين بالدم. يتم استخدامه لتكملة الأجسام المضادة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة أو لقمع الاستجابات المناعية في المرضى الذين يعانون من الشروط الذاتية أو تحريضية. كما تبين Infliximab، جسم ألفا (TNFα) عوامل علاجية المضادة لورم نخر، لتفعيل الضامة لإنتاج إيل-10 في الاستجابة للمحفزات التحريضية. ويمكن اختبار IVIg والبيولوجي الأخرى المستندة إلى جسم لتحديد آثارها على تفعيل بلعم. وتصف هذه الورقة أساليب الاشتقاق والتحفيز والتقييم مورين نخاع العظم الضامة تفعيلها من خلال الأجسام المضادة في المختبر والضامة البريتوني مورين المنشط مع الأجسام المضادة في الجسم الحي. وأخيراً، نحن شرح استخدام النشاف الغربية لتحديد مساهمة خلية معينة إشارات الطرق المؤدية إلى نشاط بلعم المضادة للالتهابات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع الفئران المعدلة وراثيا، لتحديد أثر protein(s) محددة على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات لتقييم ما إذا كان البيولوجي محددة قد تتصرف عن طريق تغيير الضامة إلى حالة تنشيط للالتهابات إيل-10-إنتاج يقلل من الاستجابات التحريضية فيفو. هذا تقديم معلومات عن دور التنشيط بلعم بفعالية من البيولوجي خلال نماذج المرض في الفئران، وتوفير نظرة ثاقبة إليه جديدة محتملة للعمل في الناس. على العكس من ذلك، هذا قد نحذر من استخدام البيولوجي القائم على جسم معين لعلاج الأمراض المعدية، ولا سيما إذا الضامة دوراً هاما في الدفاع المضيف ضد الإصابة بهذا.

المقدمة

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية، التي تلعب أدواراً متعددة في الاستجابة المناعية للعدوى أو الإصابة. الضامة المسؤولة عن بدء استجابة مناعية لأضرار الإصابة أو الأنسجة ووقف الاستجابة الالتهابية، وتعزيز استجابة الشفاء1. من الدول التنشيط أفضل درس بلعم ثلاثة أمثلة: 1) الضامة تعامل مع الانترفيرون غاما (IFNγ) والبكتيرية lipopolysaccharide (LPS)، عينت M (IFNγ + لبس)، التي تساهم في الاستجابة الالتهابية؛ 2) الضامة حفزت مع انترلوكين 4 (إيل-4)، M(IL-4)، التي ترتبط برد الشفاء؛ 3) الضامة حفزت مع مجمعات محصنة (IC) ولبس، م (IC + لبس)، التي لها القدرة على إيقاف الاستجابة الالتهابية2،3. M (IC + لبس) مميزة من الجرح M(IL-4) شفاء الضامة، ولا تعبر عن إنزيم أرجيناسي (الأرجنتين-1) أو FIZZ14. هو علامة أفضل لهذه الضامة للالتهابات على إنتاج سيتوكين5. الضامة أدواراً متعددة في الحفاظ على الصحة، ولكن أيضا المساهمة في أمراض التهابات وسرطان3. وبسبب هذا، يتم الضامة هدفا علاجية رئيسية لمعالجة مجموعة متنوعة من الأمراض. من المهم أن التحقيق آثار الأجسام المضادة على دولته التنشيط لتطوير العلاجات المستندة إلى بلعم للمرض.

هذه الورقة ينصب على استخدام نخاع العظام مورين المستمدة الضامة (بمدمس) والضامة البريتوني لاختبار تأثير المخدرات جسم على الاستجابات الالتهابية في المختبر و في فيفو. في الآونة الأخيرة، كانت هناك عدة دراسات تبين آثار الأجسام المضادة في بلعم التنشيط6،،من78. الضامة تفعيلها يشترك مع مجمعات محصنة، وهي الأجسام المضادة الرصاصية مع مستضد، ولبس، حافزا عادة تحريضية، تنتج مستويات عالية جداً سيتوكين المضادة للالتهابات، وايل-10، ومستويات منخفضة جداً من سيتوكين برو التحريضية، انترلوكين 12 (إيل-12)9. وباﻹضافة إلى ذلك، infliximab، جسم [مونوكلونل] ضد TNFα، وقد تبين أن العمل، في جزء منه، عن طريق حفز الضامة للالتهابات عن طريق جزء للتبلر (Fc) المنطقة7. وقد أبلغنا أن IVIg + لبس الحث على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات مشابه إلى M (IC + لبس)، حيث شارك حفز الضامة تنتج كميات كبيرة من إيل-10، وكميات قليلة من وحدة فرعية سيتوكين برو التحريضية انترلوكين 12 أو (23 p40 IL-12/23p40)، انترلوكين-6 (إيل-6)، وتنف8. هو IVIg مخدرات تتألف من [بولكلونل] أجسام، أساسا مفتش، وقد تم تجميعها من الدم من المانحين 1,000 أكثر من10. فهو يستخدم لعلاج طائفة واسعة من الأمراض المناعية، مثل برفرية الصفيحات مجهول السبب واعتلال دملينتينغ المزمن، ولكن إليه العمل ليست مفهومة تماما11. ويمكن تقييم آثار المخدرات جسم يقوم على تفعيل بلعم باستخدام الأساليب الموضحة هنا.

ويمكن اختبار آثار البيولوجيات محددة على تفعيل بلعم في بمدمس والضامة البريتوني. ويسمح استخدام هذه المصادر بلعم تقييم الخلايا الأولية. الاختبارات الأولية للأجسام المضادة على استزراع الخلايا الأولية يتطلب أقل وقت واستثمار النقد من نماذج أخرى المرض تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. عن طريق حقن مخدرات في ماوس صحية في الجسم الحي، وعزل الخلايا وتحليلها السابقين فيفو، واحد تحديد إذا كان هناك ما يبرر دراسات لتقييم ما إذا كان العلاج مع البيولوجي يؤثر على تنشيط بلعم في نماذج المرض.

مع قليل من الدراسات اختبار أثر العلاجات البيولوجية على بلعم التنشيط في المختبر و في فيفو مباشرة، توفير تقنيات لدينا ميزة على تقنيات بديلة. التقنيات الحالية تنطوي على آثار المخدرات بيولوجي التجارب على الخلايا المختلطة السكان في المختبر، مثل تأثير infliximab في رد فعل اللمفاويات مختلطة (شيخوا) أو IVIg في الضامة البشرية في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى، حيث الأثر لا يمكن أن يعزى إلى7،12نوع خلية محددة. استخدام بمدمس والضامة البريتوني مفيد عبر استخدام خطوط الخلايا، مثل خلايا RAW264.7، التي لا تنتج سيتوكين برو التحريضية، إيل-12، استجابة للبس8،13. اختبار تأثير المخدرات جسم على بلعم الردود السابقين فيفو ومزايا لأن الردود سيتوكين يمكن أن تعزى مباشرة إلى الضامة، بدلاً من استنتاج ردود بلعم بقياس مستويات المصل سيتوكين14 . يمكن مشتقة بمدمس والضامة البريتوني ومعزولة من الفئران المعدلة وراثيا لتحديد الدور المحدد للبروتين في تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، قد استخدمنا Il10 نقص(-/-) بمدمس لإثبات تعتمد جزئيا على إيل-108المستحثة IVIg الحد من إنتاج سيتوكين برو التحريضية. إليه المخدرات من العمل يمكن أن يحقق استخدام النشاف الغربية، حيث يمكن تحديد دور بروتينات محددة وأحداث إشارات. يمكن تنفيذ الكمية البلمرة المتسلسل (قبكر) على بمدمس أو الضامة البريتوني لإظهار أنماط تعبير الجينات التي تنتج عن تنشيط الأجسام المضادة. نماذج المرض في الفئران يمكن أن تقدم معلومات عن فعالية العلاجات البيولوجية القائمة على جسم في النماذج المحتملة لأمراض مثل التهاب الأمعاء المرض والتهاب المفاصل والسرطان15،16، 17-بيد ستوفر التقنيات الموضحة هنا معلومات عن إليه عمل هذه البيولوجيات قبل تحديد سواء كانوا حمل بلعم مضادة للالتهابات النشاط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولومبيا البريطانية.

1-نخاع العظام بلعم الاشتقاق والتنشيط مع الأجسام المضادة

  1. تنفيذ القتل الرحيم استخدام الخنق2 CO.
    1. مكان الماوس في الدائرة التعريفي. Euthanize الماوس مع التخدير إيسوفلوراني 5%، عن 60-90 ثانية، حتى تصبح قادرة على الحركة والتنفس العميق والبطيء.
    2. إيقاف التخدير isoflurane وإدارة 6-8 لتر في الدقيقة من CO2 حتى الماوس توقف عن التنفس. ترك الماوس مع CO2 في لدقيقة أخرى على الأقل 5 التحقق من أنه لم يعد هناك نبض القلب أو التنفس. أداء اضطراب عنق الرحم التأكد من الوفاة.
      ملاحظة: 8-12 أسابيع الفئران القديمة توفر أعلى عائد الضامة.
  2. رش أرجل الماوس مع الإيثانول 70%، ويعلقون عليها مع الذراعين والساقين ملقاة في موقف ضعيف على متن رغوة. مع المقص والملقط عقد الجلد، جعل قطع ضحلة (0.2 سم) لإزالة الجلد والفراء من على سطح الأرض لكل من الخلفيتين.
    ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء وكل ثقافة الأنسجة التلاعب في غطاء عقيمة.
  3. تقليم العضلات لجعل تيبياس وقصبة مرئية. إزالة تيبياس وقصبة، بقطع العظام والعضلات أسفل الورك وفوق الكاحل. تقليم قدر العضلات قدر الإمكان.
  4. رش العظام مع الإيثانول 70% وانتظر 1 دقيقة لكي تتبخر، ثم وضعها في طبق جيدا 6 من العظام المتوسطة دافق (Iscove لتعديل المتوسط في دولبيكو (إيمدم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)).
  5. تقليم نهايات العظام عن طريق خفض 0.1 سم عظم الكاحل ورأس عظم الفخذ حيث أن يتعرض لها تجويف العظام. ضمان أن مرئياً النخاع ويمكن وضع قياس 26 إبرة في تجويف العظام.
  6. قطع العظام والعضلات لفصل تيبياس وقصبة من مفاصل الركبة. أدخل إبرة قياس 26 يعلق على حقنه 10 مل في التجويف. مسح نخاع العظام في أنبوب 50 مل مخروطية مع 5 مل العظام تدفق المتوسط. مسح تيبياس اثنين وقصبة اثنين من الماوس واحدة، في كل أنبوب 50 مل.
  7. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات أو دوامة نخاع بسرعة بطيئة لتفريق لطف كتل. ينبغي تقسيم سلاسل من النخاع إلى البقع الصغيرة (أقل من 0.5 مم) من نخاع. ملء الأنبوب المخروطية إلى 50 مل مع عظم تدفق المتوسط. ماصة محتويات الأنبوبة المخروطية في ثقافة أنسجة2 75 سم تعامل قارورة، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 1.
    ملاحظة: تصبح ناضجة الضامة، والخلايا الوسيطة ملتصقة قارورة والتخلص منها، بينما تبقى موروث المكونة للدم المطلوب في تعليق.
  8. "الماصة؛" المتوسطة مع فروعه المكونة للدم في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الأنبوب في ز 300 x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل مستعمرة بلعم حفز عامل (مكسف) الثقافة المتوسطة (إيمدم، 10% FBS و 5 نانوغرام/مل مكسف البنسلين/ستربتوميسين U/mL 100 150 ميكرومتر مونوثيوجليسيرول (قهوة)).
  9. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير18. إضافة المتوسطة ريسوسبيند الخلايا بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل، 1.5 × 107 خلايا/قارورة في 30 مل متوسطة، و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف. "الماصة؛" 30 مل التعليق إلى 75 سم2 زراعة الأنسجة تعامل قارورة جديدة.
  10. في يوم 4 ويوم 7 بعد الثقافة الأولية في الخطوة 1، 9، تحقق من الخلايا ملتصقة وتشعبت قليلاً استخدام مجهر حقل مشرق تباين مرحلة مقلوب. تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة. تغسل الخلايا مع إيمدم مرة واحدة وإضافة 30 مل من مكسف الثقافة المتوسطة.
  11. عندما تكون الخلايا الناضجة قبل يوم 10 (> 95% إيجابية ل F4/80 وماك-1)، تحقق مرة أخرى من الخلايا ملتصقة وقليلاً.
  12. لوحة خلايا للتحفيز وإزالة المتوسطة الثقافة من قارورة وإضافة 8 مل من إنزيم الخلية الحرة، على أساس يدتا الانفصال من المخزن المؤقت (جدول المواد). احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  13. تتخلص خلايا بلطف، مع كمية صغيرة من الضغط باستخدام مكشطة خلية عقيم. تحقق في المجهر الذي فصل الخلايا من سطح قارورة. خلايا ماصة فصلها في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف قارورة 3 مرات مع 5 مل إيمدم وتجمع الحل شطف مع الخلايا التي تم حصادها. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من مكسف المتوسطة الثقافة الواحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير18. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل ولوحة ميكروليتر 100 تعليق خلية (1 × 105 خلايا/جيد) كل من ثقافة الأنسجة 96-جيدا معاملة، لوحة مسطحة القاع جيدا.
    ملاحظة: العظام من الماوس واحد سوف تولد خلايا كافية للآبار 100. إذا رغبت في ذلك، يمكن مطلي 1 مل خلايا في صفيحة 6-جيدا (زراعة الأنسجة المعالجة، شقة السفلي). عدد أكبر من الخلايا (1 × 106 خلايا) قد تكون مفيدة لتحليل لطخة غربية.
  15. مرة واحدة ملتصقة، حفز مكررة أو الآبار ثلاث نسخ كل منها 10 نانوغرام/مل من لبس في إيمدم، 30 ملغ/مل من IVIg، أو IVIg + لبس. يمكن أن يكون تيتراتيد جرعات من لبس أو IVIg تحسين الاستجابات. ترك الآبار مكررة أو ثلاث كعناصر تحكم أونستيمولاتيد. احتضان لهم ح 24 (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
    ملاحظة: ينبغي أن تتقيد الخلايا مطلي إعادة زراعة الأنسجة الآبار ضمن ح 1.
  16. جمع supernatants خلية من كل بئر في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 الفردية وإزالة أي جسيمات بالغزل في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
  17. إزالة الخلية طافية وتجنب الإخلال بيليه. مكان الخلية أوضح طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة.
    ملاحظة: سوبيرناتانتس خلية يمكن جزيئي السيتوكينات، وايل-10، وفرعية سيتوكين، إيل-40 ف 12/23، بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) فورا، أو تخزينها في الأجل الطويل-80 درجة مئوية. اتبع أليسا البروتوكول من أدوات متوفرة تجارياً (جدول المواد). السيتوكينات الموالية التحريضية الأخرى يمكن أن تكون جزيئي، مثل إيل-6 وتنف، كما أنها تخفض أيضا بمعاملة المشارك مع IVIg + لبس التحفيز بالمقارنة مع التحفيز مع لبس وحدها. بعد التحفيز، ويمكن إعداد الخلايا ملتصقة لتقنيات مثل النشاف الغربية أو الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (س-PCR) 19،20.

2-الطعن في الفئران في فيفو IVIg وحصاد الضامة البريتوني

  1. تزن كل الماوس.
حساب حجم IVIg (100 مغ/مل تركيز المخزون) اللازمة لتوفير جرعة نهائية من 2.5 غ/كغ من وزن الجسم لكل الماوس.
ملاحظة: على سبيل المثال، ماوس ز 20، 500 ميليلتر من IVIg مطلوب.
  • مقياس رسم المبلغ المطلوب من IVIg في محقن معقم 1 مل مزودة 26 عقيمة إبرة. لمكافحة الفئران التي لن تتلقى IVIg، إدارة وحدة تخزين جرعة مكافئة للفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.4 بدلاً من IVIg.
  • القفا الماوس مع جهة بالاستيلاء على الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة وعقد ذيل والخلفيتين بأصابعك المتبقية. الميل الجسم نحو الأرض.
  • مكان الإبرة بزاوية 30-40 درجة مئوية بالنسبة للبطن الماوس، في الربع العلوي الأيمن، مجسم مشطوف الحواف أعلى، وإدراج 1.5 سم الإبرة. حقن IVIg أو برنامج تلفزيوني إينترابيريتونيلي. انتظر ح 1.
  • Euthanize الفئران مع التخدير isoflurane 5% تليها الخنق2 6-8 لتر في الدقيقة CO (انظر الخطوات 1.1.1-1-1-2)، أو وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للمؤسسة.
  • انتشرت دبوس الماوس للوحة رغوة، مع أطرافه. رش الأجزاء مع الإيثانول 70%.
    ملاحظة: تنفيذ الإجراء في غطاء عقيمة.
  • جعل قطع ضحلة في الجلد (0.2 سم) مع المقص على طول خط الوسط للماوس، لتجنب قطع التجويف الصفاقى. سحب الجلد البطن إيقاف البطن الماوس باستخدام الملقط، حيث يكون مرئياً بطانة الجدار البريتوني سليمة.
  • ملء حقنه 5 مل مع 5 مل PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4). إدراج 25 أو 27 قياس إبرة في الجزء العلوي من التجويف من أما الجانب الأيمن أو الأيسر نحو الوسط للماوس مع المجسم مشطوف الحواف الإبرة حتى.
    ملاحظة: وضع الإبرة بعناية في الماوس حتى أن كنت لا حقن برنامج تلفزيوني في الأجهزة، ولكن بدلاً من ذلك، في الفضاء البريتوني.
  • دفع السائل في التجويف الصفاقى. سحب الإبرة خارج التجويف وتدليك الصفاق ل 10 ق لإزاحة أي خلايا. إدخال إبرة في الجزء العلوي من التجويف وتجنب الأجهزة. جمع ووضع سائل الغسل تعافي في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
    ملاحظة: لكل 5 مل من السوائل التي تحقن، سيتم استرداد حوالي 3.75 مل.
  • تكرار الحقن والانتعاش (خطوات 2.8-2.9) 3 أكثر الأوقات (حقن إجمالي حجم 20 مل)، لاستعادة 15 مل سائل الغسل في المجموع. جمع الغسل من كل الماوس في أنبوب مخروطي منفصل 15 مل.
    ملاحظة: بعد حقن النهائي، قد يكون أسهل لاستخراج السوائل من الجانبين الأيمن والأيسر الآن من الماوس، حيث تراكمت السوائل. الأجهزة التي سوف يسبب تداخل أقل مع الإبرة في هذا الموضع.
  • تدور الخلايا لأسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميكروليتر من المتوسطة والطلاء (إيمدم، 10% FBS، و 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين) كل الماوس مسح. عد الضامة قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير18.
    ملاحظة: سيكون أكبر قليلاً من الخلايا الأخرى البريتوني الضامة. عائد نموذجي هو 5 × 105 -1 × 106 الضامة/الماوس استخدام ماوس البرية نوع C57BL/6.
    اختياري: إذا كان عدد كبير من خلايا الدم الحمراء موجودة في الخلية بيليه، إجراء خطوة تحلل لإزالتها، باستخدام المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء 1 x وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  • ريسوسبيند الخلايا في الطلاء المتوسطة في 1 × 106 الضامة مليلتر ولوحة 100 ميكروليتر كل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة تعامل أسفل شقة 96-جيدا.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري لتجمع ثلاث خلايا من الماوس واحد أو أكثر لتجربة إذا كان استخدام الآبار أو المنشطات المعايرة. على سبيل المثال، إذا كان الماوس واحدة 5 × 105 الضامة، سيلزم 500 ميكروليتر من المتوسطة والطلاء. يكون هناك ما يكفي من خلايا للآبار 5، أو 1 تجربة مكررة، مع جرعة واحدة من لبس.
  • احتضان خلايا ح 1 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح بالضامة لتصبح ملتصقة. الخلايا ملتصقة بالضامة البريتوني. إزالة سوبيرناتانتس الخلايا والخلايا غير ملتصقة. شطف الآبار مرتين مع 200 ميكروليتر إيمدم (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية)، وانتظر 10 ثانية وآماله اللوحة ببطء. استبدال المتوسطة والطلاء. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز.
  • حفز الضامة مع 10 نانوغرام/مل من لبس في إيمدم، أو ترك أونستيمولاتيد، كعنصر تحكم. احتضانها ح 24، وجمع وتوضيح سوبيرناتانتس الخلية (انظر الخطوات 1.16-1.17) لتحليل سيتوكين إيل-10 من أليسا. اتبع أليسا البروتوكول من أدوات متوفرة تجارياً (جدول المواد).
    ملاحظة: بعد تنشيط، يمكن إعداد الخلايا ملتصقة لتقنيات مثل لطخة غربية أو PCR.

    • 3-الطعن في الفئران في فيفو مع IVIg + لبس وحصاد الضامة البريتوني

    1. تزن كل الماوس. حساب حجم IVIg (100 مغ/مل تركيز المخزون) اللازمة لتوفير جرعة نهائية من 2.5 غ/كغ من وزن الجسم. حساب مقدار لبس (تركيز 100 ميكروغرام/مل الأسهم في إيمدم) اللازمة لتوفير جرعة نهائي 0.2 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم.
      ملاحظة: على سبيل المثال، ماوس ز 20، 500 ميليلتر من حل الأسهم IVIg و 40 ميكروليتر من حل 100 ميكروغرام/مل من لبس مطلوب.
    2. رسم المبلغ المطلوب من IVIg ولبس في محقن معقم 1 مل مزودة 26 عقيمة قياس الإبرة. لمكافحة الفئران التي لن تتلقى IVIg، يستبدل بما يعادل حجم IVIg العقيمة PBS الأس الهيدروجيني 7.4.
    3. القفا الماوس مع جهة بالاستيلاء على الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة وعقد ذيل والخلفيتين بأصابعك المتبقية. الميل الجسم نحو الأرض.
    4. مكان الإبرة بزاوية 30-40 درجة مئوية بالنسبة للبطن الماوس، في الربع العلوي الأيمن، مجسم مشطوف الحواف، وإدراج 1.5 سم. إدخال IVIg لبس، أو برنامج تلفزيوني + + لبس، إينترابيريتونيلي كما في الخطوة 2، 4.
    5. بعد ح 1، حصاد الضامة البريتوني قبل تنفيذ الخطوات 2.5 2.10.
    6. تدور الخلايا لأسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة 1 مل سائل الغسل المستردة واستخدام لايل-10 وتحليلات إيل-12/23 ف 40 من أليسا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو تجميد في-80 درجة مئوية للتحليلات المقبلة.
      ملاحظة: لضمان مقارنة دقيقة بين العلاجات لتحليل السائل سيتوكين الغسل، أداء فلوشس 5 مل تجويف البريتوني 4 مرات لوحدة تخزين نهائي من 15 مل. وسيتم استرداد السوائل ليست كلها من كل دافق.
    7. كما هو الحال في الخطوة 2.11، ريسوسبيند والعد الضامة قابلة للحياة.
      ملاحظة: سيكون أكبر قليلاً من الخلايا الأخرى البريتوني الضامة.
    عائد نموذجي هو 5 × 105 -1 × 106 الضامة/الماوس استخدام ماوس البرية نوع C57BL/6.
    اختياري: إذا كان عدد كبير من خلايا الدم الحمراء موجودة في الخلية بيليه، إجراء خطوة تحلل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لإزالتها، كما هو الحال في الخطوة 2.11.
  • كما هو الحال في الخطوة 2، 12، تعليق إعادة الخلايا في الطلاء المتوسطة.
    ملاحظة: قد يكون من اللازم إلى تجمع الخلايا من الماوس واحد أو أكثر لتجربة. على سبيل المثال، إذا كان الماوس واحدة 5 × 105 الضامة، سيلزم 500 ميكروليتر من المتوسطة والطلاء.
  • كما هو الحال في 2.13، احتضان خلايا ح 1 في 37 درجة مئوية 5% CO2 للسماح بالضامة لتصبح ملتصقة.
  • جمع وتوضيح المتوسطة مكيفة وفقا للخطوات 1.14-1.15، من كافة الخلايا البريتوني.
    ملاحظة: عينات قد يكون استخدامها فورا أو المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية لتحليل سيتوكين من أليسا.
  • نفذ الخطوة 2.11، لكن احتضان خلايا أونستيمولاتيد 24 ساعة. جمع وتوضيح سوبيرناتانتس الخلية، وفقا للخطوات 1.16-1.17، لتحليل سيتوكين قبل أليسا.
    ملاحظة: يمكن إعداد الخلايا لتقنيات مثل لطخة غربية أو بكر، كما هو الحال في الخطوات 1.16-1.17 و 2.14.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    يمكن مثقف الضامة المستمدة نخاع العظام مورين من سلائف الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم تبين. تبين نخاع العظام المجمعة من قصبة و tibias واحدة بالماوس C57BL/6 عادة ما تسفر عن7 10 نخاع العظام المستمدة الضامة، يجعلها مصدرا مناسب من الضامة للتجارب. يمكن استخدام بمدمس لاختبار الأجسام المضادة على أساس الردود المخدرات عندما تحدت مع حافز تحريضية في المختبر. ويبين الشكل 1 أن IVIg العلامة التجارية، جامونيكس (GX)، + لبس يزيد من إنتاج سيتوكين المضادة ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    بلعم التنشيط الدول دوراً هاما في كل الأنسجة التوازن والمرض22. يمكن أن يكون الضامة متميزة فضلا عن تداخل الولايات التنشيط، اعتماداً على الإشارات في بهم المكروية3. لديهم أدوار متميزة في جميع مراحل الاستجابة الالتهابية: الدفاع ضد العوامل الممرضة، والجرح برد الشفاء والأنسجة، ولها أيضا حالة تنشيط للالتهابات متميزة مهم لإيقاف الاستجابة الالتهابية2 . يتطلب التنشيط بلعم الالتهابات المنبهات الخارجية اثنين الضامة لإنتاج كميات عالية سيتوكين المضادة للالتهابات، و...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

    شكر وتقدير

    ل. ك. هو جائزة الدراسات العليا سنهم 4 سنوات الزمالة (4YF) جامعة كولومبيا البريطانية. L.M.S. هو المستفيد من "الرابطة الكندية" لأمراض الجهاز الهضمي/كرون والتهاب القولون كندا/جائزة استوفوا الجديد المحقق المرتب وهو أحد "علماء الطب الحيوي" "مؤسسة مايكل سميث" "الأبحاث الصحية". بتأييد هذا العمل "منحة المشروع" من "خدمات الدم الكندية"، بالتعاون مع "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح # CIHR2016-LS).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    إيسكوف s Dulbecco المعدل s المتوسطة (IMDM)تقنيات الحياة12440053
    مصل الأبقار الجنينية (FBS)تقنيات الحياة12483-020
    عامل تحفيز مستعمرة البلاعم الفئران المؤتلف (MCSF)تقنيات الخلايا الجذعية78059
    تقنيات البنسلين والستربتومايسينلايف15140148
    مونوثيوغليسرين (MTG)سيجما88640
    1X عازلة تحلل خلايا الدم الحمراءeBioscience
    عازلة تفكك الخلاياتقنيات الحياة13150016خالية من الإنزيم ، قائمة على هانكس ، EDTA
    عديدات السكاريد الدهنية (LPS)Sigma aldrichL 4516من بكتريا قولونية 0127: B8
    IVIg (Gammunex)Grifolsالمستلمة من مستشفى كولومبيا البريطانية للأطفال ، طب
    نقل الدمIVIg (سائل Gammagard) شركةباكستر للرعاية الصحيةتم استلامها من مستشفى BC للأطفال ، طب نقل الدم
    IVIg (Octagam)Octapharmaتم استلامه من مستشفى BC للأطفال ، طب نقل الدم
    محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (معقم) ، درجة الحموضة 7.4تقنيات الحياة10010023
    الفأر IL-10 ELISABD Biosciences555252
    الفأر IL-12 / 23p40 ELISABD Biosciences555165
    الأجسام المضادة ل Erk1 / 2تقنية إشارات الخلية9101
    الأجسام المضادة المضادة ل pp38تقنية إشارات الخلية9211
    الجسم المضاد المضاد ل GAPDHFitzgerald Industries10R-G109A
    26 جم إبرةBD Biosciences305110
    1 مل حقنةBD Biosciences309659
    10 مل حقنةBD Biosciences309604
    15 مل أنبوب مخروطيBD Biosciences352096
    50 مل أنبوب مخروطيBD Biosciences352070
    أنبوب طرد مركزي دقيق (1.7 مل)DIAMEDSPE155-N
    75 سم 2 قارورة معالجة < / sup>BD biosciences353136
    مكشطة الخليةBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386طرف ناعم ، تشريح   ؛
    مقصVWR82027-582حساس, 4 1/2"
    مجهر ساطعAE31تباين الطور المقلوب
     Mettler PE 3000
    مقياس

    المراجع

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    10
    تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني
    اتصل بنا
    أوصِ بها للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.