نفذت هذه الدراسة تسلسل الجينوم الكامل لتحليل الطفرات في الجينات منح المقاومة للعقاقير المضادة للفطور في المبيضات صناعي. كانت متتابعة يعزل صناعي جيم- مقاومة اتشينوكاندينس، الآزولات و 5-فلوسيتوسيني، لتوضيح المنهجية. التشكيلات الجانبية للقابلية يعزل يرتبط بوجود أو عدم وجود أنماط محددة من الطفرة في الجينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كله "تسلسل الجينوم" المبيضات صناعي "الكشف عن علامات للمقاومة المضادة للفطور المخدرات"
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويمكن اكتساب صناعي المبيضات سرعة الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة المخدرات، لا سيما الآزولات واتشينوكاندينس. تحديد الطفرات الوراثية أمر أساسي، كما كشف المقاومة في المختبر يمكن غالباً ما يرتبط بفشل السريرية. قمنا بفحص جدوى استخدام تسلسل الجينوم كله (WGS) لتحليل المجين على نطاق المنظومة لمقاومة العقاقير المضادة للفطور في جيم-صناعي. والهدف كان المساعدون توريكوجنيزي والحواجز في الأفرقة العاملة لتنفيذ وقياس فعاليته. وتلخص هذه الورقة في نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة والمكونات الأساسية للأفرقة العاملة لمنهجية التحقيق البصمات الجينية المرتبطة بتخفيض التعرض للعوامل المضادة للفطور. وتقدر أيضا دقة تحليل البيانات ودورة حول الوقت للاختبار.
قابلية المظهرية من 12 السريرية، وواحد من سلالة ATCC من صناعي جيم- مصممة عن طريق اختبار قابلية المضادة للفطور. عزل هذه شملت ثلاثة أزواج من المرضى الثلاثة، التي وضعت ارتفاع تركيزات العقاقير المثبطة الدنيا. في اثنين من أزواج، عزل الثاني لكل زوج وضع مقاومة اتشينوكاندينس. عزل ثاني زوج الثالثة وضعت المقاومة إلى 5-فلوسيتوسيني. المتبقية المؤلفة من عرضه ومقاومة الازول يعزل. وتأكدت النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات المرتبطة بالمقاومة اتشينوكاندين والازول فلوسيتوسيني 5 في يعزل مقاومة من خلال الأفرقة العاملة لاستخدام تسلسل الجيل القادم. بطانات عدم مرادفة في مقاومة الفطريات وتم تحديد الجينات مثل FKS1، FKS2، CgPDR1، CgCDR1 ، و FCY2 . وعموما، في متوسط 98% القراءات WGS من يعزل صناعي جيم- المعينة للجينوم مرجع مع تغطية حوالي 75-fold عمق القراءة. المدة الزمنية والتكلفة كانت مماثلة سانغر التسلسل.
وفي الختام، WGS صناعي جيم- كان ممكناً في الكشف عن الطفرات الجينية سريرياً هامة تشارك في المقاومة لفئات مختلفة من العقاقير المضادة للفطور دون الحاجة إلى عدة ردود فعل تسلسل بكر/الحمض النووي. وهذا يمثل خطوة إيجابية نحو إنشاء قدرة الأفرقة العاملة في المختبرات السريرية للكشف المتزامن استبدالات تخول المقاومة المضادة للفطور.
المقدمة
هو صناعي المبيضات ممرض مصادفة على نحو متزايد بأهمية الأنواع الذي يسلك المقاومة الآزولات وكذلك في الآونة الأخيرة،2،1،اتشينوكاندينس3. على عكس مثنوية المبيضة، فرداني جينوم صناعي جيم- قد تسمح لها بالحصول على الطفرات وتطوير المقاومة للعقاقير المتعددة بسهولة أكبر. وأفادت المقاومة المشارك فئات المخدرات على حد سواء كان أيضا4. ومن ثم، التقييم المبكر لقابلية المضادة للفطور والكشف عن المقاومة للعقاقير في جيم-صناعي أمر حاسم للعلاج الصحيح، وهادفة، وكذلك كما هو الحال في سياق الإشراف مضاد للحد من العوامل المحركة لمقاومة مضادات المي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكان لا الموافقة الأخلاقية المطلوبة لهذه الدراسة.
1-إعداد ثقافة فرعية والعدوى صناعي المبيضات
- حدد فريق يعزل C.glabrata من الدراسة التي ينبغي أن تشمل أيضا واحد على الأقل صناعي جيم- أمريكية نوع الثقافة جمع (ATCC) مع نمط حساسية معروفة.
- ثقافة فرعية عزل لمس مستعمرة واحدة باستخدام حلقة بلاستيك القابل للتصرف عقيمة و streaking على سكر العنب أجار سابوراود (حزب العمل الديمقراطي) لوحة8.
- احتضان لوحة حزب العمل الديمقراطي ح 24-48 في 35 درجة مئوية لثقافة نقية من عزل مع نمو جيد.
2-تحديد قابلية مضاد فطري
- استخدام حلقة بلاستيك القابل للت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ثلاثة عشر درست صناعي جيم- تضم صناعي C. ATCC 90030 و 12 يعزل من سريرية علم الفطريات المختبر (يعزل CMRL1 إلى CMRL12)، مستشفى Westmead، سيدني (الجدول 1). وشملت هذه ثلاثة أزواج من يعزل كمرل-1/كمرل-2، كمرل-3/كمرل-4 وكمرل-5/كمرل-6 التي تم الحصول عليها قبل وبعد العلاج بالأدوية المضادة للفطور لا تربطها أية صلة وبائية بين هذه 24 (الجدول 1).
وحددت البلدان المتوسطة الدخل استخدام كلسي التفسيرية نقطة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحدد هذه الدراسة الجدوى والحدود الزمنية التقريبية والدقيقة الموجهة بالأفرقة العاملة للكشف عن مقاومة العقاقير في جيم-صناعي. وكان الزمنية (تأت) اللازمة لإعداد مكتبة وتسلسل أربعة أيام، والإبلاغ عن نتائج تحليل 1-2 يوما. ويقارن هذا مع على الأقل مبلغ مماثل تأت لفحوصات الحساسية من لوحات الثقافة وسانغر التسلسل مع رقم أعلى بكثير من العينات. نحو يمكن تسلسل جينوم صناعي جيم- 30-90 استناداً إلى تسلسل القدرة تدفق الخلية، مع تغطية تسلسل 80-100%. حيث تم إجراء التسلسل في إعداد مختبر WGS داخلية، الاحتياجات من الموارد/الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية ولا يوجد تضارب في الكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل المركز للأمراض المعدية وعلم الأحياء المجهرية، والصحة العامة. المؤلفين لم تتلق أي تمويل آخر لهذه الدراسة. يشكر المؤلفون Drs أليسيا ارنوت، باخمان ناثان ورانجيتا مينون لمشورة الخبراء والمساعدة مع التجربة تسلسل الجينوم كله.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DensiCHECK Plus | BioM & eacute ؛ يستخدم مقياس الكثافة | K083536 | Rieux Inc لقراءات McFarland |
| أنظمة تشخيص Sensititre YeastOne | TREK ، | YO10 | مع الأدوية القياسية المضادة للفطريات. |
| التلقيح والإبر التي يمكن التخلص منها من Fisherbrand | Fisher Scientific ، Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | يمكن استخدام الحلقات البلاستيكية التي يمكن التخلص منها مباشرة من العبوة. لا يلزم اشتعال. |
| الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf Safe-Lock | Sigma Aldrich ، Merck | T2795 ؛ | حجم 2.0 مل, طبيعي |
| ZYMOLYASE 20T من Arthrobacter luteus | MP Biomedicals، LLC | 8320921 | تستخدم لتحلل جدار الخلية للعزلة الفطرية قبل استخراج الحمض النووي |
| معالج تنقية الحمض النووي الجينومي ؛ | Promega | A1120 | هل 100 استخراج الحمض |
| النووي Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | ؛ كاشف Picogreen المشار إليه باسم صبغة الفلورسنت في البروتوكول. يتضمن معيار Lambda DNA وكاشف picogreen للمقايسة. |
| Nextera XT DNA عينة إعداد | Illumina | FC-131-1096 | يتضمن مربع 1 ومربع 2 & nbsp ؛ الكواشف ل 96 عينة |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001 ، FC-131-2002 ، FC-131-2003 ، FC-131-2004 | مجموعة الفهرس A مجموعة الفهرس B مجموعة الفهرس C مجموعة الفهرس D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 & nbsp; | Illumina | FC-404-2004 | 300 دورة ، أكثر من 250 عينة لكل مجموعة |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 دورة ، أكثر من 130 عينة لكل مجموعة |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | لترتيب المؤشرات من مجموعة الفهرس بالترتيب |
| TruSeq Index Plate Fixture | Kit FC-130-1005 | ؛ 2 تركيبات | |
| KAPA مكتبة القياس الكمي Kit لتسلسل الجيل | KAPA Biosystems | KK4824 | يتضمن معايير مسبقة الصنع ومواد أولية ونظام معالجة السوائل MasterMix |
| Janus NGS Express | يستخدم PerkinElmer | YJS4NGS | لتخفيفات الحمض النووي أثناء التسلسل |
| ؛ 0.8 مل لوحة تخزين | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate لتنظيف مكتبة الحمض النووي و تطبيع |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | ؛ الخرز المغناطيسي في محلول لتنقية المكتبة |
| الحامل المغناطيسي 96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | يستخدم لتنقية الحمض النووي القائم على الخرزة المغناطيسية |
| OrbiShaker MP & nbsp ؛ | شاكر لوحة Benchmark Scientific | BT1502 | 96 جيدا مع 4 منصات |
| لوحة PCR صلبة قذيفة | BioRad | HSP9601 | جدار رقيق ، 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II & nbsp ؛ | Roche | 5015278001 | تستوعب 96 لوحة بئر |
| Microseal 'B' PCR لوحة ختم الفيلم ، لاصق ، بصري & nbsp ؛ | BioRad | MSB1001 | واضح 96 بئر ألواح السدادة |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software لتحليل البيانات ، الإصدار 8 |
| NextSeq500 أداة | Illumina & nbsp ؛ | Illumina | جهاز التسلسل على الطاولة لتسلسل الجيل التالي |
المراجع
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
