تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Kathrin Davari; Johannes Lichti; Caroline C. Friedel; Elke Glasmacher

doi:10.3791/56752

مقالة منهجية

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

DOI:

10.3791/56752

⸱

مارس 7, 2018

Kathrin Davari^*¹ , Johannes Lichti^*¹ , Caroline C. Friedel² , Elke Glasmacher¹^,³

¹Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, ²Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, ³Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول اندماجي استخدام رقاقة seq 4sU seq، وتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع والريبوسوم التنميط لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. فإنه يمكن تتبع التغييرات في النسخ-عامل ملزم، النسخ حيثياته وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، ودوران والترجمة على مر الزمن، وعرض مسار الأحداث عموما في الخلايا المنشط و/أو المتغيرة بسرعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند التنشيط، تغيير الخلايا سريعاً على البرامج الفنية، ومن ثم صورتها التعبير الجيني. تحدث تغييرات هائلة في التعبير الجيني، على سبيل المثال، خلال التمايز الخلوي و morphogenesis والتحفيز الوظيفي (مثل تنشيط الخلايا المناعية)، أو بعد التعرض للمخدرات وعوامل أخرى من البيئة المحلية. اعتماداً على نوع التحفيز والخلية، هذه التغيرات تحدث بسرعة وعلى أي مستوى ممكن لتنظيم الجينات. عرض جميع العمليات الجزيئية للخلية المستجيبة لنوع معين من مدمني المخدرات التحفيز واحدة من أصعب المهام في البيولوجيا الجزيئية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يتيح التحليل المتزامن لطبقات متعددة من تنظيم الجينات. قارنا، على وجه الخصوص، عامل النسخ ملزمة (الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن-تسلسل (الرقائق-seq)) والنسخ دي نوفو (4-ثيوريديني-تسلسل (4sU-seq))، وتجهيز مرناً، ودوران، فضلا عن الترجمة (الريبوسوم إنشاء تشكيل جانبي). وبالجمع بين هذه الأساليب، من الممكن لعرض مسار عمل مفصلة والجينوم على نطاق المنظومة.

تسلسل الحمض النووي الريبي يدون حديثا ينصح خاصة عند تحليل سرعة تكييف أو تغيير الأنظمة، حيث يصور هذا النشاط الترانسكربتي من جميع الجينات خلال وقت التعرض 4sU (بغض النظر عما إذا كانوا حتى-أو دوونريجولاتيد). بالإضافة إلى ذلك يسمح اندماجي استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع والتنميط الريبوسوم في حساب معدلات الدوران وترجمة الرنا. ويتيح تحليل Bioinformatic نتائج التسلسل الفائق للعديد من الوسائل لتحليل وتفسير البيانات. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن أيضا تتبع الربط كوترانسكريبشونال والبديلة، اكتفى هنا بذكر عدد قليل من النتائج المحتملة.

يمكن تطبيق النهج الموحد المذكور هنا للكائنات نموذج مختلفة أو أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، ونحن توفير بروتوكولات مفصلة لكل أسلوب استخدامها، بما في ذلك عمليات مراقبة الجودة، ومناقشة المشاكل والمخاطر المحتملة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة، أصبح الجيش الملكي النيبالي-تسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) أداة قياسية لتحليل الكشف عن جميع داخل خلية أو الكائن حي¹. ومع ذلك، فهم العملية برمتها من الخلايا تكييف استجابة لحافز/دواء معين، من الضروري تماما تحديد جميع العمليات الأساسية، بدءاً من النسخ مرناً للتجهيز، والدوران، والترجمة. لا يكاد يمكن أن تقاس التغيرات القصيرة الأجل في الجيش الملكي النيبالي النسخ بإجمالي رناسيق، نظراً للتغييرات في الجيش الملكي النيبالي إجمالي تعتمد على عوامل مثل الحمض النووي الريبي نصف حياة ونشاط النسخي، التي قالب فقيرة لتعكس تكيف الخلايا إلى الآثار البيئية²^،³. وفي الواقع، تم وضع مجموعة متنوعة من التقنيات الجديدة للتسلسل التي تسمح بإجراء تحليل لمختلف خطوات عملية الجينات اللائحة⁴ عندما تقترن بالطريقة الصحيحة. ويصف هذا البروتوكول كيفية الجمع بين بعض تسلسل يسهل تطبيقها بدلاً من التقنيات التي تسمح لتتبع تنظيم الطبقات الأساسية مرناً بطريقة نسبية. لتحليل النشاط الترانسكربتي، وقد وصف مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل كاب-تحليل الجينات التعبير (كيج)⁵، واستطالة الأصلية نسخة التسلسل (صافي-seq)⁶وعلى نطاق الجينوم النووي التحضير (غرو-seq)⁷ ^, ⁸، فضلا عن بروموريديني-تسلسل (Bru-seq) و 4-ثيوريديني-تسلسل (seq-4sU)، التي تستخدم نواتج الأيض التي أدرجت حديثا في نسخها من الجيش الملكي النيبالي⁹^،¹⁰، فقط على سبيل المثال لا الحصر. القفص ويحدد موقع بدء النسخ الدقيقة، seq صافي وغرو seq تقديم معلومات أكثر دقة حول قراءة الاتجاهات ويكشف seq 4sU (وهي الطريقة الموضحة هنا) إلا حديثا نسخها الجيش الملكي النيبالي. مع ذلك، 4sU seq حساسة للغاية ويمكن أن تطبق في أطر زمنية مختلفة لقياس كمية النشاط النسخي في تغيير نشاط الخلايا، فضلا عن التغيرات الكمية في تجهيز مرناً (الذي يحدث في غضون دقائق)⁹^، ¹¹^،¹². وعلاوة على ذلك، 4sU seq مثالية للجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي لحساب معدلات دوران الحمض النووي الريبي للجينات⁹. يضطلع نسخ مرناً بالثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابيي)، التي بدورها تتأثر بالعديد من العوامل، مثل عوامل النسخ والتعديلات هيستون وتفعيل/ريبريسورس العامة حتى يمكن أن تكون جزءا من النسخي المعقدة. لاختبار كيفية العديد من الجينات/المروج/محسن مناطق مرتبطة بعامل واحد، وضعت رقاقة seq، الذي هو الآن الطريقة القياسية لهذا الغرض، بسبب العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجارياً¹³. ومع ذلك، على الرغم من أن تشيبسيق يعطي معلومات واضحة بشأن تنظيم العوامل حيث ربط، أنها لا تعكس إذا كان الفعل يؤدي إلى تغييرات في النسخ¹⁴. ولذلك، أداء رقاقة seq مع 4sU seq هو مزيج مثالي لمثل هذه المسائل البيولوجية. تنظيم التعبير الجيني يمكن أن يحدث أيضا في مرحلة لاحقة، نظراً لمستويات البروتين ومرناً لا ترتبط بالضرورة¹⁵^،¹⁶، مشيراً إلى تنظيم كبير محتمل على متعدية أو بوستترانسلاشونال مستوى، تبعاً للسياق. في عام 2011، الريبوسوم التنميط أدمجت أولاً بتسلسل الحمض النووي الريبي، وهو الأسلوب المفضل لقياس التغيرات التي تحدث في سرعة في البروتين، حيث لا تزال هناك بعض حدود حساسية مع الطيف الكتلي¹⁷الآن. في الواقع، أظهرت أسعار الترجمة التي تم الحصول عليها من هذه الأساليب لتقديم تقدير جيد نسبيا للتغييرات في مستويات البروتين (على الأقل قياس التغيرات الطويلة الأجل) والسماح بطريقة عرض أكثر تفصيلاً في عملية الترجمة، مثلاً تحديد الترجمة الجانب ابدأ، والبديل إطارات¹⁷. استخدام جميع الأساليب الأربعة اندماجي يمكن استخدامها في حالة مستقرة، بين مختلف أنواع الخلايا، أو في وقت-مسلسل التجربة الخلايا المتغيرة بسرعة¹¹. هذا الاستخدام لمحة عامة على نطاق الجينوم للتغييرات في ربط عامل النسخ التي تؤثر على الحمض النووي الريبي النسخ وتجهيزها، والترجمة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الأساليب يتم وفقا والامتثال للمبادئ التوجيهية المؤسسية والدولة الاتحادية Zentrum München هلمهولتز.

1-إعداد

تقديم خطة مفصلة للإعداد التجريبية بما في ذلك وضع جدول زمني، عند إضافة 4sU إلى مستنبت الخلية، وعندما الحصاد الخلايا لكل أسلوب. حسب المسألة البيولوجية، النظر بعناية النقاط الزمنية لنموذج الرسم والوسم 4sU الوقت وتركيز (الجدول 1).
ملاحظة: التحقق من تأثير 4sU على بقاء الخلية، وأشدد على الاستجابة مقدما (انظر "التحقق من العلامات 4sU الظروف المثلى" في نتائج الممثل و الشكل 1). ينصح بإجراء اختبار أولى لكل أسلوب مع عينة واحدة على الأقل. تحقق من إذا كان نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي/الحمض النووي كافية لتسلسل العميقة (انظر كرست أجزاء من البروتوكول)، والممارسة بسرعة لكن معالجة رقيقة من الخلايا أثناء التجربة.
حساب عدد الخلايا بحاجة لكل نقطة الوقت لكل أسلوب (انظر الجدول 2 لإجراء تقدير تقريبي عند استخدام خلايا تي الأولية). أيضا، النظر في تسلسل العينات أقل من مجموع الجيش الملكي النيبالي من ذلك تماما من الجيش الملكي النيبالي 4sU (مثلاً، فقط لأسعار الترجمة نقطة الوقت أو دوران الجيش الملكي النيبالي أن تحسب معدلات). للتأكد والتحقق من أهمية النتائج (مستحسن)، إنشاء تكرار البيولوجية واحدة على الأقل.
ملاحظة: الأهم من ذلك، لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، العينات يجب أن تكون من نفس تجمع بدءاً من الخلايا. ويوصي الباحث مخصص واحد على الأقل لكل أسلوب.
إعداد كل ما يلزم في وقت مبكر (مثلاً، 4sU الكوتيد، سيكلوهيكسيميدي، و "الثدييات تحلل العازلة"، وفورمالدهايد 1%). بعد إضافة 4sU، تجنب تعريض الخلايا للضوء الساطع، كما قد يؤدي هذا إلى كروسلينكينج من الجيش النيبالي الملكي المسمى 4sU للبروتينات الخلوية¹⁸.
تجمع كافة الخلايا ذات الاهتمام في قارورة واحدة فقط قبل المعالجة (الشكل 2). عد الخلايا (مثلاً، مع هيموسيتوميتير) واستخدم المبلغ المطلوب لمراقبة كل أسلوب المعالجة (لا ننسى أيضا تسمية عنصر التحكم غير المعالجة ل seq 4sU مع 4sU). علاج الخلايا المتبقية ومباشرة تقسيم العدد المطلوب من الخلايا لكل نقطة الوقت والأسلوب. التعامل مع الخلايا، في أسرع وقت ممكن للتقليل من الإجهاد نتيجة للتغيرات في درجة الحرارة أو مستويات₂ CO.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم أخذ عينات ح 1، ح 2، ح 3 بعد العلاج، ثم يستخدم ربع الخلايا لعنصر التحكم غير المعالجة وثلاثة أرباع تستخدم لمراقبة المعالجة.

2-4sU--الوسم

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من Rädle، وآخرون. ¹⁹ راجع على بروتوكول للحصول على معلومات إضافية فيما يتعلق بوضع العلامات الاستقلابية مع 4sU. لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، والعينات يجب أن تنبع من نفس تجمع بدءاً من الخلايا.

بدء وضع العلامات
1. ذوبان الجليد 4sU الكوتيد قبل الاستخدام. إضافة 4sU في كل وقت نقطة مباشرة إلى المتوسطة التي تحتوي على خلايا ذات الاهتمام (راجع الجدول 2 لأرقام الخلية T المستحسنة، أقل من الحمض النووي الريبي 60 ميكروغرام كل نقطة الوقت)، تخلط بلطف، ووضع مرة أخرى في الحاضنة. التخلص المتبقية 4sU (عدم تجميد).
2. في نهاية الوسم، جمع الخلايا (مثلاً، مكشطة الخلية) وأجهزة الطرد المركزي في 330 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنابيب البولي بروبلين (التي تقاوم القوات ز عالية). نضح المتوسطة وإضافة كاشف لعزل الحمض النووي الريبي (إيه وان مل كل 3 × 10⁶ خلايا، انظر المواد للتوصية التي لاستخدام) لكل أنبوبة. ريسوسبيند بيليه (إيه وان مل كل 3 × 10⁶ خلايا) تماما، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، وتجميد عينات من-20 درجة مئوية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
  تنبيه: الكواشف المستخدمة لعزل الحمض النووي الريبي خطرة للغاية عند الحصول على اتصال مع الجلد أو العينين. التعامل مع هذه الرعاية والنظر في تعليمات الأمان.
الجيش الملكي النيبالي باستخدام إعداد تعديل للبروتوكول عزل الحمض النووي الريبي
1. إضافة كلوروفورم 0.2 مل كل 1 مل كاشف لعزل الحمض النووي الريبي، ومزيج دقيق من الهز لمتابعة 15 س. كما ورد في بروتوكول وضع العلامات الأيضية (الخطوة 1-12، 2. الجيش الملكي النيبالي باستخدام إعداد تعديل لبروتوكول تريزول) من Rädle وآخرون. ¹⁹
2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد)، ووفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام هذا الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع كذلك (راجع الخطوة رقم 3. مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي) أو تخزينها في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
بيوتينيليشن ثيول محددة من الحمض النووي الريبي يدون حديثا
1. بدء تشغيل مع 30-80 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي الخلوية. 60 ميكروغرام الحمض النووي الريبي ينبغي أن تسفر عن كميات كافية من الحمض النووي الريبي يدون حديثا.
2. إعداد رد فعل وضع العلامات. ماصة بالترتيب التالي (لكل ميكروغرام الرنا): 1 ميليلتر 10 × بيوتينيليشن المخزن المؤقت، 7 ميليلتر الحمض النووي الريبي (تحتوي على 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي تضعف في خالية نوكلاس ح₂س)، و 2 ميليلتر البيوتين-هبدب (1 ملغ/مل). إضافة البيوتين-هبدب آخر وخلط فورا قبل بيبيتينج. لف الأنابيب برقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء الساطع. انظر مناقشة لبديل البيوتين-هبدب. تبني على RT ل 1.5 ح بالتناوب.
3. أنابيب مناسبة 2 مل الطرد المركزي (انظر الجدول للمواد) في 15,000 س ز 2 كحد أدنى "الماصة؛" كل من بيوتينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي في أنبوب قبل نسج 2 مل وإضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم والمزيج بقوة. احتضان ل 2-3 دقيقة حتى تبدأ المراحل منفصلة وفقاعات ابدأ أن تختفي.
4. أجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العليا بعناية في أنبوب جديد.
5. كرر الخطوات من 2.3.3. و 2.3.4. مرة واحدة. إضافة 10% من حجم كلوريد الصوديوم (م 5) ووحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول إلى مرحلة مائي. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
6. قم بإضافة وحدة تخزين تساوي طازج الإيثانول 75%. الطرد المركزي في 20,000 خ زاي تجاهل المادة طافية وتدور بإيجاز، وإزالة الإيثانول المتبقية. ريسوسبيند تماما في 30-100 ميليلتر ح₂س (استخدام ميليلتر 1 ح₂س الواحدة 1 ميكروغرام رنا الإدخال من الخطوة 2.3.1) عن طريق خلط ماصة.
7. التحقق من تكامل الجيش الملكي النيبالي بتحليل الغرواني الكهربي، أو تأخذ قاسمة والتحقق في وقت لاحق.
فصل حديثا نسخها (المسمى) و Preexisting الحمض النووي الريبي (غير مسمى)
1. إزالة حبات باراماجنيتيك (انظر الجدول للمواد) من مخزن 4 درجات مئوية والسماح لها الوقوف لمدة 30 دقيقة على الأقل لتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة. الحرارة 4sU الغسيل العازلة (3 مل كل عينة) إلى 65 درجة مئوية.
2. إعداد حل ديثيوثريتول (DTT) 100 مم. وزن القيمة على نطاق جيد جداً وإضافة الكمية المطلوبة من المياه خالية من نوكلاس. دائماً إعداد جديدة. استخدام 200 ميليلتر كل عينة.
3. الحرارة بيوتينيلاتيد عينات الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام/ميليلتر) إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تجريدها وفورا على الجليد. إضافة 100 ميليلتر streptavidin الخرز إلى بيوتينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة بالتناوب.
4. ضع عمود مناسبة (انظر الجدول للمواد للتوصيات) لكل عينة في موقف المغناطيسية، وحجته قبل كل عمود مع المخزن المؤقت للغسيل 4sU درجة حرارة الغرفة 1 مل.
  ملاحظة: هذا سوف يستغرق حوالي 5-10 دقيقة. إذا كان أي من الأعمدة لا تبدأ تجفيف بعد 5 دقائق، اضغط برفق على رأس العمود مع إصبع القفاز.
5. تطبيق مزيج الحمض النووي الريبي/خرز في وسط كل عمود. تجاهل التدفق عبر، إلا إذا كان غير مسمى الجيش الملكي النيبالي بحاجة إلى استردادها. إذا كان الأمر كذلك، جمع في التدفق من خلال والغسيل الأولى على الأقل. إجراء استرداد الجيش الملكي النيبالي كما وصفها Rädle et al. (الخطوة 1-7، 7. الاسترداد من الحمض النووي الريبي غير مسمى، غير منضم)¹⁹.
6. تغسل ثلاث مرات مع 0.9 مل 4sU الغسيل المخزن المؤقت (يسخن إلى 65 درجة مئوية من الخطوة 2.4.2.) و 0.9 مل الرايت 4sU الغسيل المخزن المؤقت، على التوالي.
7. استخدم الخرز باراماجنيتيك لاسترداد رنا يدون حديثا. "الماصة؛" 400 ميليلتر من المشتتين جيدا RT الخرز باراماجنيتيك في أنبوب للعينة ومكان تحت كل عمود. الوت رنا يدون حديثا مع 100 ميليلتر 100 مم DTT. انتظر لمدة 3 دقائق والقيام شطف ثانية مع 100 ميليلتر 100 مم DTT. (اختياري: أداء شطف والانتعاش كما وصفها Rädle et al.) ¹⁹
8. ميكس نسخها من الحمض النووي الريبي/الخرز جيدا قبل ماصة خلط 10 مرات والمضي قدما وفقا للمبدأ التوجيهي الخاص بالشركة المصنعة حديثا. الوت الجيش الملكي النيبالي في 11 ميليلتر خالية نوكلاس ح₂فلوروميتير مناسبة باستخدام الحمض النووي الريبي O.Quantify (انظر الجدول للمواد). ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
  حديثا تدوين ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي الريبي لإعداد مكتبات كدنا لتسلسل الجيل القادم (انظر الجدول للمواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم) أو مزيد من التحليلات المتلقين للمعلومات. 100-500 نانوغرام الحمض النووي الريبي كافية لمعظم مجموعات إعداد مكتبة (انظر المناقشة).

3-بلغ مجموع الجيش الملكي النيبالي-Seq

مباشرة أن الجيش الملكي النيبالي من 4sU المسماة الجيش الملكي النيبالي بعد إعداد الجيش الملكي النيبالي باستخدام كاشف تعديل للبروتوكول عزل الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع (راجع الخطوة 2.2.2).
لإعداد مكتبة، تضعف قاسمة الحمض النووي الريبي لتركيز نهائي من 50-100 نانوغرام/ميليلتر. استخدم هذه المجموعة نفسها فيما يتعلق بإعداد المكتبة للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا. 100-500 نانوغرام الحمض النووي الريبي كافية لمعظم مجموعات إعداد المكتبة.

4-الريبوسوم التنميط

ملاحظة: لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، يجب أن تكون العينات من نفس تجمع بدءاً من الخلايا. تقديم توصيات بشأن أي طقم للاستخدام، أرجع إلى الجدول للمواد.

إعداد وعزل الريبوسوم المحمية بشظايا (المفاضلة):
1. استخدام الكميات المناسبة من الخلايا لكل نقطة الوقت (الرجوع إلى الجدول 2 لأرقام الخلية تي الموصى بها). علاج الخلايا ملتصقة مع سيكلوهيكسيميدي كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  تنبيه: سيكلوهيكسيميدي عالية السمية، وقد تتسبب في حدوث طفرات. تجنب تماس الجلد والاستنشاق.
2. أشر إلى أنبوب البولي بروبلين واحد جمع وتجمع غير-أو شبه-أدهيرينت الخلايا من كل الوقت وضبط تركيز النهائي إلى 1 × 10⁶ خلايا كل مل المتوسطة خلية على حدة (مثلاً، ربمي المكملة للخلايا T). إضافة سيكلوهيكسيميدي بتركيز نهائي من 0.1 مغ/مل ومزج بعكس الأنبوب البولي بروبلين واحتضانها للحد الأدنى 1 خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 330 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع مالا يقل عن 10 مل برنامج تلفزيوني وتستكمل مع سيكلوهيكسيميدي (تركيز النهائي من 0.1 مغ/مل).
3. خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 330 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة وإضافة 100 المخزن المؤقت إلى تحلل خلايا الثدييات ميليلتر من كل 10 × 10⁶ خلايا. مزيج من بيبيتينج وطرد من خلال إبرة 25-قياس 22 عقيمة الخلايا تماما.
4. نقل الخلية ليستي إلى أنبوب بريكوليد 1.5 مل. احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد بالعكس الدوري. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لتوضيح. نقل المادة طافية إلى أنبوب بريكوليد 1.5 مل.
5. إعداد 01:10 إضعاف مع المياه خالية من نوكلاس وسجل A₂₆₀قراءة باستخدام جهاز المطياف الضوئي. استخدام مياه خالية من نوكلاس كقرص فارغ و 01:10 إضعاف المخزن المؤقت لتحلل الخلية الثديية كالمعيار. حساب تركيز/mL₂₆₀ألف من وفقا للمعادلة التالية:
  (₂₆₀ خلية-₂₆₀ الثدييات تحلل العازلة) × معامل التخفيف 10 =/mL₂₆₀
6. إنشاء 200 ميليلتر مختبرين لعلى الجليد، والمضي قدما في معالجة نوكلاس.
  ملاحظة: بشكل اختياري، إعداد 100 ميليلتر الكوة لمجموع الجيش الملكي النيبالي وإضافة 10 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% ومزيج. تخزين في 4 درجات مئوية، والمضي قدما في 4.3.2. من المستحسن استخدام مجموع الجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU (راجع الخطوة رقم 3. الجيش الملكي النيبالي إجمالي-seq).
Footprinting الريبوسوم
1. تنفيذ المعاملة نوكلاس فورا دون تجميد. إضافة وحدات 7.5 من نوكلاس (المدرجة في هذه المجموعة الموصى بها) لكل ألف إلى₂₆₀من ليستي. فعلى سبيل المثال: 80 ألف₂₆₀/mL × 0.2 مل × 7.5 يو/A₂₆₀نوكلاس = 120 ش نوكلاس.
  ملاحظة: بشكل اختياري، تيتراتي نوكلاس الهضم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
2. تبني رد فعل نوكلاس لمدة 45 دقيقة في الرايت مع خلط لطيف. تجميد 200 ميليلتر مختبرين مع النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية، أو التوقف عن رد فعل نوكلاس بإضافة 15 ميليلتر رناسي مثبط لكل 200 ميليلتر الكوة، وتابع مع الخطوة 4.3.2.
تنقية للمفاضلة
1. إلغاء تجميد عينة واحدة للمفاضلة نوكلاس هضمها وإضافة 15 ميليلتر رناسي المانع. تبقى العينات على الجليد.
2. تنقية المفاضلة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (يوصي بتنقية العمود) وقياس تركيز الحمض النووي الريبي على جهاز المطياف الضوئي.
الرنا الريباسي استنفاد
1. استخدام 5 ميكروغرام للمفاضلة المنقي لاستنفاد الرنا الريباسي.
2. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 1-2، ونضوب الرنا الريباسي الأولية) لاستنفاد الرنا الريباسي. قياس تركيز الحمض النووي الريبي الرنا الريباسي المنضب المفاضلة على جهاز المطياف الضوئي.
تنقية صفحة للمفاضلة
1. استخدام 500 نانوغرام من الرنا الريباسي المستنفد المفاضلة لتنقية صفحة.
2. إعداد التحكم في الجيش الملكي النيبالي والعينات وسلم لتنقية صفحة. مزيج 5 ميليلتر مراقبة الجيش الملكي النيبالي، ويشوه 5 ميليلتر هلام تحميل صبغ في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل. ميكس 10 ميليلتر من الجبهة الوطنية الرواندية كل مع 10 ميليلتر من يشوه جل تحميل، على التوالي. إعداد سلم الكوة (ميكروليتر 4 20/100 سلم والمياه خالية من نوكلاس 1 ميليلتر، ويشوه 5 ميليلتر هلام صبغ التحميل). تحميل فإنه بين كل عينة والسيطرة لمنع كروسكونتامينيشن.
3. تؤذي سلم والعينات التي تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع فورا على الجليد. تحميل 20 ميليلتر لكل عينة (اختيارياً، تحميل 10 ميليلتر وتجميد المتبقي العينات عند 20 درجة مئوية) مفصولة بواسطة 10 ميليلتر سلم مستعدة على جل يوريا-polyacrylamide 12% أو 15%. تحميل 10 ميليلتر لمراقبة الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام حتى يصل إلى الفرقة بروموفينول الأزرق أسفل الجل (180 الخامس، ~ 70 دقيقة) (الشكل 3).
4. وصمة عار الجل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في 4 درجات مئوية. استخدام ترانسيلوميناتور الظلام--الميدانية التي تنبعث الضوء الأزرق لتصور الجيش الملكي النيبالي. المكوس جل شرائح لكل عينة تناظر ~ 28 و 30 nt في الطول. السيطرة على الجيش الملكي النيبالي كمرجع والمكوس عليه.
  ملاحظة: تكون المفاضلة لا يكاد مرئية. الرسوم على الشرائح بالحجم المبين بسيطرة الجيش الملكي النيبالي--التي تحتوي على أوليجوس اثنين من nt 28 و 30 في الطول--حتى إذا كانت العينات غير مرئية.
5. ثقب ثقب في الجزء السفلي من أنابيب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل بإبرة 20-قياس عقيمة. نقل كل شريحة جل في أنبوب منفصل وأنابيب مكان توج في أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 12,000 س زاي تكرار الطرد المركزي إذا لم يتم اجاد شرائح جل تماما في أنبوب 1.5 مل.
6. الوت الجيش الملكي النيبالي من شرائح جل تعطلت مع 400 ميليلتر المياه خالية من نوكلاس و 40 خلات الأمونيوم ميليلتر (م 5) 2 ميليلتر الحزب الديمقراطي الصربي (10%) كل ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
7. نقل الملاط إلى 1.5 مل تصفية أنابيب (تقدم مع عدة الموصى بها) مع تلميح ماصة 1 مل (نصيحة تحمل على نطاق أو تلميح عصامي 1 مل مع نهاية قطع). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 2,000 س ز لفصل التيد الجيش الملكي النيبالي من جل الشرائح. بلطف "الماصة؛" محلول مائي في أنبوب 1.5 مل. إضافة 2 ميليلتر الجليكوجين (تقدم مع عدة الموصى بها) و 700 الايزوبروبانول 100% ميليلتر ومخزن في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
8. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في غ. س 13,000 تجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع الإيثانول 80% طازجة مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 13,000 س زاي تجاهل المادة طافية وأيردري. ريسوسبيند كل عينة في 20 ميليلتر وسيطرة الجيش الملكي النيبالي في 8 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر. تخزين في-20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
تجزئة، الإصلاح نهاية، 3 ' ربط محول، النسخ العكسي
1. تنفيذ الإجراء كما هو موضح بالبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (التجزؤ ونهاية إصلاح محول ربط 3 '، والنسخ العكسي).
صفحة تنقية كدنا
1. إعداد العينات ومراقبة الجيش الملكي النيبالي وسلم لتنقية الصفحة: مزيج 10 ميليلتر من كل عينة ومراقبة الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميليلتر يشوه جل تحميل صبغ، على التوالي. إعداد سلم الكوة (4 سلم ميليلتر 20/100، 1 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر، 5 ميليلتر يشوه جل تحميل صبغ). تحميل فإنه بين كل عينة والسيطرة لمنع كروسكونتامينيشن.
2. تؤذي سلم والعينات التي تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع فورا على الجليد. تحميل 20 ميليلتر لكل عينة (اختيارياً، تحميل 10 ميليلتر وتجميد المتبقي العينات عند 20 درجة مئوية) مفصولة بواسطة 10 ميليلتر من سلم مستعدة على 10% بولياكريلاميدي/7-8 م اليوريا/TBE هلام. تحميل 10 ميليلتر لمراقبة الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام حتى بروموفينول الأزرق يهاجر تماما من الهلام (180 الخامس، ~ 60 دقيقة).
3. وصمة عار الجل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في 4 درجات مئوية. استخدام ترانسيلوميناتور الظلام--الميدانية التي تنبعث الضوء الأزرق لتصور الجيش الملكي النيبالي والمكوس جل الشرائح من كل عينة تناظر nt ~ 70-80.
4. تابع كما هو موضح في الخطوة 4.5.5-4.5.8 وريسوسبيند كل عينة في المياه خالية من نوكلاس 10 ميليلتر.
كدنا على
1. إعداد مزيج الرئيسي على ما يكفي لجميع ردود الفعل من خلال الجمع بين الكواشف التالية لكل عينة على الجليد: ميليلتر 4.0 على رد فعل مزيج و 2.0 ميليلتر ATP، 2.0 الحركة ميليلتر₂، ميليلتر 2.0 ليجاسى.
2. إضافة 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل عينة. المزيج بلطف والطرد المركزي بإيجاز. احتضان العينات عند 60 درجة مئوية ل 2 حاء على الفور مكان العينات على الجليد.
[بكر] تضخيم
1. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 1-3، [بكر] تضخيم) للتضخيم PCR. استخدام 4 ميليلتر من كدنا سيركولاريزيد للتضخيم مع 9 دورات PCR لخلايا تي أولية، لتحقيق أفضل النتائج.
2. تنقية المكتبات والتدقيق على توزيع الحجم، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 4-8, [بكر] تضخيم). هو الحجم المتوقع للمكتبة تضخيم bp 140-160 (انظر الشكل 4).
3. لترتيب المكتبات، الرجوع إلى مرفق التسلسل لمزيد من التوجيه والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

5-شرائح-Seq

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من Blecher-جونين، وآخرون. ¹⁴ الرجوع إلى بروتوكول بهم لمزيد من المعلومات فيما يتعلق بما يليها رقاقة لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، يجب أن تكون العينات من نفس تجمع بدءاً من الخلايا.

Crosslinking وحصاد الخلايا
1. التشعب عدد مناسب من الخلايا (الرجوع إلى الجدول 2 لأرقام الخلية تي الموصى بها) لكل نقطة الوقت بتركيز نهائي من 1% فورمالدهايد في متوسط سيلسبيسيفيك (مثلاً، ربمي المكملة لخلايا تي) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. التوقف عن رد فعل كروسلينكينج بإضافة جليكاين إلى نهائي تركز 0.125 M.
2. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني المثلج. كرر الخطوة 5.1.2 مرتين وتجميد الخلايا الكريات في-80 درجة مئوية. ويمكن تخزين الكريات مجمدة لمدة 6 أشهر على الأقل.
تحلل الخلايا وسونيكاتيون
ملاحظة: خلال كل خلية تفسخ و sonication الخطوات، العينات يجب أن تبقى على الجليد أو عند 4 درجة مئوية لتقليل تدهور البروتين وعكس التشعب.
1. ريسوسبيند الكريات الخلية في المخزن المؤقت لتحلل الخلية المثلج 1 مل مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا عزل الأنوية (إضافة مثبطات الفوسفاتيز اختيارياً). احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 2,600 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الأنوية في المخزن المؤقت لتحلل أنوية المثلج 1 مل مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (اختياري: إضافة مثبطات الفوسفاتيز). احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد. Sonicate الخلايا لتوليد حجم الحمض النووي يعني جزء بسيط من 0.2-1.0 كيلو بايت (انظر الشكل 5).
  ملاحظة: سونيكيشن ظروف الحاجة إلى الأمثل حسب نوع الخلية وكذلك الظروف (مثلاً، عدد الخلايا، وحجم، والمخزن المؤقت). لخلايا تي أولية، ينصح سونيكيشن لدورات 20-25 (انظر مواد للحصول على وصف مفصل).
3. تأخذ من 20-50 ميليلتر الكوة الكروماتين المنفصمة والحرارة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية و 1,000 في الدقيقة تهتز لأداء من التشعب عكس سريع والتحقق من حجم الكروماتين. إضافة 2-5 ميليلتر ك البروتيناز واحتضان لمدة 20 دقيقة في 56 درجة مئوية وتهز 1,000 لفة في الدقيقة. أداء المنظمة الحرارة لمدة 10 دقيقة في 95 درجة مئوية وتهز 1,000 لفة في الدقيقة. تنقية الكروماتين مع مجموعة مناسبة (انظر الجدول للمواد). تحقق من حجم الكروماتين على 1% [اغروس] هلام واستخدام 100 شركة بريتيش بتروليوم بالإضافة إلى علامة.
4. الطرد المركزي الكروماتين المنفصمة بمتوسط جزء حجم الحمض النووي من 0.2-1.0 كيلو بايت لمدة 10 دقائق 000 20 شخص × ز و 4 درجات مئوية بيليه الكروماتين غير قابلة للذوبان والحطام. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والحفاظ على الجليد.
5. الحفاظ على نسبة 5-10% الكروماتين سونيكاتيد كإدخال. تجميد في-20 درجة مئوية (المستخدمة في الخطوة 5.5.2).
جسم الزوجين الخرز
1. جسم الزوجين 10 ميكروغرام (مثلاً، مكافحة-رنا بول الثاني؛ H3K36me3 Histon المضادة) في برنامج تلفزيوني ميليلتر 220 (مع جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.5% 20 توين) إلى 80 الخرز ميليلتر سوبيرباراماجنيتيك بالإضافة إلى البروتين ز (انظر الجدول للمواد) على الأقل 1 ح في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
2. ضع الأنابيب في مغناطيس. انتظر حتى جميع حبات ملزمون بالمغناطيس وإزالة المادة طافية. كتلة أخرى مع ميليلتر 6 سونيكاتيد الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي في برنامج تلفزيوني (مع جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.5% 20 توين) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
3. ضع الأنابيب في مغناطيس. انتظر حتى جميع حبات ملزمون بالمغناطيس وإزالة المادة طافية واضحة. أغسل حبات مع المخزن المؤقت "الملكية الفكرية رقاقة" ثلاث مرات.
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين
1. تمييع الكروماتين إلى إجمالي حجم 1 مل في المخزن المؤقت لتحلل أنوية مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (يمكنك بشكل اختياري إضافة مثبطات الفوسفاتيز). إضافة IP الرقائق العازلة مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (يمكنك بشكل اختياري إضافة مثبطات الفوسفاتيز) لوحدة تخزين نهائي لمل 3. الحفاظ على الجليد أو عند 4 درجة مئوية بينما جسم يقترن بالخرز.
2. إضافة إلى جانب الخرز من الخطوة 5.3.3 الكروماتين المخفف للجسم واحتضانها طوال الليل في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
3. يغسل مع المخازن المؤقتة التالية (1 مل كل، انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع التناوب، ووضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس وإزالة المادة طافية: أغسل المخزن المؤقت أنا، وتغسل المخزن المؤقت الثاني والثالث المخزن المؤقت يغسل، و 2 × TE pH 8.0 على التوالي.
4. تجاهل المادة طافية وأيردري لمدة دقيقة ~ 5.
عكس كروسلينكينج
1. إزالة عينات من المغناطيس. إضافة 50 ميليلتر شطف العازلة ومزيج من بيبيتينج إلى الوت مجمعات البروتين-الحمض النووي من الخرز.
2. وتشمل sample(s) الإدخال من هذا خطوة إلى الأمام. إضافة شطف المخزن المؤقت الإدخال sample(s) لوحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر (للحفاظ على تكوين المخزن المؤقت مشابهة للعينات رقاقة) والعملية جنبا إلى جنب مع عينات الرقائق.
3. 3 مزيج ميليلتر من المخزن المؤقت شطف و 2 ميليلتر من رناسي (الدناز الحرة). إضافة 5 ميليلتر من المزيج لكل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. 2.5 مزيج ميليلتر بروتيناز ك، 1 ميليلتر الجليكوجين، 1.5 ميليلتر شطف المخزن المؤقت لكل عينة. إضافة 5 ميليلتر من المزيج لكل عينة (1 يو بروتيناز ك و 20 الجليكوجين ميكروغرام كل عينة) واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
5. احتضان هذه العينات عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها (على الأقل 4 ح) مع الهز القيام بعكس كروسلينكينج.
6. ضع الأنابيب في المغناطيس لمالا يقل عن 30 ثانية ونقل المادة طافية على أنبوب جديد. يمكن تجميد عينات في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
تنقية الحمض النووي
1. إضافة ميليلتر 140 من حبات باراماجنيتيك مشتتة جيدا إلى 60 ميليلتر من عينة (نسبة 2.3:1). بدقة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 25 مرة مزيج دقيق. تأكد من أن السائل في كل أنبوبة متجانسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 مكان الأنابيب في المغناطيس لدقيقة 4، أو حتى جميع حبات منضمة إلى المغناطيس، وتجاهل المادة طافية.
2. اترك هذه الأنابيب على المغناطيس وإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 70% الطازجة. احتضان هذه الأنابيب لمدة 30 ثانية دون الإخلال بالخرز. تجاهل المادة طافية وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. نضح الإيثانول تماما، وأود باراماجنيتيك حبات أيردري لمدة 4 دقائق.
  ملاحظة: إزالة الإيثانول ناقصة قد جدية الحد من الانتعاش الحمض النووي والعائد. جاف بيليه فقط حتى تصبح جافة. الإفراط في تجفيف بيليه قد خفض الانتعاش الحمض النووي والعائد.
3. إزالة الأنابيب من المغناطيس وإضافة 20 ميليلتر 10 ملم تريس-HCl (pH 8.0). بلطف "الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً 25 مرة مزيج دقيق. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس لدقيقة 4 ونقل المادة طافية إلى أنبوب آخر.
4. قياس كمية الحمض النووي مع فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد).
5. تحقق من نجاح من قبكر (ميكروليتر 1 تمييع في 100 ميليلتر ح₂س واستخدام 2-5 ميليلتر ل qPCR) الرقاقة. استخدام كبسولة تفجير محددة للايجابية (موقع الربط المعروفة من البروتين للفائدة) والمراقبة السلبية (مثلاً، جين هو صامت و/أو ليس هدفا للبروتين للفائدة).
  ملاحظة: يمكن إجراء إعداد مكتبة مع 2 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" اعتماداً على عدة (انظر الجدول للمواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4 سو العلامات: التحقق من الأمثل 4 شروط وضع العلامات سو (المبرمج، والإجهاد النووية، الإجهاد هيولى) والوقت وتركيز: يمكن أن تمنع إنتاج وتصنيع الرنا الريباسي مستويات عالية من 4sU والحث على الإجهاد هيولى فضلا عن النووية³⁰. ولذلك، ينبغي اختبار خلايا فائدة للإجهاد الناجم عن 4sU فضلا عن المبرمج. يوصي بإجراء تحليل لطخة غربية لتصور تراكم p53، الذي يشير إلى التوتر النووي، زيادة مستويات والرمات-EIF2a الذي عرض هيولى الإجهاد والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحليلاً للمبرمج. يمكن استخدام مستويات مرتفعة والتعرض المطول ل 4sU أو الأدوية مثل ثابسيجارجين أو زرنيخيت للحث على الإجهاد الخلوية. للحث على موت الخلايا المبرمج أو، تعامل الخلايا مع BH3I-1 (500 نانوغرام/ميليلتر) أو المحتضنة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية (صدمة الحرارة). أنيكسين V/7-عاد تلطيخ استخدمت لتحديد خلايا الميت (7-الإغراق) وأبوبتوتيك (أنيكسين V). وضع العلامات في المختبر تولد خلايا Th1 أولية ح 0.5 مع 500 ميكرون 4sU (تركيز نهائي) أو ح 1 مع 200 ميكرومتر 4sU لا يدفع علامات الإجهاد الخلوية لا المبرمج (الشكل 1) لكن يؤدي إلى إدماج 4sU كافية.

الجيش الملكي النيبالي وسم وقت يمكن اختصارها أيضا (دي فايف دقيقة) مما يؤدي إلى زيادة قصيرة الأجل إينترونيك تسلسل مرات وضع العلامات مقارنة بفترة أطول. تصور معدلات الربط كوترانسكريبشونال، ينبغي أن لا تتجاوز مرات وسم 4sU 30 دقيقة. لمزيد من التفاصيل بشأن 4sUlabeling، الرجاء الرجوع إلى Rädle وآخرون. ¹⁹

مراقبة الجودة: سلامة الحمض النووي الريبي ذات أهمية كبيرة عند تجهيز الجيش الملكي النيبالي. الأكثر ملاءمة للتحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU بعد بيوتينيليشن بتحليل اليكتروفوريتيكال (انظر الجدول للمواد). النظر في التحقق من الحمض النووي الريبي المعزولة من الخطوة 2.2.2، خصوصا عند استخدامه لتسلسل مجموع الجيش الملكي النيبالي. يجب أن يكون رقم سلامة الحمض النووي الريبي (رين) إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي لمواصلة تجهيزها (الشكل 3).

يمكن أيضا استخدام تحليل اليكتروفوريتيكال للتحقق من الحمض النووي الريبي يدون حديثا. كن على علم أن يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي يحتوي على ررناس أقل نضجاً كبيرا مقارنة بمجموع الجيش الملكي النيبالي مع العصابات الرنا الريباسي نموذجي يجري بارزة أقل بكثير.

الريبوسوم التنميط: [بكر] تضخيم مكتبة كدنا: كدنا التضخيم (الخطوة 4.9.1) خطوة حاسمة لضمان تحقيق نتائج جيدة التسلسل. تحليل مكتبات تضخيم بتحليل اليكتروفوريتيكال. يبين عينة جيدة من مكتبات تضخيم ذروته حول bp 140-160 (الشكل 4 أ). كميات مفرطة من محول dimers ينبغي تجنبها (الشكل 4 باء)، ويجب تنقية تلك العينات كذلك استخدام الإجراء تنقية صفحة طبقاً للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (تنقية صفحة منتجات PCR). يمكن أن ينتج الكثير القالب أو عدد كبير جداً من PCR دورات التضخيم المفرط وتتميز بظهور بقع PCR المنتجات، عصابات الوزن الجزيئي أعلى مما كان متوقعا ومحول ديمر المنتجات (الشكل 4). لمعظم العينات 1-5 ميليلتر من كدنا سيركولاريزيد و 9 دورات PCR للتضخيم سوف تسفر عادة عن كميات كافية من المنتج بكر الصحيح.

رقاقة: القص الكروماتين: شروط القص الأمثل تحتاج إلى تعديل لكل نوع من الخلايا. تحديد شروط القص (مثلاً، عدد الدورات، طاقة عالية أو منخفضة) مقدما. استخدام نفس العدد من الخلايا ونفس وحدة التخزين لأغراض، الاختبار منذ أقل كثافة خلية يزيد من كفاءة الإمالة. في محاولة لتجنب أكثر-أو تحت-القص الكروماتين. أجزاء كبيرة من الكروماتين هائلة يمكن أن تؤثر على نتائج رقاقة من انسداد، والقص المفرط يمكن أن تدمر [ابيتوبس] على البروتين للفائدة، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة ملزم بالجسم. في هذه التجربة، وتحققت أفضل النتائج عندما كان الكسر الرئيسي من الكروماتين المنفصمة حوالي 1,000 بي بي أو أقل قليلاً (الشكل 5A).

"رقاقة التحقق من" قبل قبكر: قبل البدء في الشريحة، فإنه من المستحسن اختبار إذا كان جسم المستخدمة مناسبة لشرائح (إذا كان ذلك ممكناً، استخدام رقاقة الصف الأجسام المضادة) برقاقة qPCR. تحقق من الرقائق للتسلسل ب qPCR قبل البدء في إعداد مكتبة (راجع الخطوة 5.6.5). كبسولة تفجير تصميم التي تربط إلى موقع هدف معروف من بروتين الفائدة. إذا كان الموقع الهدف المحدد ضمن جينات غير معروف، يمكن استخدام العديد من أزواج التمهيدي لفحص الجينات والعناصر التنظيمية المرتبطة بها. لرقاقة Th1 رنابي الخلايا إيفنج، الذي ترانسكريبتيونالي أوبريجولاتيد على التحفيز، والإشعال أكتين يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي. Sox9 و الأنسولين بمثابة عنصر تحكم سلبية، حيث لم يتم التعبير عن هذه الجينات في خلايا Th1 (الشكل 5 (ب)). تذكر أن لا تستخدم كبسولة تفجير إكسون الممتدة، التي عادة ما تستخدم ل qPCR مرناً. يمكن أيضا استخدام عنصر تحكم مفتش لإثبات خصوصية جسم المستخدمة. ويمكن قياس "الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد" مع فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). كميات من الحمض النووي نونسبيسيفيكالي ملزمة بمراقبة مفتش ينبغي إلى حد كبير أقل مقارنة بكمية الحمض النووي ملزمة بالضد المصلحة.

وإنشاء نسخ متماثلة: دليل على الأهمية البيولوجية: وينصح بشدة إجراء التجربة الحركية لجميع الأساليب بدءاً من نفس المجموعة من الخلايا التأكد من الخلايا لها نفس الهوية لجميع العينات غير المعالجة والمعالجة (الشكل 2). ومع ذلك، من المستحسن اتخاذ مختبرين صغيرة من النقاط الزمنية الرئيسية لكل طريقة لمقارنة العينات تكرار بيولوجية (مثلاً، من قبكر، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية). هذا يسمح بإجراء تقدير تقريبي إذا كان العلاج لكلا replicates استنساخه ويمكن الشروع في التسلسل. ينبغي إجراء التحقق من الصحة replicates عن طريق تحليل بيوينفورماتيكال. إمكانية تكرار نتائج النتائج يمكن تقييمها من حيث العلاقة بين قيم فبكم بين replicates وتصور استخدام التبعثر مؤامرات (الشكل 6).

figure-results-1
الشكل 1: تحقق ظروف المثلى وسم 4sU دون مقاومة فيزيولوجيا الخلية (الشكل من داوري et al.¹¹)
(أ) الكشف عن الخلايا المبرمج بنظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل: في المختبر ولدت Th0 الخلايا عولجوا بتركيزات مختلفة من 4sU (بين قوسين) ح 0.5 و 1 ح ح 2، على التوالي. واستخدمت العلاج BH3I-1 لحمل المبرمج يحدده V أنيكسين، بينما استخدمت صدمة الحرارة (5 دقائق عند 95 درجة مئوية) للحث على موت الخلايا التي تحددها 7-عاد. (ب) تحليل لطخة غربية ل p53 4sU معاملة وتنشيط خلايا T: كانت وصفت عينات مع 200 ميكرومتر 4sU لوقت التنشيط، فيما عدا الوقت ح 0.5 نقطة التي وصفت مع 500 ميكرون 4sU المشار إليها. (ج) تحليل لطخة غربية EIF2a والرمات ومجموع EIF2a في تنشيط خلايا Th1 بنفس الشروط التي وصفها كما هو الحال في (ب). ثابسيجارجين كعنصر إيجابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2: نظرة عامة التخطيطي لإعداد الحركية لتعقب التغييرات على نطاق الجينوم
يوضح هذا المخطط الإعداد للجمع بين 4sU seq مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط الريبوسوم، ورقاقة-seq لدراسة التغييرات على نطاق الجينوم عند معالجة الخلية. تجمع الخلايا وتوضع جانبا على العدد المطلوب من الخلايا لعنصر التحكم غير المعالجة. علاج الخلايا المتبقية وتقسيم لكل أسلوب ووقت نقطة. قم بتسمية الخلايا غير المعالجة أو المعالجة ل seq 4sU مع 4sU كما هو موضح. النقاط الزمنية وعينات لكل أسلوب يعتمد على مسألة بيولوجية محددة يجري بحثها. أخذ عينات لكل نقطة الوقت والأسلوب، واتبع الجزء المخصص من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: مراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU
تم تحليل مجموع الجيش الملكي النيبالي وبيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خلايا Th1 المنشط في بيواناليزير. ترد الرنا الريباسي 18S والرنا الريباسي 28S وعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) بالصك لتحديد وحدة من الجيش الملكي النيبالي. ينبغي أن يكون رين إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4
الشكل 4: بيواناليزير لمحات من الريبوسوم التنميط المكتبات
مكتبة جيدة (A) A: يظهر العينة ذروتها في نطاق الحجم المتوقع (140-160 bp) وهناك حاجة إلى لا تنقية إضافية. (ب) هذا النموذج يظهر محول المفرطة ديمر تضخيم المنتج (120 شركة بريتيش بتروليوم) بالنسبة إلى المنتج المطلوب (bp 140-160). هذه المكتبة يتطلب المزيد من تنقية. (ج) نموذج تضخيم الإفراط: الوزن الجزيئي قمم أعلى من المتوقع وبقع بكر أمبليكونس مرئية (المشار إليها بواسطة الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5
الشكل 5: حجم الكروماتين الأمثل بعد القص والتحقق من شرائح من قبكر
(أ) [اغروس] هلام الصورة يظهر حجم جزء الأمثل الكروماتين المنفصمة من ثلاث عينات المنفصمة لدورات 25 في سونيكاتور وتنقيته كما هو موضح من قبل في البروتوكول. (ب) تمثل نتائج Q PCR "شريحة رنابي" مجموع (مكافحة-الجيش الملكي النيبالي بول الثاني، 8WG16، ab817) كنسبة مئوية من المدخلات. وتستخدم كبسولة تفجير إيفنج و أكتين إيجابية بينما Sox9 و الأنسولين هي عناصر سلبية (كلا الجينات لم يتم التعبير عن تنشيط خلايا Th1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6
الشكل 6: مقارنة بين البيولوجية يتطابق (الشكل من داوري et al. ¹¹)
مؤامرة مبعثر الممثل مقارنة قيم التعبير (فبكم) بين وإنشاء نسخ متماثلة من ح 4 الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا (4sU) بعد التحفيز لتنشيط خلايا Th1. يشير الخط الأخضر إلى قيم فبكم متساوية وتتم الإشارة إلى ارتباط الرتب في كل الأرض.

المدة لوضع العلامات (دقيقة)	تركيز 4sU الموصى بها (ميكرومتر)
120	100-200
60	200-500
15-30	500-1000
< 10	500-2000

الجدول 1: أوصى بتركيزات 4sU (من Rädle، وآخرون-¹⁹)
تتم الإشارة إلى التركيزات الموصى بها 4sU لأوقات مختلفة لوضع العلامات.

الأسلوب	عدد الخلايا	كمية الحمض النووي الريبي
وسم 4sU	إيه تو × 10⁷	≥60µg
الريبوسوم التنميط	إيه تو x10⁷
رقاقة-seq	إيه تو × 10⁷ -3 × 10⁷

الجدول 2: المبلغ المطلوب من الخلايا الأولية
الحصول على الحد الأدنى من الخلايا الأولية المطلوبة لكل أسلوب. المبالغ يمكن أن يكون أقل عند استخدام أنواع الخلايا الأخرى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل العملية برمتها من تنظيم الجينات من الضروري أن نفهم تماما التكيفات الخلوية في استجابة لحافز معين أو العلاج. الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع، 4sU seq، الريبوسوم التنميط، ورقاقة-seq في نقاط زمنية مختلفة يؤدي إلى تحليل شامل للعمليات الرئيسية لتنظيم الجينات على مر الزمن. مطلوب فهم عميق للعمليات البيولوجية لتحديد الإعداد التجريبية، فضلا عن النقاط الزمنية المثلى.

منذ تحسين أساليب لدراسة تنظيم الجينات بسرعة، يمكن أن تكون هذه البروتوكولات تتكيف مع التغيرات السريعة. ومع ذلك فإنها توفر الأساليب الأكثر أهمية لدراسة آليات تنظيمية الجينات الأساسية في أي نوع من الخلايا. وهنا نحن نناقش بعض المزالق والوقائع التي يتعين على المرء أن ينظر عند استخدام هذه الأساليب.

الخلايا: يجب أن تكون الخلايا عالية قابلة للحياة، وإذا كان استخدام الخلايا الأولية المعزولة، يجب أن تضمن نقاء السكان خلية (مثلاً، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لخلايا تي الأولية). الخلايا حتى قليلاً وأكد يمكن أن تؤثر على النتائج من هذه الأساليب تسلسل حساسة جداً وخفض كمية الحمض النووي الريبي يدون أو المترجمة حديثا، ويؤدي إلى قراءات غير المرغوب فيها لاستجابة الإجهاد في نتائج التسلسل. هو الأمثل سرعة الطرد المركزي المشار إليها في هذا البروتوكول بيليه الخلايا لخلايا تي الأولية. وهكذا، ضبط سرعة حسب نوع الخلية.

4 آثار سو على فيزيولوجيا الخلية: بالإضافة إلى الخيارات المذكورة أعلاه للتحقق من الحد الأدنى من اضطراب للفيزيولوجيا الخلوية عند إضافة 4sU، يمكن إجراء تحليل آخر و/أو إضافية، لا سيما عندما تقتصر أرقام الخلية. ويمكن اختبار آثار على تكاثر الخلايا بالتحقق من الوقت مضاعفة الخلايا ببساطة عد الخلايا المسماة وغير المسماة. يمكن أيضا اختبار الإجهاد النوية التعريفي من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا عن طريق تلطيخ الفلورة نوكليولين ونوى. كذلك التحقق من تأثير 4sU، ويمكن قياس التعبير الجيني العالمي تغير بربط قراءة التهم من الحمض النووي الريبي المجموع المسمى بالجيش الملكي النيبالي إجمالي غير مسمى.

الخلية الأرقام: في المختبر إنشاء خلايا T، نوصي بدءاً على الأقل كمية الخلايا المشار إليها في الجدول 2. اختر أعدادا كافية من كل أسلوب حسب نوع الخلايا. نظراً للخلايا T أقل من السيتوبلازم والجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى، ستكون كافية على الأرجح مبالغ أقل من الخلايا الأخرى. لرقاقة-seq، تعتمد أرقام الخلية عاليا على جسم المستخدمة ومستوى التعبير من بروتين الاهتمام داخل الخلايا. هيستون أو "رقاقة رنابي"، يمكن استخدام خلايا فو، بينما أرقام الخلية بحاجة إلى زيادة عند استخدام عوامل النسخ، خاصة إذا كان يتم التعبير عنها عند مستويات منخفضة.

4 سو-وضع العلامات، والجيش الملكي النيبالي بيوتينيليشن: عند استخدام الخلايا ملتصقة، وسم 4sU يمكن توجيهها كما وصفها Rädle وآخرون. ¹⁹ منذ 4sU جداً سرعة دمج الخلايا، يمكن إضافته إلى وسيلة لتعليق أو ملتصقة أو الخلايا شبه ملتصقة مباشرة.

من المستحسن أن تبدأ في بيوتينيليشن مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، يمكن استخدام كميات أقل من الجيش الملكي النيبالي، على الرغم من أننا لا اختبار لأقل من 30 ميكروغرام. إضافة كوبريسيبيتانت (مثلاً، جليكوبلوي) عندما عجل الجيش الملكي النيبالي إذا كان من الصعب رؤية بيليه. دافي وآخرون أظهرت أيضا أن البيوتين تنشيط ميثيلثيوسولفوناتي (النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين) أكثر كفاءة يتفاعل مع الحمض النووي الريبي المسمى 4sU هبدب-البيوتين³¹. ومن ثم، قد يكون من المفيد النظر في التحول إلى النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين، على وجه الخصوص، لاسترداد الكشف الصغيرة، التي تميل إلى أن تكون أقل من المخلفات أردين (الرجوع إلى بروتوكول بيوتينيليشن ذكرها دافي وآخرون؛ انظر تنقية الحمض النووي الريبي المسمى 4sU، الإجراءات التجريبية).

لاسترداد رنا يدون حديثا، فمن الممكن استخدام الخرز باراماجنيتيك أو الخرز تنظيف الجيش الملكي النيبالي من اختيارك. تأخذ دائماً في الاعتبار أن هذه المجموعات قد أو قد لا تنقية للكشف محددة. على سبيل المثال، إذا كنت ترغب في ميرناس، النظر في استخدام مجموعات محددة لالتقاط ميرنا وتسلسلها.

التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا: لدقة قياس الحمض النووي الريبي يدون حديثا، القياس ينبغي أن يؤديها إلى فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). ضمن ح 1 من التعرض 4sU، رنا يدون حديثا يمثل حوالي 1-4% من مجموع الجيش الملكي النيبالي. رنا يدون حديثا من ح 1 المسمى، وتنشيط خلايا تي تتألف من ~ 90-94% من الرنا الريباسي¹¹.

الريبوسوم التنميط: عند إنشاء الطريقة، عقدنا العزم أن استخدام 1.5 x مبلغ نوكلاس مما اقترح في البروتوكول الأصلي يضمن الهضم السليم. أيضا، أبلغ أي آثار سلبية لكميات مرتفعة من نوكلاس. نظراً لأنه من الصعب جداً أوفيرديجيست المفاضلة في حين أنهم جزء من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بالبروتينات ريبوسومال، يمكنك زيادة المبلغ الذي تيتراتي الهضم nuclease الأمثل لا يزال قليلاً.

إذا كان أقل من 500 نانوغرام من "الجبهة الوطنية الرواندية الجيش الملكي النيبالي" وعثر في خطوة 4.4.2، كرر استنزاف الرنا الريباسي وتجمع تنقية المفاضلة مع الحمض النووي الريبي نظيفة ومركزات-5 أعمدة. وبدلاً من ذلك، تحميل عينات مماثلة اثنين بجانب بعضهما البعض على الهلام (الخطوة 4.5.3) وتجمع جل الشرائح أثناء شطف الحمض النووي الريبي من الهلام (الخطوة 4.5.6).

ونحن نوصي بقطع المفاضلة على جل أحكام قدر الإمكان لعصابات nt 28 و 30. وهذا يساعد في إزالة الأجزاء غير المرغوب فيها من ررناس وترنس، التي سوف تصبح جزءا من المكتبة الخاصة بك وتقليل ما يلي تسلسل للمفاضلة الخاصة بك في وقت لاحق.

كما يوصي بتجنب ضوء أثناء تنقية هلام الأشعة فوق البنفسجية. هذا يمكنك إنشاء نيكس في الأجزاء رنا، فضلا عن dimers بيريميدين، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً شديدا على إعداد مكتبة وتسلسل النتائج في نهاية المطاف.

إعداد مكتبة وتسلسل البيانات: تمكن الريبوسوم التنميط بروتوكول لإنشاء مكتبة كدنا مناسبة للتسلسل. يمكن استخدام العينات التي تم إنشاؤها بواسطة العلامات 4sU مباشرة لإعداد مكتبة مع أي مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي المناسبة. منذ يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي، خاصة عند استخدام قصيرة وسم تايمز، قد لا تكون بوليادينيلاتيد، ينبغي إجراء لا بولي--مجموعة مختارة. بدلاً من ذلك، نوصي بشدة باستنفاد الرنا الريباسي للحيلولة دون تخفيض عمق التسلسل للعينة الفعلية. استخدام خلايا تي، بدأنا مع 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي يدون حديثا ومجموع (تبعاً لهذه المجموعة، انظر مواد)، يقوم الرنا الريباسي نضوب وانخفاض دورات للتضخيم PCR للتقليل من التحيز PCR. إعداد مكتبة يمكن أن يؤديها بأقل المواد البداية. ينبغي أن يكون الأمثل لحساب المكتبة تعقد أرقام دورات PCR.

لرقاقة seq هناك أيضا العديد من مجموعات المتاحة لإعداد المكتبة. في مكتبتنا أيدي عملت إعداد جيدا بدءاً من 2 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" (انظر المواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم). يجب التأكد من مراجعة الأرقام القياسية لتوازن اللون أثناء تسلسل. ونحن نوصي بعمق تسلسل إيه فور زيرو × 10⁶ يقرأ كل 4sU seq ومجموع الجيش الملكي النيبالي-seq، وعينات seq رقاقة، وإيه إيت زيرو × 10⁶ ما يلي: الريبوسوم التنميط عينات. عمق التسلسل يعتمد على العينة وتحليل المتلقين للمعلومات المعلوماتية الحيوية وينبغي النظر بعناية. لتحليل ما يلي إينترونيك للربط كوترانسكريبشونال، 100 يحتاج bp إقران نهاية تسلسل يتم اختياره.

تسلسل التحيز: التسلسل أصبح معيار الذهب عند تحديد التغيرات العالمية في النسخ أو الترجمة أو النسخ عامل ملزم. في السنوات الأخيرة، تم دفعها من الأساليب القائمة على حدودها أو تم تطوير تقنيات جديدة لتسلسل مبالغ بداية صغيرة متزايدة من الجيش الملكي النيبالي. ويتطلب هذا تضخيم كدنا، الذي يدخل الضوضاء أو التحيز. في الآونة الأخيرة، وضعت معرفات فريدة الجزيئية (أميس) تجريبيا تحديد التكرارات عرضته PCR. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن أميس أقل ما يقال مجرد تحسين تسلسل السلطة، ومعدل اكتشاف كاذبة ل التعبير الجيني التفاضلي³². ومع ذلك، النظر في استخدام معرفات فريدة الجزيئية (أميس) لجميع المكتبات التسلسل لعنصر التحكم للمكتبة تعقد، خاصة عند البدء بكميات قليلة من الجيش الملكي النيبالي، وعندما تكون هناك حاجة العديد من دورات PCR.

المخزن المؤقت وحلول الأسهم: ويجب إعداد كافة المخازن المؤقتة ل 4sU seq والتنميط الريبوسوم تحت شروط صارمة خالية من رناسي استخدام مياه خالية من نوكلاس. من المستحسن لشراء مسبقة الصنع خالية نوكلاس كلوريد الصوديوم وتريس-HCl، يدتا، وسترات الصوديوم والماء. ولضمان ظروف خالية من نوكلاس، يمكن استخدام حلاً ديكونتاميناتينج رناسي لتنظيف الممصات أو الأسطح. كافة المخازن المؤقتة لرقاقة seq بحاجة إلى أن تكون على الأقل خالية من الدناز ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة. دائماً إضافة مثبطات البروتياز، واختيارياً، مثبطات الفوسفاتيز الحق قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد.

المعلوماتية الحيوية: تحليل جميع البيانات التسلسل (أي، seq رقاقة وتسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط ريبسوسومي) ينطوي على مراقبة الجودة (مثلاً، استخدام فاستقك، http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)، التشذيب المحول (مثلاً، مع كوتادابت²⁰) متبوعاً برسم خرائط الجينوم مرجع الخلايا قيد الدراسة. لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (المجموع و 4sU seq)، فضلا عن الريبوسوم التنميط البيانات، مطلوب مخطط تسلسل الحمض النووي الريبي المقسمة، مثل 2 كونتيكستماب²¹. للتحالفات seq رقاقة البيانات أونسبليسيد، استخدام MEM التحالف²² كافية. يمكن حساب التعبير الجيني باستخدام نموذج (قراءة كل "كيلوبس إكسون" الواحدة ملايين الأجزاء المعينة) ربكم¹، بعد تحديد قراءة التهم كل الجينات استخدام البرنامج، مثل فيتوريكونتس²³. تتوفر لاستدعاء الذروة من البيانات seq رقاقة، عددا من البرامج، مثلاً، أجهزة ماكينتوش²⁴ أو²⁵من الأحجار الكريمة. كذلك يمكن إجراء تحليلات المصب في ص²⁶، لا سيما باستخدام الأدوات التي توفرها المشاريع بيوكوندوكتور²⁷.

هنا، تحديا كبيرا في دمج 4sU-ومجموع مستويات الحمض النووي الريبي والنشاط متعدية الجنسيات من الريبوسوم التنميط هو التطبيع. نهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة تطبيع لمستويات من البيت-حفظ الجينات. للحد من الضوضاء بسبب التقلبات العشوائية لحفظ البيت الجينات الفردية، من المستحسن أن ليس فقط استخدام قليلة البيت حفظ الجينات ولكن المستويات الوسطية لمجموعة أكبر، مثل > 3,000 البيت حفظ الجينات التي جمعتها أيزنبرغ وليفانون²⁸. لحساب معدلات دوران الجيش الملكي النيبالي من نسب 4sU-إلى مجموع الجيش الملكي النيبالي، التطبيع هو استناداً إلى معدل دوران متوسط معدلات (مثلاً، على افتراض نصف الجيش الملكي النيبالي من ح 5)²⁹. بيد أن هذا يفترض لا التغييرات الشاملة لحفظ البيت الجينات، نوصي باستخدام نهج تحليل مستقل للتطبيع، مثلاً، تجميع لسلسلة زمنية من أنواع بيانات مختلفة لتحديد مجموعات من الجينات على أساس الارتباط مع السلوك متميزة في النسخ والترجمة أثناء التنشيط. للحصول على وصف مفصل في التكامل بيوينفورماتيكال لأنواع البيانات المختلفة، نشير إلى أن المنشور الأصلي¹¹.

تحليل لتكامل البيانات ومعدلات الدوران: يمكن أن تظهر ورقة نشرت مؤخرا³³ مقارنة نصف حياة مصممة بعنصر تحكم متعدد جينات (MGC) إلى الأساليب العالمية أن نصف العمر ارتباطاً أفضل مع تلك التي تم الحصول عليها بطرق وضع العلامات الاستقلابية مقارنة بالأساليب الأخرى (مثلاً، العامة تثبيط النسخ بالمخدرات). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الاختلافات بين حسابات نصف العمر يمكن أن تنشأ، وقد تم وصف ¹⁵^،³⁴. يمكننا حساب لمعظم المشاكل والخلافات التي يتم تقديمها بواسطة استجابة الإجهاد بسبب التعرض لفترات طويلة 4sU. ولذلك من الضروري استبعاد إجهاد استجابة عرض العلامات 4sU. للتحقق من صحة زيادة معدلات الدوران، نوصي باستخدام مجكس.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام مجموعة من البيانات كما تم إنشاؤه هنا لبيانات تحليل (مثلاً، تنظيم الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز)³⁵^،أكثر تكاملية³⁶.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر لارس Dölken لتقديم المشورة وضع العلامات 4sU لخلايا تي الأولية؛ إليزابيث غراف، وتوماس شوارزماير لمساعدة حاسمة في مكتبة الأجيال وتسلسل؛ ديرك إيك وأندرو Flatley لتوفير الأجسام المضادة رنابي و T الخلية؛ أ. هنرييت أوهلينهاوت وال [فرنزيسكا Greulich للحصول على مساعدة في إعداد المكتبة لرقاقة-seq؛ وأيده كارولين جيم فريدل المنح FR2938/7-1 و CRC 1123 (Z2) من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG)؛ وأيد جلاسماتشير الكه المنحة GL 870/1-1 من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) والمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD)، ميونيخ Zentrum هلمهولتز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي >4sU-labeling< / قوي >
4-ثيوريدين (100 مجم)	Carbosynth	13957-31-8	تحضير مخزون 50 ملي مولار في H2O / PBS معقم ؛ تخزين في &ndash ؛ 20 درجة ؛ C في حصص 50-500 & l; لا تعيد التجميد.
1.5 مل أنابيب قفل آمن	Eppendorf	30121589	اختياري
1.5 مل أنابيب بولي بروبيلين لولبية	Sarstedt	72692005	متوافق مع أنابيب ثنائي ميثيل فورماميد
15 مل	BD Falcon	352096	متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد
2.0 مل أنابيب البولي بروبيلين اللولبية Sarstedt		72694005	متوافق مع ثنائي ميثيل فورماميد
50 مل أنابيب	BD Falcon	352070	متوافقة مع ثنائي ميثيل فورماميد
Agencourt RNAClean XP	Beckman Coulter	A63987	نوصي باستخدام هذه الخرزات المغناطيسية. Aliquot وتخزينها في 4 درجات ؛ C
Chloroform	Sigma Aldirch	372978	WARNING &ndash ؛ خطير على الصحة
ثنائي ميثيل فورماميد	سيجما ألدريتش	D4551
ديثيوثريتول (DTT)	روث	6908.1	تحضير 100 ملي مولار DTT في H_{2< / sub>O الخالي من النوكلياز ؛ قم دائما بإعداد}
الإيثانول	Merck	1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 مجم)	بيرس	21341	تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل عن طريق إذابة 50 مجم من البيوتين HPDP في 50 مل DMF. الاحترار اللطيف يعزز الذوبان. تخزين في 4 درجات; C في حصصات 1 مل. DMF يذوب بعض المواد البلاستيكية. نوصي باستخدام الماصات الزجاجية لنقل DMF من زجاجة مخزون إلى أنابيب فالكون سعة 50 مل.
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية	Agilent Technologies	5067-4626
Isopropanol	Merck	1.09634.1011
كلوريد الصوديوم (5M)	Sigma Aldrich	71386	محلول مخزون
خال من النوكلياز EDTA (500 مليمتر) ، درجة الحموضة 8.0	Invitrogen	15575-020	محلول مخزون
خال من Nuclease H_{2< / sub>O}	Sigma Aldrich	W4502	محلول مخزون
خال من النوكلياز Tris Cl (1 متر) ، درجة الحموضة 7.4	Lonza	51237	محلول مخزون
جل قفل المرحلة أنابيب ثقيلة (2.0 مل)	5Prime	2302830	استخدم في الخطوة 1.3.4.
البولي بروبيلين 15 مل أنابيب الطرد المركزي	Greiner Bio-One	188271	أو ما يعادلها ؛ يجب أن يتحملوا ما يصل إلى 15,000 مرة ؛ g
كاشف تحلل QIAzol (200 مل)	Qiagen	79306	استخدم هذا الكاشف أو ما يعادله TRI لعزل الحمض النووي الريبي ، تحذير & ndash ؛ تآكل وخطر على الصحة! ضمان الوصول الفوري إلى ترياق الفينول (PEG-Methanol)
مجموعة فحص Qubit RNA HS	Life Technologies	Q32852	استخدم هذه المجموعة لقياس كمية الحمض النووي الريبي في الخطوة 1.4.11
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	اختياري ؛ يتضمن Buffer RLT
Sodium citrat	Sigma Aldrich	C8532	قم بإعداد محلول مخزون 1.6 متر باستخدام الماء الخالي من النوكلياز
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
& ماك Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Store at 4 & deg; C ، يشمل & أعمدة Mac المستخدمة في الخطوة 1.4.6. (المتجر في RT)
<قوي > مقايسة بقاء الخلية والإجهاد < / قوي >
PE طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج I	BD Biosciences	559763	اختياري
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	اختياري
p53	abcam	ab26	اختياري
p-EIF2a (Ser51)	إشارات الخلية	9721	اختياري
BH3I-1	Sigma-Aldrich	B 8809	تخزين
للغسيل الاختياري<قوي> القوي < / قوي >
4sU	عند RT	100 ملي درجة الحموضة ثلاثية الهيدروجيني 7.4 ، 10 ملي مولار EDTA ، 1 م كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ توين 20 في مخزن مؤقت البيوتينيل البيوتوتينيل الخالي من النوكلياز H_{2< / sub>O}
		C	100 ملي مولار تريس درجة الحموضة 7.4 ، 10 ملي EDTA في ماء خال من النوكلياز ؛ جعل الكميات من 1 مل ؛ تخزينها في 4 درجة ؛
مخزن مخزن		RNA عند RT	1.2 M كلوريد الصوديوم ، 0.8 M سترات الصوديوم في الماء الخالي من النوكلياز. استعد مسبقا في ظل ظروف خالية من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في 50 مل من أنابيب الصقر.
<قوي>المعدات< / قوي>2100
أداة محلل حيوي	Agilent	G2939BA
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	استخدم هذه المجموعة للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي في الخطوة 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
مقياس الطيف الضوئي الاختياري للأشعة فوق البنفسجية / VIS	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	أو ما يعادلها. استخدم في الخطوة 1.2.2 / 3.1.8 / 3.3.3 / 3.4.3
جهاز طرد مركزي عالي السرعة	Thermo Scientific	Heraeus Multifuge X3R	أو معدات مكافئة قادرة على الوصول إلى 13,000 ؛ & مرات; ز
محولات الدوار عالي	Thermo Scientific	Fiberlite F15-6 x 100y
لأنابيب
أجهزة طرد مركزي مبردة على سطح	الطاولة Eppendorf	5430	R أو ما يعادلها.
خلاط حراري	Eppendorf	Thermomixer C	أو ما يعادله.
حامل مغناطيسي	Miltenyi Biotec	130-042-109	حامل واحد يحمل 8 & micro ؛ أعمدة Macs.
مقياس فائق الدقة	Mettler Toledo	ML204T	أو ما يعادله.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	للهلام RNA ؛ أو ما يعادلها.
E-Gel EX 1٪ agarose جل مسبقة الصب	Invitrogen	G4020-01	للهلام RNA ؛ أو ما يعادله.
DynaMag-2 Magnet-1 كل	من Life Technologies	12321D
RNaseZap	Sigma	R2020	مجموعة
مكتبة الحمض النووي الريبي الإجمالية الاختيارية TruSeq	Illumina	RS-122-2201	أو ما يعادلها. بالنسبة للخلايا التائية ، استخدمنا 400 نانوغرام 4sU و Total RNA مع 11 دورة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم تضمين استنفاد الحمض النووي الريبي في هذه المجموعة
تستخدم Nanodrop	Thermo Scientific		Nanodrop أو أداة مكافئة لقياس تركيز الحمض النووي الريبي
<قوي > تنميط الريبوسوم< / قوي>
TruSeq Ribo Profile (الثدييات أو الخميرة)	Illumina	RPYSC12116 (خميرة)
مجموعة TruSeq Ribo Profile (الثدييات أو الخميرة)	Illumina	RPHMR12126 (الثدييات)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns	GE Healthcare	27-5140-01
RNA Clean & amp مجموعة المكثف -25	Zymo Research	R1017
RNA Clean & مجموعة المكثف -5	مجموعة إزالة الرينا الريبي الريبي ريبو
(إنسان / فأر / فأر)	MRZG126	أو MRZG12324
(مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية)	تقنيات Agilent	5067-4626	مطلوبة بالفعل ل 4sU-seq
جميع المواد الاستهلاكية والمعدات الأخرى مدرجة في دليل المستخدم < / strong>	!!		اقرأ دليل المستخدم بعناية واطلب المواد الاستهلاكية المطلوبة مسبقا (ضع في اعتبارك وقت تسليم طويل لبعض المواد الاستهلاكية مثل المواد الهلامية)
ChIP< / strong>
10 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)	مورد
100 نقطة أساس Plus Marker	Thermo Fisher	SM0323
16٪ الفورمالديهايد	ثيرمو فيشر	28908	أضف إلى التركيز النهائي بنسبة 1
70٪ مورد	مختبر		قم بإعداد مورد
		Agarose	gereral
Agencourt RNAClean XP حبات	Beckman Coulter	A63987	نوصي باستخدام هذه الخرز المغناطيسي. Aliquot وتخزينها في 4 درجات ؛
مجموعة إعداد مكتبة C ChIP	KapaBiosystems	KK8504	أو استخدم المجموعة التي تختارها
الطرد المركزي الدقيق منخفضة الربط من الحمض النووي	Eppendorf	Z666548-250EA	أو ما يعادلها
من Dynabeads Protein G	Invitrogen	10004D	استخدم هذه الخرزات المغناطيسية الفائقة المقترنة بالبروتين G في الخطوة 4.3.1. أحضره إلى RT قبل الاستخدام
	مختبر	الجليسين	القديم قم بإعداد محلول مخزون 2M
Glycogen	Roche	10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	استخدم هذه المجموعة (أو ما يعادلها) لتنقية الكروماتين في الخطوة 4.2.4.
مثبط الفوسفاتيز (PhosStop)	Roche	4906837001	أضف طازجا إلى المخزن المؤقت واحتفظ به على الثلج
Power SYBRgreen Master mix	Thermo Fisher	4367659
مثبط للبروتياز (cOmplete ، خالي من EDTA)	Roche	11873580001	أضف طازجا إلى المخزن المؤقت واحتفظ بالثلج
Proteinase K	Invitrogen	25530049
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851	استخدم هذه المجموعة لقياس كمية الحمض النووي في الخطوة 4.6.4. على مقياس الفلور الكيوبيت
Rnase ، الخالي من DNase	Roche	11-119915001
المنوية السلمون (صوتنة إلى حوالي 100 نقطة أساس)	Sigma	D1626
TE pH 8.0			مختبر gereral
<قوي > الأجسام المضادة (درجة ChIP إن أمكن) < / قوي>
مضاد للحمض النووي الريبي Pol II [8WG16]	abcam	ab817
مضاد للهيستون H3K36me3	abcam	ab9050
أو الجسم المضاد ذي الأهمية
< قوي > المخازن المؤقتة < / قوي >
ربط / حجب		مخزن مؤقت في RT	PBS مع 0.5٪ BSA و 0.5٪ Tween 20
Cell-Lysis		يخزن في RT	5 ملي مولار الأنابيب [درجة الحموضة 8.0] ، و 85 ملي KCl ، و 0.5٪ NP40
ChIP IP	مخزن المؤقت		0.01٪ SDS ؛ 1. 1٪ تريتون X-100 ؛ 1.2 م.م EDTA; 16.7 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.1 ؛ 16.7
	عند RT حتى 6 أشهر	10 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 5 ملي EDTA (درجة الحموضة 8.0) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم و 0.5٪ SDS


			0.1 ٪ [دس]; 1٪ تريتون [إكس-100]; 2 م.م EDTA; 20 ملي تريس-هيدروكلوريك درجة الحموضة 8.1 ؛ 500 مخزن mM NaCl
Wash Buffer III		في RT	0.25 ؛ م LiCl; 1٪ NP-40 ؛ 1 م.م EDTA; 10 ملم تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 8.1
< قوي > المعدات < / قوي >
2100 أداة التحليل الحيوي	Agilent	G2939BA	استخدام هذه الأداة للتحليل الكهربائي
Nanodrop	Thermo Scientific
Bioruptor TBX الأنابيب الدقيقة 1.5 مل	C30010010		دياجينود
أو أنابيب خاصة لجهاز الصوتنة الخاص بك
جهاز صوتنة Bioruptor أو جهاز صوتنة من اختيارك			صوتنة الخلايا التائية مع Bioruptor: 20 - 25 دورة (30 ثانية على ، 30 ثانية في أعلى في اثنين من الأنابيب الدقيقة bioruptor 1.5 مل مع 500 & ل كل أنبوب)
حامل مغناطيسي للأنابيب
Thermomixer
Agarose هلام الكهربائي Qubit
Fluorometer	Thermo Scientific		استخدم هذا الفلورومتر لقياس كميات منخفضة من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي

الطازج مخزن عازلة (10x) عند 4 درجات ؛مخزن هطول الأمطار C السرعة 15 مل إعداد مجموعة زيرو جولد مختبر gereral٪ EtOH gereral دائما مختبر الطازج أنابيب مورد مورد buffer عند RT مخزن ملي كلوريد الصوديوم مخزن مخزن في RT 50 ملي تريس [درجة الحموضة 8.0] ، و 10 ملي مولار EDTA ، و 1٪ مخزن مخزن الغسيل SDS عند RT 0.1٪ SDS ؛ 1٪ Triton X-100 ؛ 2 ملي EDTA ؛ 20 ملي مولار Tris-HCL درجة الحموضة 8.1 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم مخزن الغسيل المؤقت II في RT

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126(2015).
Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).
Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).
Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).
Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533(2016).
Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).
Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

4sU ChIP RNA

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة