المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هو انيوبلويدي الجنينية الوراثية السبب الرئيسي للعقم لدى البشر. تنشأ معظم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، وأن كان ارتباطاً إيجابيا بسن الأمهات، العمر وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. ولذلك، قد حساب المتغيرات الجينات للعزل الصبغي غير صحيحة أثناء تكون البويضات. نظراً لأن الحصول على بويضات بشرية محدودة لأغراض البحوث، وضعت سلسلة من الاختبارات لدراسة الجينات البشرية الدالة أثناء الانقسام الاختزالي الأول باستخدام الماوس بويضات. أولاً، يتم ميكروينجيكتيد رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) الجينات والجينات البديل من الفائدة في الطور الأول-اعتقلت الماوس بويضات. بعد السماح بوقت للتعبير، تطلق بويضات شكل متزامن في نضوج هو استكمال الانقسام الاختزالي أنا. يمكن تقييم تعريب البروتين البشري بعلامات مرناً مع تسلسل مراسل الفلورية، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، بالإضافة إلى التعديلات المظهرية. على سبيل المثال، اكتساب أو فقدان وظيفة يمكن أن يحقق بتهيئة الظروف التجريبية التي تشكل تحديا للمنتج الجيني لإصلاح الأخطاء هو. على الرغم من أن هذا النظام مفيد في التحقيق وظيفة البروتين البشري أثناء تكون البويضات، ينبغي الاضطلاع بالتفسير الملائم للنتائج نظراً لأن تعبير البروتين ليس على المستويات المحلية، وإذا لم تسيطر على (أي طرقت بها أو لأسفل)، homologs موريني موجودة أيضا في النظام.
المقدمة
العقم هو حالة تؤثر على 10-15% السكان في سن الإنجاب 1، منها قرابة نصف التماس العلاج الطبي 2. على الرغم من أن مسببات العقم متنوعة وفي كثير من الحالات المتعددة العوامل، التشوهات الوراثية الأكثر شيوعاً في البشر هو انيوبلويدي الجنينية 3. انيوبلويدي يعرف بأنه الانحراف (الربح أو الخسارة) للعدد الصحيح من الكروموسومات في خلية. ظاهرة انيوبلويدي في الأجنة البشرية أمر شائع، ويزداد مع تقدم السن الأمهات 4،5. وقد أبرزت أربع تجارب معشاة الاستفادة من اختيار الأجنة (يوبلويد) فقط تشروموسومالي العادية لنقل الرحم لأن هذه الاستراتيجية أدت إلى غرس زيادة معدلات ومعدلات الإجهاض أقل ووقت أقصر تحقيق الحمل 6،7،،من89. ولذلك، فهم مسببات انيوبلويدي البشرية يمكن لها آثار هامة في المساعدة على الإنجاب.
وبالرغم من أن زرع قبل الاختبارات الجينية أنيوبلويديس مفيد في علاج العقم، تزال مفتقدة فهم دقيق للطريقة التي تنشأ بها أنيوبلويديس. من المقبول على نطاق واسع أن هناك علاقة متبادلة إيجابية هو أنيوبلويديس (نشأت أثناء إنتاج مشيج) وسن الأمهات، غير أن بعض النساء معدلات انيوبلويدي الجنينية الحالية التي تحيد عن معدل متوسط ل سن معين على 4. هذه الحالات تشير إلى أن السن وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. عوامل أخرى قد تلعب دوراً في زيادة خطر انيوبلويدي الجنينية، مثل المتغيرات الجينات.
أحد جوانب رئيسية للتحقيق في إمكانية مساهمة متغير الجيني إلى انيوبلويدي أثناء الانقسام الاختزالي البويضيه تصميم نظام لتقييم سرعة وظيفة الجينات هو. بسبب القيود الأخلاقية ووصول محدود، ومن غير العملي لإجراء هذه التجارب باستخدام البويضات البشرية. هذه المسائل يمكن التحايل عليها باستخدام الماوس بويضات، وهنا سلسلة من الاختبارات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الأول وصف. قبل ميكروينجيكتينج الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) الترميز للبديل الجينات للفائدة، يمكن تصور تعريب البروتين البشري في البيض الماوس وتستخدم لتحديد إذا كان التعبير حمل خارج الرحم من البروتين البشري البرية من نوع وتحور ينتج أي التعديلات المظهرية التي يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي. تعمل هذه تشمل زيادة في microtubules التي تعلقها على غير لائق للأخت كينيتوتشوري وعدم القدرة على دعم المحاذاة كروموسوم في الطورية للانقسام الاختزالي أولاً الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في اكتساب وفقدان وظيفة المتغيرات الجينية بتهيئة ظروف تجريبية محددة لتحدي الأحداث الرئيسية في الانقسام الاختزالي البويضيه مثل مغزل محاذاة المبنى وكروموسوم 10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الاستنساخ الجزيئي
- الحصول على كامل طول التسلسل ترميز الجينات للفائدة وناقلات بلازميد النسخ في المختبر (بيفت)11.
ملاحظة: استنساخ كامل طول كدنا المتوفرة تجارياً من مختلف البائعين أو يمكن أن تتولد عن طريق النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي) الموارد على الإنترنت يوفر نسخة تسلسل جينات من النوكليوتيدات وأعربت عن تسلسل المعلمة (EST) قواعد البيانات. وتيسيرا للبروتين قد رغبت التصور والتحليل لمستويات التعبير، والانصهار للبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو علامة نيون مناسبة أخرى في استراتيجية الاستنساخ. - استخدام استراتيجية استنساخ تم التحقق من صحتها، إدراج الترميز تسلسل جين الفائدة في منطقة بيفت الاستنساخ لأغراض متعددة. وصف مفصل للاستنساخ الجزيئي والخطوات المطلوبة قد سبق وصف 12.
ملاحظة: إذا كان يتم إنشاء منتج الجين-الانصهار، تأكد من أن استنساخ في إطار القراءة الصحيحة. - تسلسل بناء استخدام جلوبين كبسولة تفجير لضمان الإدراج الجين الصحيح والسليم في إطار الانصهار، والتي تم إنشاؤها لا الطفرات المستحثة بوليميراز.
ملاحظة: إذا لم يتوفر معدات تسلسل "الحمض النووي سانجر"، العديد من الشركات تقدم خيارات تسلسل الحمض النووي منخفضة التكلفة. - موتاجينيزي الحمض النووي إذا إنشاء مجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة (بطانات) أو عمليات الإدراج/الحذف (إينديلس). ويرد وصف الطفرات الحمض النووي في خطوات 1.5-1.7 أدناه. لثوابت البرية من نوع، الانتقال إلى الخطوة استخطاط 1.7.
- تصميم كبسولة تفجير الطفرات وإتمام تفاعل PCR الطفرات لتوليد بنية متحولة للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. وقد بكر بوساطة الطفرات الموجهة من الموقع هو موضح سابقا 13. بالإضافة إلى ذلك، تقدم العديد من شركات مجموعات الموقع الموجه الطفرات التي تشمل البروتوكولات.
- تحويل الحمض النووي موتاجينيزيد إلى المضيف البكتيرية. عزل وتنقية بلازميد.
ملاحظة: جعل العديد من الشركات مجموعات التي يمكن استخدامها بسهولة لعزل وتنقية بلازميد الحمض النووي. متابعة بروتوكول الشركات المصنعة وفقا لذلك. إذا كان استخدام سلالة البكتيريا سلبية الغرام مثل كولاي، من المستحسن استخدام مجموعة أدوات إزالة endotoxins. - تسلسل الحمض النووي معزولة من ترانسفورمانتس البكتيرية باستخدام تسلسل "الحمض النووي سانجر" القياسية للتأكد من إدخال SNP المطلوب أو إينديل.
- لينيريزي المنتجات النهائية باستخدام واحد تقييد إنزيم هضم الحمض النووي المنقي.
ملاحظة: يتضمن ناقلات بيفت إنزيم واحد عدة قطع المواقع المدرجة في خريطة بلازميد في أدجيني 14. - التأكد من أن المنتج الخطية عن طريق [اغروس] هلام التفريد. المنهجية [اغروس] هلام التفريد قد سبق تعريف 14.
ملاحظة: جميع الخطوات المتبقية، استخدام نصائح بيبيت الحاجز (التصفية) والمواد الخالية من رناسي لضمان إنتاج مستقرة وعالية الجودة الجيش الملكي النيبالي. - تنقية المنتج هضمها باستخدام بروتوكول تنظيف الحمض النووي أو مجموعة تم التحقق من صحتها، والوتي في المياه خالية من رناسي/الدناز 30 ميليلتر.
ملاحظة: تدور السليكا-مصفوفة مجموعات تستند إلى عمود ويوصي بجودة عالية، وتنقية الحمض النووي. متابعة بروتوكول الشركات المصنعة وفقا لذلك. - في المختبر نسخ الحمض النووي استخدام بوليميريز T7 يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- تنقية والوتي الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر من الماء مجاناً رناسي/الدناز استخدام حمض النووي القائم على عمود تدور السليكا-مصفوفة تنقية عدة بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- أداء يشوه [اغروس] هلام التفريد استخدام الفورمالدهايد للتأكد من حجم المنتج النهائي الجيش الملكي النيبالي. راجع الخطوات 1.13-1.22 14أدناه. (الشكل 1).
- تحضير هلام بتدفئة [اغروس] ز 1 في 72 مل الماء حتى يذوب، ثم تبرد إلى 60 درجة مئوية.
- إعداد X 10 "اجتماعات" تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة والمماسح 0.4 متر (pH 7.0) وخلات الصوديوم 0.1 M 0.01 M يدتا.
- أضف 10 مل من 10 اجتماعات X تشغيل المخزن المؤقت، ومل 18 من 37% فورمالدهيد (12.3 M) في حل يبرد [اغروس].
- الطبقة الهلام بصب الحل [اغروس] إلى حاوية تكوين هلام. استخدام مشط كبيرة بما يكفي لاستيعاب 10 ميليلتر. بعد أن وضعت جل وحازم للمس، إزالة بلطف المشط.
- تجميع الجل في خزان التفريد، وإضافة ما يكفي 1 X اجتماعات تشغيل المخزن المؤقت، وضمان الجل مغطى تماما.
- إعداد عينات الحمض النووي الريبي بإضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لوحدات التخزين X 0.5 صبغ التحميل الذي يحتوي على الفورمالديهايد.
- إضافة اثيديوم بروميد إلى حل الجيش الملكي النيبالي بتركيز 10 ميكروغرام/مل.
- تؤذي الحمض النووي الريبي عينة الحل عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- استخدام العقيمة، 10 نصائح تصفية ميليلتر، تحميل 5 ميليلتر علامة الوزن الجزيئي و 5 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي sample(s) في آبار منفصلة من الجل واليكتروفوريسي في 5 الخامس/سم حتى الصبغ تم ترحيلها على الأقل ثلثي طول الهلام.
- تصور الجيش الملكي النيبالي في الهلام على إضاءة عبر الأشعة فوق البنفسجية. ضمان الجيش الملكي النيبالي هو الحجم الصحيح بمقارنة لعلامة الوزن الجزيئي.
- لقياس تركيز والنقاء من الجيش الملكي النيبالي، نقل 1.2 ميليلتر لتنقية الحمض النووي الريبي استخدام معقم 10 ميليلتر تصفية نصائح على الأشعة فوق البنفسجية--جهاز المطياف الضوئي.
علما أن الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة يجب أن يكون امتصاص نسب من A260/280 (1.8-2.2) و 260/230 (> 1.7) على التوالي. - استخدام 10 نصائح تصفية ميليلتر، الكوة الجيش الملكي النيبالي المنقي المتبقية في أنابيب الطرد المركزي ميليلتر 0.5 العقيمة (3-5 ميليلتر/أنبوب). تخزين أنابيب في-80 درجة مئوية حتى جاهزة ل microinjection.
ملاحظة: تركيز حقن نهائي من 500 نانوغرام/ميليلتر نقطة انطلاق أمثل. من المستحسن أن تضعف الجيش الملكي النيبالي 1:2 في رناسي مجاناً ح20 قبل microinjection لتقليل الحساسية للجيش النيبالي الملكي في microinjection ماصة.
2-فحص المرفقات كينيتوتشوري-ميكروتوبولي
- تقسيم بويضات إلى مجموعات متساوية ل microinjection.
ملاحظة: جمع البويضات، ونقل، و microinjection وهو نضوج قد وصفت بالتفصيل في جوف مسبقاً 15. - ميكروينجيكت مجموعة واحدة مع التجريبية مرناً والأفرقة الأخرى مع التحكم بالوزن وبرنامج تلفزيوني أو بروتينات فلورية خضراء مرناً.
ملاحظة: 500 نانوغرام/ميليلتر هو تركيز حقن الموصى بها للبدء مع 10. يمكن استخدام بيكوينجيكتور للتحكم في كميات حقن. ويوصي بحقن حجم رر 5-10 15. - باستخدام اليد أو الفم جهاز بيبيتينج تعمل فيها الزجاج "الماصة؛" فتح قليلاً أكبر من القطر من البويضات (100-150 ميكرومتر)، نقل بويضات إلى قطره 100 ميليلتر من مستنبت خالية من ميلرينوني في طبق بتري المشمولة في الجنين نوعية الزيوت المعدنية واحتضان بويضات ح 7 في 37 درجة مئوية في 5% C02 للسماح بالنضج الكافي الطورية الانقسام الاختزالي أنا (اجتمع أنا) 15.
- بعد الحضانة، استخدام أجهزة ماصة نفس النحو الوارد أعلاه، نقل بويضات إلى طبق ثقافة كذلك مركز جهاز الذي يحتوي على 700 ميليلتر من الوسائط الأساسية الدنيا مبردة مسبقاً (MEM) جمع المتوسطة في مركز جيد و 500 ميليلتر ح20 في خارج الحلبة و ضع الطبق على الجليد لمدة 7 دقائق.
ملاحظة: من المستحسن للبرد قبل وسائل الإعلام الفنزويلية ومركز جيد الجهاز ثقافة الأطباق في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل معالجة بويضات. - إصلاح بويضات بتحويلها باستخدام الأجهزة الماصة في بئر صفيحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر من بارافورمالدهيد 2% في 1 برنامج تلفزيوني X لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام نفس "الماصة؛" جهاز، نقل بويضات إلى بئر أخرى على لوحة موضعية التي تحتوي على 400 ميليلتر حل حظر (0.01 ٪ توين-20 + 0.02 ٪ نان3+ برنامج تلفزيوني + 0.3% جيش صرب البوسنة) ومخزن في 4 درجات مئوية حتى جاهزة عملية إيمونوستينينج.
ملاحظة: لتخزين بويضات عند 4 درجة مئوية، الزجاج غطاء لوحة بقعة مع بارافيلم لمنع التبخر. - باستخدام نفس الجهاز ماصة، بويضات نقل إلى بئر جديد على بقعة لوحة تتضمن حل permeabilization 400 ميليلتر (برنامج تلفزيوني جيش صرب البوسنة 0.3% 0.1% 100 تريتونكس + 0.02% نان3) واحتضان في درجة حرارة الغرفة 20 دقيقة لنقل بويضات بسرعة خلال ثلاثة قطرات من 400 ميليلتر عرقلة حل لإزالة أي بقايا المنظفات.
ملاحظة: صفيحة بقعة زجاج الشفاف 9-جيدا يعمل جيدا لنقل مجموعات من خلال معالجات متعددة على طبق واحد (الخطوات 2.4-2.5). - تنفيذ الإجراءات immunocytochemistry المتبقية في دائرة هوميديفيد، محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة. استخدام حاوية بلاستيكية متوسطة الحجم مبطنة بمناشف ورقية رطبة وتغطي برقائق الألومنيوم.
- استخدام جهاز ماصة، نقل بويضات إلى 30 ميليلتر عرقلة الحل على غطاء لوحة 96-جيدا والمكان داخل قاعة هوميديفيد لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: توضع قطرات في إيندينشنز دائرية على اللوحة. - لتسمية centromeres والدوران، استخدام أجهزة ماصة، ونقل بويضات إلى 30 ميليلتر عرقلة الحل الذي يحتوي على مستضد المضادة سينتروميريك (هيئة مكافحة الفساد، كريست) (01:30) ومكافحة أسيتيلاتيد توبولين (1: 1000) واحتضانها ح 1 على الأقل.
- شطف بويضات بنقل عن طريق قطرات ثلاث 30 ميليلتر من عرقلة الحل لكل 10 دقيقة.
- استخدام جهاز ماصة، نقل بويضات إلى ميليلتر 30 قطره من عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مجانية للأجسام المضادة المستخدمة أعلاه (الإنسان المضادة مفتش 1: 200, 1: 200 مفتش المضادة الماوس) واحتضانها ح 1.
- كرر الخطوات 3، الشطف 10-مين في 30 ميليلتر عرقلة الحل كما هو موضح في الخطوة 2.11.
- نقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة، إلى 3-5 ميليلتر تصاعد DAPI تحتوي على المتوسط (5.9 ميكروغرام/ميليلتر) على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
- وضع 4 قطرات صغيرة (حجم رأس دبوس) هلام البترول على زوايا بكشف الغطاء لمنع سحق بويضات.
- بلطف ضع الجانب فازلين كشف الغطاء إلى أسفل على الشريحة.
- ختم ساترة الحواف مع مسح طلاء الأظافر والسماح لتجف لمدة 5 دقائق.
- تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، حتى التجهيز عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل].
ملاحظة: تأكد من الانكسار من مباريات المتوسطة المتصاعدة، وساترة، مجهر أهداف يجري استخدامها. ووصف تصاعد الموصى بها سابقا كانت المواد 15. - صورة بويضات استخدام هدفا x 40-63 في مجهر [كنفوكل]، التقاط الخطوات الصغيرة (≤ 1 ميكرومتر) في z-الطائرة، الأمثل للعمل والهدف، وصورة المنطقة بأسرها المغزل الطورية.
ملاحظة: تأكد من الصورة في كل القنوات 3 استناداً إلى الأجسام المضادة الثانوية المحددة المستخدمة في الخطوة 2.11. صورة المتوسط ≥ 4 وتكبير 3 تعتبر مثالية للقرار الملائم. ويوفر حجم خطوة 1 ميكرومتر التصور الواضح ميكروتوبوليس وكينيتوتشوريس في بويضات الماوس. سوف تختلف إجراءات لالتقاط الصور من المجهر للمجهر. يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم [كنفوكل] مصنعين لخطوات محددة حول كيفية تكوين إعدادات المجهر. - تحديد حالة مرفق ميكروتوبولي kinetochore برامج التصوير عقب 2.21-2.23 الخطوات أدناه باستخدام.
ملاحظة: تصف الخطوات التالية هذا الإجراء باستخدام برنامج للتحميل مجاناً ي الصورة (المعاهد الوطنية للصحة)، ومع ذلك، يمكن استخدام برامج التصوير البديل. تعريف مركز المرفقات أنواع سابقا كانت 16 . - فتح الصورة عن طريق سحب الملف إلى شريط الأدوات "صورة ياء".
- في سلسلة ض فتح، جعل جميع قنوات مرئية (الحمض النووي كينيتوتشوري والمغزل) بواسطة النقر فوق "دمج القنوات"، المتوفرة في القائمة المنسدلة "الصورة"، ضمن علامة التبويب الفرعية "اللون".
- استخدام تبديل في الجزء السفلي من الصورة، التحرك من خلال كل شريحة ض وتحديد مرفق ميكروتوبولي kinetochore. ووصف مفصل مرفق الأوصاف كانت سابقا 16
3-الكروموسوم المحاذاة التحدي الإنزيم
- استخدام جهاز ماصة، كما هو موضح في الخطوة 2، 3، نقل بويضات إلى قطره 100 ميليلتر من مستنبت خالية من ميلرينوني تحت النفط واحتضان بويضات ح 7 للسماح للنضج الكافي الطورية للانقسام الاختزالي أنا (اجتمع أنا) كما تم وصفه سابقا في الخطوة 2، 3 17 .
ملاحظة: إجراءات جمع و microinjection ونضوج البويضات وعرضت سابقا 15. الرجوع إلى بروتوكول مرفق المقايسة في خطوات 2.1-2.2 للضوابط وتركيزات microinjection الجيش الملكي النيبالي. - باستخدام نفس جهاز ماصة، نقل بويضات لثقافة جهاز جيدا مركز صحن تحتوي على 700 ميليلتر الثقافة المتوسطة المحتوية على موناسترول [100 ميكرومتر] في مركز ميليلتر جيدا و 400 ح20 في الحلقة المحيطة واحتضانها في 37 درجة مئوية ح 2.
- شطف من موناسترول بنقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة أعلاه، عن طريق ثلاث قطرات من 100 ميليلتر كزب الثقافة المتوسطة، ومن ثم نقل بويضات لطبق ثقافة كذلك مركز جهاز جديد الذي يحتوي على 700 ميليلتر الثقافة المتوسطة + MG132 [5 ميكرومتر] ح 3 في المركز خاتم. إضافة 400 ميليلتر ح20 إلى خارج الحلبة.
- إصلاح بويضات بتحويلها، باستخدام أجهزة ماصة، في بئر صفيحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر 2% بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد التثبيت، نقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة، في بئر جديدة للوحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر عرقلة الحل ومخزن في 4 درجات مئوية حتى المجهزة إيمونوستينينج.
ملاحظة: لتخزين بويضات عند 4 درجة مئوية، الزجاج غطاء لوحة بقعة مع بارافيلم لمنع التبخر. - بيرميبيليزي، وتسمية بويضات عبر إيمونوسيتوتشيميستري كما هو موضح في الخطوات 2.6 2.16.
- بويضات استخدام هدفا x 40-63 في مجهر [كنفوكل]، والتقاط صورة < 1 ميكرومتر الخطوات في z-الطائرة مع التأكد من الصورة في المنطقة بأسرها من المغزل الطورية.
- لتحديد محاذاة كروموسوم فتح مركز ملفات الصور باستخدام برامج التصوير.
ملاحظة: تصف الخطوات التالية هذا الإجراء باستخدام برنامج للتحميل مجاناً ي الصورة (المعاهد الوطنية للصحة)، ومع ذلك، يمكن استخدام برامج التصوير البديل. - اسحب الصورة إلى لوحة التحكم صورة ياء.
- في سلسلة ض فتح، استخدم أداة نقطة (المتوفرة بالنقر فوق أيقونة الأداة إلى نقطة في شريط التحكم ي الصورة) لوضع علامة نقطة في نهاية كل القطب المغزل في على كل شريحة z بوضع الأداة فوق القطب المغزل في الصورة والنقر على الصورة. إضافة هذه النقاط إلى منطقة مدير مصلحة (ROI) بالضغط على Command + t على لوحة المفاتيح.
- تحديد الإحداثيات المحددة لكل من المواقع التي حددتها في الخطوة 3، 10 تسليط الضوء على نقطة معينة في إدارة عائدات الاستثمار والنقر على زر الإجراء. هذا وسوف توفر نتائج التي تحتوي على الجدول x و y إحداثيات لكل نقطة. سوف تكون هذه النقاط X1, Y1, و X1، Y2، على التوالي.
- القادم, تحديد الإحداثيات الحقيقية Z. ويتم هذا عن طريق ضرب عدد z-شريحة محددة في z-بنية تخزين العناصر التي تم تحديد القطب المغزل شريحة (أي شريحة #2 6) موجود في كل نقطة الفردية بسمك المكدس (أي 1 ميكرومتر) (مثال: شريحة 2 × 1 ميكرومتر = 2). وسوف تكون هذه النقاط Z1 و Z2 على التوالي.
- تحديد طول عمود الدوران باستخدام معادلة مبرهنة فيثاغورس (2 + ب2 = ج2) استخدام المعرفة مسبقاً x و y و z الإحداثيات من الخطوات 3.11 3.13. لكل محور الدوران طول النهائي يساوي:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - تحديد ميدزوني المغزل. ويحسب هذا كنصف طول محور الدوران. باستخدام أداة الخط في "صورة ياء"، بالنقر على أيقونة الخط في شريط الأدوات "صورة ياء"، رسم خط من أحد المغزل القطب ميدزوني المغزل. سيتم عرض الطول "ي صورة" من شريط الأدوات.
- تحديد حالة محاذاة كروموسوم بتقدير المسافة كروموسوم من ميدزوني شوكي باستخدام أداة قياس الخط. باستخدام أداة الخط المتوفرة بالنقر على أيقونة الخط في شريط الأدوات "صورة ي"، رسم خط من ميدزوني شوكي على الكروموسوم. سيتم عرض الطول "ي صورة" من شريط الأدوات. وتعتبر الكروموسومات أكبر من 4 ميكرون من ميدزوني شوكي محازى 18.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد في المختبر سيكون النسخ عالية الجودة الجيش الملكي النيبالي نسبة A260/A280 (1.8-2-2) و ≥1.7 نسبة A260/A230 عندما تقاس باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتظهر الصورة في الشكل 1 الهجرة في المختبر-إنتاج الحمض النووي الريبي على [اغروس] هلام يشوه بعد التفريد. يمكن أن تشير إلى فرقة التي ملطخ في نمط أو نموذج يحتوي على عدة نطاقات الحجم تلوث أو تدهور للعينة. وبدلاً من ذلك، قد يشير إلى نطاقات متعددة أن مرناً هو ليس تماما التشويه والتحريف، أو لا كان خطيا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بسبب تحديد المتغيرات الجينية البشرية المرتبطة بالمرض السريع والمتزايد، من الضروري أن يتم إنشاء نظم لتقييم أهميتها البيولوجية. فهم وظيفة البروتين في الانقسام الاختزالي البشرية يطرح تحديات خاصة نظراً لأن بويضات بشرية ثمينة والحيوانات المنوية نادرة والبشرية ليست قابلة للتلاعب بالجينات. بويضات الماوس نظام نموذج الثدييات قيماً لتقييم وظيفة الجينات البشرية هو 10،23. يتجاوز هذا النموذج المشار لاستخدام البويضات البشرية مع توفير مصدر متاحة بسهولة من بويضات منخفضة التكلفة،...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
بتأييد هذا العمل "منحة بحثية" من "الجمعية الأمريكية" "الطب الإنجابي" وتشارلز وجوانا بوسكه الصندوق التذكاري في روتجرز، "جامعة الدولة في نيوجيرسي" "يماثل كانساس" تدعمها منحة من N.I.H. (F31 HD0989597).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2 مل أنبوب PCR Seal-Rite | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1602-4300 | |
| 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي | الحراري العلمي | SM0313 | |
| 100 نقطة أساس سلم الحمض النووي | الحراري العلمي | SM0243 | |
| 6X تحميل الحمض النووي صبغة | الحرارة العلمية | R0611 | |
| لوحة بقعة زجاجية 9 آبار | توماس ساينتفيك | 7812G17 | |
| Agarose | سيجما ألدريتش | A9539 | |
| ألبومين من مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 مترافق مضاد للفأر IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 التخفيف |
| Alexa-fluor-633 المترافق المضاد للإنسان IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 تخفيف |
| الأمبيسلين | VWR | AA0356 | |
| الجدول المضاد للاهتزاز | Technical Manufacturing Corp | أي نموذج قياسي | |
| مضاد للأسيتيل Tubulin الأجسام المضادة | Sigma Aldrich | T7451 | 1: 100 diution |
| الأجسام المضادة للأجسام المضادة المضادة للمركز (CREST) | مدمجة | 15-234 | 1:30 تخفيف ؛ |
| الحاجز (الفلتر) أطراف الماصة | Thermo Scientific | AM12635 | تأكد من توافقها مع علامتك التجارية من الماصات. هذه متوافقة مع ماصات العلامة التجارية Eppendorf. |
| BD Difco وسائط الثقافة المجففة: LB Agar ، Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth ، Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| الأنابيب الشعرية | Sutter | B100-75-10 | |
| مركز صحن ثقافة الأعضاء | VWR | 25381-141 | |
| خزان | لحاضنة | ||
| المجهر متحد البؤر | زايس | أي نموذج | |
| قياسي الطرد المركزي (مع قدرة التبريد) | توماس العلمي | أي نموذج قياسي | |
| غطاء زجاجي 11 × 22 مم | أغطية توماس سيانتيفك | 6663F10 | |
| توماس سيانتيفك | 6663-F10 | باختلاف مجاهر معينة | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| حمام جاف رقمي | حراري علمي | 888700001 | |
| سهل A عالية إنزيم استنساخ الإخلاص | Agilent | 600400 | لاستنساخ الحمض النووي |
| يمكن استخدام إنزيمات الخطية pIVT | New England Biolabs | NdeI أو KasI | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent المجهر | يمكن استخدام أي مجهر فلوري | ||
| الفورمالديهايد (37٪) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| صبغة تحميل الحمض النووي الريبي الفورمالديهايد | Ambion | 8552 | |
| المجهر المصنفر (غير مشحونة) 25X75 مم | فيشر Scientific | 12-544-3 | |
| استنساخ | الطول يمكن الحصول عليها من أي بائع يوفر القراءة المفتوحة استنساخ الإطار | ||
| جهاز الرحلان الكهربائي للهلام | Bio-Rad | أي نموذج قياسي | |
| زجاج باستور بيبيتس | فيشر Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer ل pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&NBSP; يمكن شراؤها من أي شركة تقوم بإنشاء أوليغونوسيلوتيدات مخصصة | ||
| Globin Reverse Primer ل pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3 'يمكن شراؤها من أي شركة تقوم بإنشاء oligonucelotides مخصصة | ||
| ماصات | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Moistified Chamber | Tupperware | ||
| يمكن استخدامها Illustra جاهز للذهاب حبات RT-PCR | حاضنة GE Life Sciences | 27925901 | |
| أي نموذج قياسي مع تقنية CO2 والمياه المغلفة | |||
| مجهر مقلوب | أدوات | نيكون أي نموذج قياسي | |
| صورة J (NIH) برنامج | المعاهد الوطنية للصحة | لتحليل الصور | |
| غطاء 96 لوحة بئر | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| التصاق منخفض 0.5 مل أنبوب microcentrifgue | الولايات المتحدة الأمريكية Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector ؛ | برنامج تحليل تسلسل MacVector | ||
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| شرائح مجهر | فيشر العلمي | 12-544-3 | |
| علامات الحمض النووي الريبي الألفية - الفورمالديهايد | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspension في DMSO عند 2.5 ملي |
| متر زيت معدني | Sigma-Aldrich | M5310 | الذي تم اختباره بواسطة الأجنة ومعقم |
| ومعقم يتم تعليقه في DMSO عند خزان 100 ملي | |||
| لسان حال | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 | لطلاء الأظافر المضادة للاهتزاز | ||
| . مسح | يمكن استخدام أي طلاء أظافر شفاف | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | أي نموذج قياسي | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X تشغيل العازلة | تقنيات الحياة | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS تشغيل العازلة | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| طبق ثقافة الأعضاء 60x15mm | تقنيات الحياة | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences، Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 مم | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri Dish 35 مم | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 مم | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | أي موديل قياسي | |
| مجتذب الماصة | المشتعلة بني مجتذب الماصة | نموذج P-1000 | |
| pIVT البلازميد | AddGene | 32374 | ناقلات فارغة مناسبة للتعبير عن البويضات. |
| مصل الفرس الحامل موجهة الغدد التناسلية | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | تنقية ما يصل إلى 20 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد |
| QIAطقم تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل | السريع Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II طفرات التواجد الموجه | للموقع Agilent & nbsp ؛ | 200523 | طفرات الإدراج والحذف |
| Quikchange Lightning مجموعة طفرات التوجيه متعدد | Agilent | 210512 | طفرات لتغييرات موقع واحد |
| مقص (نقطة دقيقة) | أدوات العلوم الدقيقة | 14393 | |
| مقص (نقطة متوسطة) | أدوات العلوم الدقيقة | WP114225 | |
| أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1615-5500 | |
| جهاز تسخين | الشرائح أي نموذج قياسي | ||
| مقياس الطيف الضوئي (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| مجهر | مجسم أي نموذج قياسي | ||
| كفاءة الاستنساخ الفرعي DH5a الخلايا المختصة | حقنة حرارية فيشر | 18265017 | |
| حقنة | BD Bioscienes | 309623 | 1 مل ، 27 جم (1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine عالية الإنتاجية مجموعة نسخ الحمض النووي الريبي المغطى | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (نقطة دقيقة - الحجم 5) | أدوات العلوم الدقيقة | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase / Ranese Free Thermo | Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg / mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV / White lite transilluminator | فيشر Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة | H-1000 |
المراجع
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
