مقالة منهجية

تثبيت الرئة تحت الضغط المستمر لتقييم انتفاخ الرئة في الفئران

DOI:

10.3791/58197

⸱

سبتمبر 26, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هنا هو بروتوكول مفيد لتثبيت الرئة التي تخلق حالة مستقرة لتقييم النسيج ية من عينات الرئة من نموذج الماوس من انتفاخ الرئة. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أنه يمكن إصلاح العديد من الرئتين مع نفس الضغط المستمر دون انهيار الرئة أو الانكماش.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتفاخ الرئة هو سمة هامة من أمراض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). تتطلب الدراسات التي تنطوي على نموذج الماوس انتفاخ الرئة تثبيت الرئة الأمثل لإنتاج عينات النسيج ية موثوق بها من الرئة. بسبب طبيعة التركيب الهيكلي للرئة، والتي تتكون إلى حد كبير من الهواء والأنسجة، هناك خطر أن ينهار أو ينكمش خلال عملية التثبيت. توجد طرق مختلفة لتثبيت الرئة، ولكل منها مزاياه وعيوبه الخاصة. طريقة تثبيت الرئة المعروضة هنا تستخدم الضغط المستمر لتمكين التقييم الأمثل للأنسجة للدراسات باستخدام نموذج الرئة الماوس انتفاخ الرئة. الميزة الرئيسية هي أنه يمكن إصلاح العديد من الرئتين مع نفس الحالة في وقت واحد. يتم الحصول على عينات الرئة من الفئران المزمنة المعرضة لدخان السجائر. يتم تنفيذ تثبيت الرئة باستخدام المعدات المتخصصة التي تمكن من إنتاج الضغط المستمر. ويحافظ هذا الضغط المستمر على الرئة في حالة تضخم معقولة. وهكذا، يولد هذا الأسلوب عينة نسيجية من الرئة التي هي مناسبة لتقييم السجائر الناجمة عن دخان انتفاخ الرئة خفيفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الانسداد الرئوي المزمن هو واحد من الأسباب الرائدة في جميع أنحاء العالم للوفاة1. دخان السجائر هو أهم سبب للانسداد الرئوي المزمن، ولكن آليات مسببات الأمراض لا تزال محددة بشكل غير كامل. يُظهر مرض الانسداد الرئوي المزمن خاصتين رئيسيتين، بما في ذلك الحد التدريجي لتدفق الهواء والاستجابة الالتهابية غير الطبيعية للرئة. اضطراب انتفاخ الرئة يحدث في كثير من الأحيان في الرئتين من مرضى الانسداد الرئوي المزمن2. النتائج المرضية للانتفاخ الرئوي تتميز بتدمير جدارالسنخي3. وقد استخدمت العديد من الأنواع الحيوانية لتوليد نماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن في الجسم الحي (أي الكلاب والخنازير غينيا والخنازير والقوارض)4. ومع ذلك، أصبح الماوس الأكثر استخداماً في بناء نماذج الانسداد الرئوي المزمن. هذا له العديد من المزايا، بما في ذلك انخفاض تكلفته، والقدرة على أن تكون معدلة وراثيا، وتوافر معلومات الجينوم واسعة النطاق، وتوافر الأجسام المضادة، والقدرة على استخدام مجموعة متنوعة من سلالات الماوس5. في الوقت الحاضر، لا يوجد نموذج الماوس التي يمكن أن تحاكي الميزات الكاملة للبكاد البشرية. وبالتالي، يجب على الباحثين الفردية اختيار النموذج الذي هو الأكثر ملاءمة للبحوث مرض الانسداد الرئوي المزمن محددة6. نموذج الماوس انتفاخ الرئة هو واحد من العديد من نماذج الماوس COPD المتوفرة حاليا. وتشمل النماذج الإضافية نموذج الماوس تفاقم, نموذج الأمراض المشتركة النظامية, وCOPD نموذج قابلية الحمل7.

يمكن توليد نموذج الماوس انتفاخ الرئة من قبل عدة أنواع من العوامل الخارجية، بما في ذلك العوامل الكيميائية والتعرض لدخان السجائر4. التعرض للمواد الكيميائية (على سبيل المثال، إلى elastase) تنتج نوعا خطيرا من انتفاخ الرئة، في حين أن دخان السجائر يؤدي إلى انتفاخ الرئة خفيفة8،9. ويعتقد أن دخان السجائر هو السبب الرئيسي لمسببات الأمراض من مرض الانسداد الرئوي المزمن. لذلك، فإن اختيار دخان السجائر كوسيلة لإنشاء نموذج الماوس COPD معقول10. وقد استخدمت العديد من الدراسات دخان السجائر لخلق انتفاخ الرئة في الماوس. على سبيل المثال، نجح Nikula وآخرون في إنشاء نموذج فأر انتفاخ الرئة من الفئران الإناث B6C3F1 من خلال تعريضها لدخان السجائر لمدة 7 أو 13 شهرا11. لقد أنشأنا أيضا نموذج الماوس انتفاخ الرئة عن طريق البروتين علامة الحساسية / SMP-30 KO الفئران12. من المهم للغاية إجراء طريقة تثبيت الرئة التي يمكن تصور بشكل صحيح هذا النموذج انتفاخ الرئة خفيفة عن طريق التعرض لدخان السجائر.

وقد وضعت طرق مختلفة لتثبيت الرئة13. ومع ذلك، لا توجد طريقة معيار الذهب لتثبيت أنسجة الرئة لتقييم انتفاخ الرئة14. وقد أظهرت العديد من الدراسات من هذا المختبر أن نظام التثبيت المعروض هنا مفيد من خلال خلق حالة مستقرة لتقييم انتفاخ الرئة12،15،16،17،18. الميزة الرئيسية للنظام الحالي هو أنه يمكن إصلاح العديد من الرئتين مع نفس الحالة في وقت واحد دون انهيار الرئة أو الانكماش. يستخدم نظام تثبيت الرئة الحالي بعض المعدات الخاصة التي تسمح بتضخيم عينات الرئة في ضغط ثابت مناسب لفترة معينة. تتكون هذه المعدات الخاصة من ثلاثة أجزاء، بما في ذلك حاوية سفلية، وحاوية علوية، ومضخة. يتم وضع عينات الرئة في الحاوية السفلى التي ترتبط بعوامل التثبيت المضغوط، مما يؤدي إلى 25 cmH2O الفرق في الضغط في مستوى العوامل بين الحاويات العليا والسفلى19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على الأساليب التالية من قبل لجان رعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب بجامعة جونتيندو. تم اتباع المبادئ التوجيهية للوتجري السليم للتجارب الحيوانية، المجلس العلمي الياباني، 1 يونيو 2006. هناك ثلاث خطوات رئيسية في هذه الطريقة: 1) تشريح الماوس، 2) exsanguination الرئة، و 3) تثبيت أنسجة الرئة بمساعدة المعدات المتخصصة. عادة، تتم معالجة عينات الرئة لتضمين بعد 48 ساعة من التثبيت12،15،16،17،18.

1. تشريح الماوس

  1. قياس وزن الجسم من الماوس، ثم تحديد كمية البنتوباربيتال لإدارة.
  2. حقن البنتوباربيتال داخل اقابي عند جرعة من 70 ملغ / كغ من وزن الجسم وتأكيد التخدير من خلال عدم وجود رد فعل لقرصة اصبع القدم.
  3. حقن الإبرة في زاوية 45 درجة حتى تخترق الجلد والعضلات. رسم الغطاس وتأكيد فراغ الهواء، ثم حقن pentobarbital.
  4. تأكيد التخدير من خلال عدم وجود حركة منعكسة.
    ملاحظة: ينصح باستخدام الماوس التخدير بدلاً من الماوس القتل الرحيم لexsanguination الرئة بالكامل.
  5. قطع جلد الماوس وعضلات البطن على خط الوسيطة، وتهدف إلى منطقة الرأس.
  6. قطع أفقيا لتوفير مساحة عمل أوسع.

2. الرئة exsanguination

  1. فضح طبقة الحجاب الحاجز وثقب مع ملقط.
  2. فتح الفضاء الصدري وقطع منطقة صارمة، مما يسمح للرئتين والقلب أن ينظر إليها بوضوح.
  3. قطع القلب في الأذين الأيسر والبطين الأيمن.
  4. أدخل قنية (24 غ) في منطقة البطين اليمنى ووجّهها إلى منطقة الرأس حتى تصل إلى الشريان الرئوي، كما هو مبين في الشكل 1.
  5. قم بتشغيل المضخة والسماح للملح 1x الفوسفات المخزنة (PBS) لتعميم (حوالي 200 مل / ساعة) حتى تتغير جميع أنسجة الرئة إلى اللون الأبيض.

3. تثبيت أنسجة الرئة

  1. إزالة القصبة الهوائية والرئتين والقلب.
  2. حرر جميع الأعضاء الثلاثة عن طريق قطع الأنسجة الضامة المحيطة.
  3. ربط الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى مع خيط خياطة وقطع جميع فصوص الرئة اليمنى.
  4. (اختياري): الفصوص من الرئة اليمنى تتكون من أربعة أجزاء. قطع هذه الأجزاء من الشعب الهوائية الرئيسية الحق وتقسيم أجزاء للمعالجة كعينات الأنسجة المجمدة.
  5. أدخل القلب والفصوص في الرئة اليسرى في عوامل التثبيت، الموجودة داخل حقنة 10 مل.
    تحذير: عوامل التثبيت خطرة. ارتداء معدات الحماية المناسبة (على سبيل المثال، قفازات مطاطية طويلة) والعمل في غرفة جيدة التهوية.
  6. إنشاء حالة فراغ باستخدام حقنة 10 مل لتضخيم الرئة، كما هو مبين في الشكل 2.
  7. تُدرج قنية (20 غ) في القصبة الهوائية وتربط عقدة.
  8. تضخيم الرئة مع عوامل تحديد للتحقق من وجود تسرب، وذلك باستخدام حقنة 1 مل.
  9. نقل إلى معدات ضغط تثبيت الرئة، كما هو موضح في الشكل 3.
  10. بعد تحديد الفترات، قم بإزالة عينة الرئة التي تربط القصبة الهوائية بعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكما هو موضح سابقا، يمكن تقسيم المعدات المتخصصة، التي تولد ضغطا مستمرا ممتدا، إلى ثلاثة أجزاء(الشكل 3ألف). الجزء السفلي هو النقطة التي لإدراج عينة الرئة(الشكل 4A). يتم توصيل الرئة عن طريق قنية (20 G) إلى غيض من تدفق formalin باستخدام الديك وقف ثلاثية (الشكل 4B). يتم توليد الضغط من مستويات سطح مختلفة من عوامل التثبيت بين الحاويات السفلى والعليا(الشكل 5)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجراء التثبيت للرئتين القوارض المعروضة هنا ليست جديدة; ومع ذلك، هذا النظام له العديد من المزايا. أولا، فإنه يمكن إصلاح العديد من الرئتين (كحد أقصى من 20) مع نفس الحالة في وقت واحد. جمعية علم الأمراض السامة تنص على أن الضغط لغرس الجاذبية تختلف من 22-25 سم2س22. وتجدر الإشارة إلى أن العديد من الدراسات قد أجريت تثبيت الرئة في ضغط 25 سم2O13،19،23،24،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لصاحبي البلاغ أي مصالح متنافسة يعلنان عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل جزئياً منحة كاكينجي رقم 26461199 (T. Sato) ومعهد الطب البيئي والطب الجنساني، كلية الدراسات العليا في الطب بجامعة جونتيندو، رقم المنحة E2920 (T. Sato). لم يكن للفوّل أي دور في تصميم الأساليب الحالية وفي كتابة المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ فورمالين (محلول عازلة محايد للفورمالين)واكو060-01667
ملقط مثنيHammacherHSC187-11
قنية ، مقاس 20 جرامTerumoSR-FS2032
قنية ، مقاس 22 جرامTerumoSR-OT2225Cقنية لإخراج ملقط الرئة
HammacherHSC184-10
Kimtowelنيبون بيبر كريسيا (كيمبرلي كلارك)61000
كيموبايتنيبون بيبر كريسيا (كيمبرلي كلارك)62011
حاوية سفلية (مادة زجاج أكريليك)طوكيو ساينسمكون معدات الضغط
حسب الطلب مضخة أسطوانيةNissin Scientific CorpNRP-75آلة المضخة لإخراج مضخة الأسطوانة الرئة
RP-2000Eyela (طوكيو Rikakikai Co. Ltd)160200مضخة معدات الضغط
أنبوب سيليكون & Oslash ؛ 9 ممSansyo94-0479مكون معدات الضغط
Somnopentyl (64.8 مجم / مل)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312للصوديوم Pentobarbital
HammacherHSB014-11
خيط خياطة ، مقاس 0NescosutureGA01SW
حقنة ، 1 ملحقنة TerumoSS-01T
، 1 مل مع إبرةحقنة TerumoSS-01T2613S
، 10 ملTerumoSS-10ESZ
محبس ثلاثي الاتجاهاتTerumoTS-TR1K01
حاوية علوية (مادة زجاج أكريليك)معدات الضغطحسب الطلب في طوكيو ساينس
مقص جراحي مكون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SMP30

مقالات ذات صلة