Method Article

بروتوكول قابل للتخصيص "الجمعية سلسلة" جرنة الاستنساخ (ستأجر)

DOI:

10.3791/58556

⸱

December 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، فإننا نقدم سلسلة الجمعية جرنا الاستنساخ (ستأجر)، أسلوب متعدد ناقلات جرنا بسهولة لنهج كريسبر/Cas9. ستأجر يجعل الإرسال المتعدد جرنة بسيطة وفعالة وقابلة للتخصيص.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام كريسبر/Cas9 البكتيرية زيادة كبيرة في الخيارات المنهجية لعلماء الحياة. نظراً لاستخدامها، أصبحت الهندسة الوراثية والجينوم تنطبق على مجموعة كبيرة من النظم. وعلاوة على ذلك، العديد من النسخي والنهج الهندسية ابيجينوميك الآن عموما ممكناً للمرة الأولى. يكمن أحد أسباب انطباق واسع كريسبر في طبيعته ثنائي. جرناس الصغيرة تحدد أهدافا الجينوم للمجمع والمتغيرات من البروتين Cas9 والآثار الجزيئية المحلية. ومع ذلك، نهج كريسبر كثيرة تعتمد على إيصال جرناس متعددة متزامنة في الخلايا الفردية. هنا، فإننا نقدم بروتوكولا لتخصيص لجرنا الجمعية سلسلة الاستنساخ (ستأجر)، خطوة أسلوب يسمح توليد بسيطة وسريعة وفعالة لجرنا متعدد ناقلات التعبير في استنساخ واحد. ستأجر فعالة من حيث التكلفة، حيث (في هذا البروتوكول) تسلسل استهداف الفردية التي يتم تقديمها بواسطة كبسولة تفجير عبء قصيرة بينما قوالب الحمض النووي طويلة من أشرطة الكاسيت التعبير جرنة يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. وعلاوة على ذلك، يسمح ستأجر إدراج خطوة واحدة من عدد كبير من جرناس، فضلا عن مجموعات من المتغيرات المختلفة جرنة وناقلات والمروجين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جرنة الجمعية سلسلة الاستنساخ (ستأجر) هو أسلوب تمكين كفاءة توليد بين عشية وضحاها من ناقلات التعبير الذي يحتوي على التعبير جرنة عدة أشرطة الكاسيت في استنساخ واحدة واحدة خطوة. لا تعتمد على الخبرة المتخصصة أو مواد البروتوكول ستأجر ويوفر خيارات متعددة للتخصيص.

البروتين كريسبر البكتيرية Cas9 لديها قدرة فريدة من نوعها. أنها قادرة على إيجاد وربط بشكل انتقائي فقط تسلسل الحمض النووي المشفر في كرناس طبيعيا أو جرناس المهندسة1. وقد مكن الانتفاع بها كأداة جزيئية عددا كبيرا من النهج التي كانت مستحيلة وغير مجد أو يقتصر فقط على بعض النماذج الخلوية حتى وقت قريب. تشمل هذه الطفرات الجينات المستهدفة2، هندسة الجينوم3، ابيجينومي تحرير4،،من56والتنشيط النسخي والجينات إسكات7،8. وبقدر ما نعلم كريسبر الانتشار عالمياً، كتقارير عن تطبيق موجود لمجموعة واسعة من المواقع المستهدفة، وأنواع الخلايا والأنواع. ومع ذلك، تعتمد العديد من كريسبر التطبيقات مباشرة أو غير مباشرة على إيصال جرناس متعددة بما في ذلك سلسلة من التلاعب الجينوم (المولدة9،10، متوسطة11 وتعديلات واسعة النطاق الجينوم 12 , 13)، هندسة الجينوم (استخدام Cas9 نيكاسيس14)، وتوليد الآليلات الشرطي11،15 أو16من الطفرات المسلسل وتتبع استراتيجيات17. وعلاوة على ذلك، للنهج الأخرى (النسخي الهندسية18،19،الهندسية epigenome20) متعددة تستهدف مواقع ليست إلزامية صارما، إلا تصل إلى أثرها الأقصى غالباً إلا في إطار هذا الشرط.

وقد وصفت عدة طرق مفيدة لتوليد نواقل جرنة التي تحتوي على أكثر من جرنة التعبير كاسيت21،،من2223،24،25،26، 27. نقدم هنا، بروتوكولا ستأجر، جرنة الجمعية سلسلة الاستنساخ، وهي معلقة في مزيج البساطة والسرعة (واحد فقط بين عشية وضحاها المسبق الخطوة الاستنساخ)، منخفضة التكلفة (كما يمكن إعادة استخدام قوالب الحمض النووي عدة مرات)، (لمن التفصيل نظم جرنة مختلفة والمروجين) وفعالية (أنها تسمح توليد المتجهات التي تحتوي على عدد كبير من شرائط جرنة)28.

ستأجر يمكن من حيث المبدأ أن تولد ناقلات التعبير بقليل (جرناس 1 – 2)، عدة (جرناس 3 – 5)، وبعض من أكبر عدد من أشرطة الكاسيت التعبير أفادت حتى الآن (جرناس 6 – 8)28. وبالمثل، ستأجر قابل للتطبيق لأي تسلسل جرنة أو العمود الفقري أو مروج. منذ بيد ستأجر يستند أساسا بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) والجمعية جيبسون، يجب إنشاء جرناس مع أوجه التشابه في تسلسل عالية باستخدام أسلوب بديل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تصميم ستأجر استنساخ استراتيجية

  1. تقرر في جرنة كم من أشرطة الكاسيت ستدرج في ناقلات تعبير واحد والترتيب الذي. تحديد المروجين وجرنة السقالات ينبغي أن تستخدم لكل من جرناس. تصميم جرناس باستخدام أي أداة على الإنترنت (علىسبيل المثال، www.benchling.com).

2-تصميم ستأجر استنساخ الإشعال مع يتدلى

ملاحظة: تسلسل بروتوسباسير معنى جرنة الماضي وأنتيسينسي من جرنة الأولى على التوالي هي إضافة إلى الإشعال PCR يستخدم للتضخيم من ناقلات العمود الفقري (الشكل 1). تسلسل المتبقية التي تتضخم من السلاسل، إرفاق ذلك بالمعنى والعقاقير جرناس في الترتيب المطلوب. السلسلة الأولى يتم تضخيمه قطعة مع تمهيدي إلى الأمام التي تحتوي على جرنة أول تسلسل N20 كعبء وعكس تمهيدي مع جرنة الثانية تسلسل N20 (عكس تكملة) كعبء. يتم إنشاء كافة القطع التالية تبعاً لذلك.

  1. إضافة تسلسلات جرنة N20 الإشعال التضخيم إلى الأمام لسلسلة "الحمض النووي ستأجر" كما يتدلى (الجدول 1). إضافة الإحساس بتسلسل جرنة 5 'إلى الأمام التمهيدي"صندوق إنقاذ الطفولة-تنظيم الأسرة"(سقالة تقليدية) أو"سام-تنظيم الأسرة" (سقالة التي تحتوي على MS2). كبسولة تفجير FP يصلب سقالة/MS2 الجزء من السلسلة ستأجر كل منهما (الشكل 1).
  2. إضافة تكملة عكس التسلسل جرنة N20 إلى تسلسل عكس التمهيدي. اختر الإشعال RP حسب المروجين محددة والسلاسل المستخدمة (hU6 RP، mU6--البرنامج العادي، 7sK-البرنامج العادي، H1-RP).

3-توليد ستأجر استنساخ الأجزاء

  1. لإنشاء أجزاء الاستنساخ الفردي للجمعية جيبسون، إجراء تقارير إتمام المشروعات بإعداد 10 ميليلتر المخزن الدقة العالية (HF)، 1 ميليلتر من دنتبس 10 ملم، 0.25 ميليلتر من عبء-التمهيدي (100 ميكرومتر)، 10 نانوغرام من الحمض النووي قالب (سلسلة أو ناقل)، 0.5 ميليلتر HF بوليميراز ، 1.5 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وإضافة ح2س جعل وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر.
    ملاحظة: استخدام بلازميد "STAgR_Neo" كقالب للعمود الفقري PCR لإدراج سقالة جرنا إلى جرنا آخر، إذا تم اختيار سقالة سام، استخدم "STAgR_SAM". بلازميد ستأجر مع جرنة ستة أشرطة الكاسيت على سبيل المثال، ستة تقارير إتمام المشروعات ضرورية، خمسة مع الحمض النووي سلاسل كقوالب، وواحدة مع ناقلات العمود الفقري كالقالب.
  2. احتضان ردود الفعل على ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: 1 دورة 98 ° ج 1 دقيقة 30 ثانية؛ دورات 38 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 59 درجة مئوية (سقالة جرنة)/68 درجة مئوية (لحلقة سام) لمدة 10 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 s (لإدراج)/1 دقيقة 30 s (لناقلات)؛ 1 دورة 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إزالة ميليلتر 5.5 من رد فعل بكر وإضافة صبغة التحميل وتحليل الشظايا تضخيم على 1% [اغروس] هلام. تحميل سلم الحمض النووي مناسب للتحجيم (100 شركة بريتيش بتروليوم الحمض النووي سلم/1 كيلو بايت الحمض النووي سلم) وتشغيل الهلام في تشغيل جل مناسب المخزن المؤقت (مثلاً، TLE المخزن المؤقت) في 120 الخامس لمدة 30 دقيقة.
  4. بينما يتم تشغيل الهلام، إضافة 5 ميليلتر من المخزن المؤقت المقدمة مع إنزيم التقييد و 0.5 ميليلتر Dpnالأول (10 وحدات) لتفاعل PCR ميليلتر 44.5 المتبقية واحتضان لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. إجراء تنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسية.
    1. إضافة 1.8 الخرز المغناطيسي ميليلتر الواحدة 1 ميليلتر من منتج PCR ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. فصل الخرز وشظايا من الحمض النووي من السائل المتبقية مع مغناطيس. أغسل حبات مرتين مع الإيثانول 70% قبل الشطف بيليه دون ريسوسبيندينج تماما.
    3. إزالة جميع الإيثانول مع ماصة ودع بيليه الهواء الجاف.
    4. حل بيليه في 15 – 20 ميليلتر ح2س بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وفصل الخرز من السائل باستخدام مغناطيس. نقل المادة طافية واضحة إلى أنبوب جديد.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، رد فعل يستند إلى عمود تنظيف مجموعات يمكن استخدامها.
  6. تحديد تركيزات الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي كما هو موضح في مكان آخر من29.

4-جيبسون الجمعية رد الفعل والتحول البكتيري

ملاحظة: الخطوات التالية مقتبسة من جيبسون et al. 30.

  1. إعداد جيبسون محلية صنع رد فعل مزيج أو استخدام أدوات استنساخ جيبسون تجارية.
    1. الجمع بين 3 مل من 1 "م تريس" (أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل))-HCl في درجة الحموضة 7.5، 300 ميليلتر مجكل م 1، 60 ميليلتر من دجتب 100 مم (ديوكسيجوانوسيني ثلاثي الفوسفات)، 60 ميليلتر من داتب 100 مم (ديوكسيادينوسيني ثلاثي الفوسفات)، 60 ميليلتر من دتتب 100 مم (ديوكسيثيميديني ثلاثي الفوسفات)، 60 ميليلتر (دكتب 100 مم ديوكسيسيتيديني ثلاثي الفوسفات)، ميليلتر 300 1 م DTT (ديثيوثريتول)، 1.5 غرام من شماعة-8000 (البولي إيثيلين جليكول)، 300 ميليلتر من 100 ملم NAD (نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide) وإضافة ح2س للحصول على مل 6 × 5 متحاور رد فعل المخزن المؤقت.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت الكوتيد في-20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا على الأقل.
    2. لسيد الجمعية جيبسون مزيج والجمع بين 320 ميليلتر من المخزن المؤقت لرد فعل متحاور x 5 ميليلتر 697 ح2س وإضافة 3 ميليلتر من 10 T5 يو/ميليلتر [ااكسونوكلس]، 20 ميليلتر من 2 يو/ميليلتر دنا بوليميريز وميليلتر 160 من 40 ش/ميليلتر بوليميراز الدنا ليجاسى.
      ملاحظة: هذا المزيج يمكن أن الكوتيد والمخزنة في-20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا على الأقل.
  2. استخدام ميليلتر 7.5 من الجمعية الرئيسية ميكس مع 2.5 ميليلتر من إدراج وناقلات الأمراض. لفعل x STAgR 2 استخدام ناقل مولى لإدراج نسبة بمول 1:1 ولكن ليس أكثر من 0.2 من الحمض النووي في المجموع. لأشرطة الكاسيت التعبير جرنة أكثر من 2، استخدام ناقل لإدراج نسبة 1:3 ولكن لا تتجاوز كمية الحمض النووي مجموع من 0.5 pmol.
    ملاحظة: ينبغي استخدام جميع أشرطة الكاسيت التعبير جرنة تضخيم المبالغ اكويمولار. إدراج عنصر تحكم بلازميد مع مقدار متطابقة لناقلات الأمراض ولكن لا إدراج لمراقبة ناقلات قالب عسر الهضم (و/أو ربط الذاتي).
  3. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لعينات مخزن 45 إلى 60 دقيقة على الجليد أو في-20 درجة مئوية للتحول اللاحقة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  4. مباشرة تحويل نصف المزيج في البكتيريا المختصة كيميائيا.
    1. ذوبان الجليد البكتيريا TOP10 كولاي كيميائيا المختصة على الجليد.
    2. إضافة 5 ميليلتر من مزيج جيبسون إلى 50 ميليلتر من البكتيريا المختصة. المزيج بلطف بالتحريك الجزء السفلي من الأنبوب. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. إجراء صدمة حرارة عن طريق وضع الأنبوب في حمام مائي 42 درجة مئوية أو كتلة حرارة ل 45 ثانية.
    4. وضع الأنابيب الجليد مرة أخرى. إضافة 250 ميليلتر من شركة نفط الجنوب متوسطة للبكتيريا والسماح لهم باستعادة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز لمدة 30 – 45 دقيقة.
  5. بعد الاسترداد، لوحة البكتيريا المحولة على 1.5% ليسوجيني مرق (رطل) أجار لوحات تتضمن الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

5-تحديد استنساخ ستأجر بمستعمرة بكتيرية بكر

  1. إعداد على الأقل مجموعتين من 200 ميليلتر بكر رد فعل أنابيب (بين 3 و 24) لكل بناء، التي تحمل اسم مطابق تماما.
  2. ملء مجموعة واحدة مع 100 ميليلتر رطل المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
  3. استخدام تلميح ماصة معقمة خدش المواد البيولوجية من مستعمرة بكتيرية واحدة وتنتشر في الجزء السفلي من الأنبوب تفاعل PCR 100 ميليلتر فارغة. نقل على الفور في التلميح إلى أنبوب رد فعل المناظرة الثانية التي تحتوي على المتوسط رطل.
  4. دوامة التلميح حول بلطف لضمان بعض البكتيريا يتم نقلها إلى وسائط الإعلام رطل واحتضان في 37 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
  5. قم بإعداد مزيج PCR رئيسي (10 ميليلتر كل رد فعل).
    1. 10 ردود الفعل، الجمع بين 10 ميليلتر بوليميراز العازلة، 2 دنتبس ملم 10 ميليلتر، 0.5 ميليلتر من التمهيدي (100 ميكرومتر)، 0.5 ميليلتر من [تق ] [بولمرس]، وإضافة ح2س حجم 100 ميليلتر.
    2. استخدام كبسولة تفجير التالية: StAgR_seq_fwd2: أكتجاتككجتاككاج، StAgR_seq_rev: تاكجتككتجككتتتج.
  6. إضافة 10 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسي لأنابيب تفاعل PCR المسمى دون وسائط رطل.
  7. احتضان ردود الفعل على ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: دورة 1 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 38 94 درجة مئوية لمدة 30 ق، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 1 دورة 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: ينبغي زيادة استطالة الوقت (الخطوة 72 درجة مئوية) مع العدد من أشرطة الكاسيت التعبير جرنة. حساب الحجم النظري لإدراج استخدام الجدول 2 ، واستخدم 1 دقيقة لكل 1 كيلوبايت عند 72 درجة مئوية.
  8. إضافة تحميل صبغ وتحليل الشظايا تضخيم على 1% [اغروس] هلام. تحميل سلم الحمض النووي مناسب للتحجيم (1 كيلو بايت سلم الحمض النووي) وتشغيل الجل المناسب في تشغيل المخزن المؤقت (مثلاً، TLE المخزن المؤقت) في 120 الخامس لمدة 30 دقيقة.
  9. حساب حجم النظرية أمبليكون مع المساعدة من الجدول 2 بإضافة أحجام الفردية من المروجين المستخدمة والسقالات جرنة وعدد من تسلسل N20. من نتائج هذه المستعمرة بكر، تحديد المستنسخين البكتيرية استناداً إلى حجم الفرقة الصحيحة، وما إذا كان من المرجح أن المرفأ ناقلات الصحيح.
  10. تلقيح ثقافة 2.5 مل بين عشية وضحاها رطل (مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين) مع ثقافة 100 ميليلتر المقابلة، أنشئت في وقت سابق. احتضان في 37 درجة مئوية ح 12.
  11. استخراج الحمض النووي بلازميد استخدام مجموعة مصغرة بلازميد تجارية و إرشادات الشركة المصنعة31.
  12. تسلسل والبلازميدات استخدام كبسولة تفجير التالية: StAgR_seq_fwd1 (جاجتاجججكججاكتاتج)، StAgR_seq_fwd2 (أكتجاتككجتاككاج) و StAgR_seq_rev (تاكجتككتجككتتتج) "التسلسل سانجر".

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد على البروتوكول في متناول اليد يجعل توليد مخصصة المتنوعة جرنة ناقلات ممكناً (الشكل 1). يصور الممثل نتائج النهج ستأجر باستخدام ستة أشرطة الكاسيت جرنة مختلفة في الشكل 2. الشكل 2 تبين نتيجة نموذجية من تقارير إتمام المشروعات المستخدمة للحصول على القطع ستأجر (بروتوكول 3.1-3.3). أمبليكونس ستة (BB, S1-S5) تمثل خطي قطع الحمض النووي يحتوي على تسلسل جرنة الفردية N20 على غاياتها. بلازميد العمود الفقري (بب) تم تمديده الآن مع تسلسل الاستهداف gRNA1 و gRNA6 وتمتلك ذلك التداخل المطلوب إلى اثنين آخرين تقارير إتمام المشروعات (S1 و S5) للجمعية جيبسون (الشكل 2ألف، الجدول 3). يمكن أن يتحقق بعد تنقية الحمض النووي عائد من على الأقل 1 ميكروغرام لناقلات وإدراج.

بعد الجمعية جيبسون، ينبغي أن يؤدي التحول البكتيري في المستعمرات البكتيرية 100 إلى 700. الشكل 2 ب تعرض تحليل ممثل للمستعمرات البكتيرية 10 عبر مستعمرة بكر، بعد بروتوكول ستأجر مع ستة جرنة الأشرطة. هلام التفريد يشير إلى أن استنساخ ثلاثة إظهار حجم amplicon المتوقعة للجمعية كامل (الجدول 2). أخرى استنساخ يرجح أن تلقي ستأجر المتجهات التي تحتوي على أشرطة الكاسيت جرنة واحد إلى خمسة، بينما استنساخ واحدة (الشكل 2ب، رقم 18) فارغ.

figure-results-1
الشكل 1 : لمحة عامة عن تصميم التمهيدي ستأجر. أول رقم جرنة والسقالات هي المختار، ثم أمر جرنة والمروج والأخير، وينبغي استخدام أي نوع من ناقلات الأمراض. لكل جرنا، صمم تمهيدي إلى الأمام محددة بجرنا استهداف التسلسل في اتجاه الشعور وأما الجزء المشترك من "صندوق إنقاذ الطفولة-تنظيم الأسرة" أو "سام-تنظيم الأسرة". وبالمثل، لتوليد التمهيدي عكس تسلسل منظم المقابلة الفردية (RP) هو تنصهر مع تكملة عكس التسلسل N20 من جرنة القادم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2 : الممثل نتائج النهج ستأجر باستخدام ستة أشرطة الكاسيت جرنة مختلفة- (أ) مثال الممثل بكر إدراج خمسة، فضلا عن ناقلات STAgR_Tomato. (ب) "مستعمرة [بكر" 6 س رد فعل ستأجر استخدام المروجين hU6 و mU6 وجرنة المتعارف عليه، فضلا عن السقالات سام. تم تحليل 22 المستعمرات البكتيرية، التي أظهرت 7 الفرقة المتوقعة تشير إلى اكتمال الجمعية. وسلم: 1 كيلوبايت زائد، وأرقام في قاعدة أزواج (bp). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التمهيدي إلى الأمام للسلسلة وناقلات
scaffold_fwdجتتتاجاجكتاجااتاجكاجت
SAM_fwdجتتتاجاجكتاجككاكاتجاج
عكس التمهيدي للسلسلة وناقلات
hU6_revكجتجتتكجتككتت
mU6_revكااكاجكتتتكتككاج
hH1_revكتججااجاجتجتكتكاتاكاجا
h7SK_revككجاجتاكككاجكج

الجدول 1: تسلسل التمهيدي للسقالات جرنة والمروجين.

أحجام من المروجين والسقالات.
hU6265 شركة بريتيش بتروليوم
hH1225 شركة بريتيش بتروليوم
mU6316 بي بي
h7SK245 bp
سقالة جرنة83 شركة بريتيش بتروليوم
ساملوب + جرنا سقالة143 شركة بريتيش بتروليوم

الجدول 2: أحجام النظرية لكل كاسيت تعبير لحساب نتائج PCR مستعمرة.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
جرنة Scf400 شركة بريتيش بتروليوم360 بي بي451 bp380 bp3722 bp4487 bp
سام460 bp420 بي بي511 شركة بريتيش بتروليوم440 bp--

الجدول 3: أحجام من المروجين والسقالات.

hU6hH1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
جرنا Scf368 bp328 شركة بريتيش بتروليوم419 bp348 bp+74 بي+67 بي
سام428 بي بي388 bp479 bp408 بي بي

الجدول 4: أحجام المحسوبة من القطع ستأجر بعد PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول مفصل ستأجر السماح بتوليد سريعة وبسيطة لجرنا التعبير والبلازميدات ذات أحجام مختلفة. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لتوليد خطوة واحدة من البلازميدات جرنة مع 2-8 جرنة التعبير من أشرطة الكاسيت (مع أو بدون الابتامرات رنا MS2 اثنين) إلى ناقل التعبير جرنة STAgR_Neo، واستخدام U6 البشرية والماوس U6، 7sK البشرية والبشرية H1 المروجين28 ،،من3233. إذا كان المرغوب فيها أكثر من أربعة أشرطة الكاسيت، يوصي باستخدام أنواع مختلفة المروج/سقالة اثنين على الأقل لزيادة الكفاءة. ناقلات أخرى والمروجين وتركيبات المروج، فضلا عن أكثر من 8 جرنة الأشرطة قد يكون ممكناً كذلك؛ ومع ذلك، وهذا لم يتم اختباره. على الرغم من أن تجربتنا يعمل الطريقة موثوق بها وتكاثر، لقد حددنا خطوات حاسمة واستكشاف الاستراتيجيات ينبغي أن النتيجة المتوقعة ليس على الفور تحدث. في تجربتنا، بعض الخطوات محورية لنجاح النهج: أولاً وقبل كل شيء، من المهم أن استخدام نسب المولى الصحيحة من إدراج لناقلات العمود الفقري في خطوة الجمعية جيبسون (3:1). ومع ذلك، فقد لاحظنا أن بعض مجموعات جرنة بنسبة 1:1 من إدراج لناقلات مفيد، حتى عندما يتجاوز عدد كاسيت جرنة اثنين. وثانيا، ينبغي أن تكون فترة رد فعل الجمعية جيبسون طويلة بما فيه الكفاية (على الأقل 45 دقيقة الموصى بها).

ويمكن توظيف ستأجر مع عدد كبير من التعديلات. استهداف متواليات، جرنة الأرقام والسقالات والمروجين وناقلات العمود الفقري يمكن تخصيصها وبحرية جنبا إلى جنب. ومع ذلك، قد يكون كل تركيبة متطلبات مختلفة قليلاً. في تجربتنا، إذا كانت متوسطة أو عالية أرقام الأشرطة جرنا (> 4) المطلوب ولكن لم يحصل فورا، عادة أسرع طريقة للتغلب على هذه المشكلة تغيير ترتيب الأشرطة الفردية جرنا في مكافحة ناقلات. وبالمثل، الجمع بين المروجين جرنة مختلفة والسقالات ويحسن كفاءة (ومما يخفض العدد المطلوب من مستعمرة تقارير إتمام المشروعات التي تحتوي على سجل) عندما يتم استنساخ العديد من أشرطة الكاسيت جرنة. ووجدنا أن الحيوانات المستنسخة غير صحيحة يتم إنشاؤها عادة بالاقتران العفوي من تسلسلات مكررة أثناء الجمعية جيبسون. على الرغم من أن هذا يمكن أن تقلل من كفاءة الأسلوب، هذه النتائج أيضا في توليد المتزامن للناقلة مع المجموعات الوظيفية جرنة28.

تم عن جيل من الإرسال المتعدد ناقلات جرنة التي تحتوي على أكثر من جرنة التعبير كاسيت مع عدد من أساليب مختلفة21،،من2223،24،25، ،من 2627. بينما بعض توظيف متزامنة أو متتابعة استنساخ جرنة أزواج22،34، الآخرين تعتمد على الجمعية البوابة الذهبية وعديدة متتابعة الاستنساخ الخطوات25،35. وقد استخدمت شيه et al.، نهجاً خاصا باستخدام نظام المعالجة الحمض الريبي النووي النقال الخلوية الذاتية قطع جرناس عدة من نص السلف واحد36. أدفانجيتاجي هذا الأسلوب هو شرط المروج واحد فقط؛ العيب هو الحاجة إلى شظايا المركبة حديثا من الحمض النووي لكل تركيبة جرنة. وقد جرنة كل الإرسال المتعدد الأسلوب مزايا وعيوب؛ ستأجر يجمع بين البساطة بكفاءة وعدد كبير من أشرطة الكاسيت جرنة ممكن بتكلفة منخفضة.

ستأجر (وغيرها من النظم المتنوعة) سيكون على الأرجح مفيداً في تمكين اختلال الكفاءة (والمتزامنة) متعددة الجينات في فيفو، كما كانت رائدة في الزرد أدمغة28. آخر التطبيق المستقبلي لناقلات المتنوعة جرنة هو الوعد للتلاعب بالبرامج النسخي كاملة خلافا للاستقراء أو قمع الجينات واحدة. المحتمل، سوف تسمح هذه النهج سيتم تحويل الخلايا والأجهزة في درجة أعلى بكثير مما ممكن في اليوم.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تود أن أشكر الأستاذ الدكتور ستيفان بيك والأستاذ الدكتور جوفيكا نينكوفيك على مدخلاتها، والمساعدة والدعم في تطوير أسلوب ستأجر. توبياس Klötzer وأنا Köferle باومان فالنتين التعليقات المفيدة. العمل الذي أيده DFG (STR 1385/1-1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion عالية الدقة DNA PolymeraseNEBM0530LPolymerase ل Gibson Master Mix بالإضافة إلى جميع PCRs
dNTPsLife TechnologyR0191dNTPs لجميع تفاعلات البوليميراز المتسلسل
dATPLife TechnologyR0141dNTPs ل Gibson Master Mix
dCTPLife TechnologyR0151dNTPs ل Gibson Master Mix
dGTPLife TechnologyR0161dNTPs لجيبسون ماستر ميكس
dTTPLife TechnologyR0171dNTPs ل Gibson Master Mix
AgaroseVWR443666A
DpnINEBR0176S
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881لتنظيف الحمض النووي
Tris HCLRoth9090.2ل Gibson Master Mix
DTTLife TechnologyR0861ل Gibson Master Mix
PEG 8000VWRRC- 077لشركة Gibson Master Mix
NADCayman Chemicals Company16077ل Gibson Master Mix
T5 ExonucleaseNEBM0363Sل Gibson Master Mix
Taq DNA LigaseNEBM0208Sل Gibson Master Mix
AmpicilinSigmaAldrichPHR1393-1G
DNA سلم 1 كيلو بايت بالإضافة إلىThermo ScientificSM0311
Plasmid Mini KitThermo ScientificK0503
Plasmid and Primer Sequenceجميع التسلسلات المتوفرة في Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTAPanReacAppliChem6381-92-6ل TLE Buffer
MgCl2< / sub>SigmaAldrichM8266ل Gibson Master Mix
Top10 بكتيريا مختصة كيميائياThermo ScientificC404003
S.O.C. خميرة15544034علمية حرارية
متوسطة - مستخلصSigmaAldrichY1625ل مرق ليزوجينيك (LB Media) NaCl
SigmaAldrichS7653لمرق الليزوجين (LB Media)
PeptoneSigmaAldrich91249لمرق الليزوجين (LB Media)
Agar-AgarSigmaAldrich5040لمرق الليزوجين (LB Media)
Taq DNA PolymeraseQuiagen201203

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247(2015).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
  5. Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59(2015).
  6. Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  9. Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).
  10. Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918(2016).
  11. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  12. Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517(2015).
  13. Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).
  14. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  15. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  16. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  19. Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
  20. Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
  21. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  22. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  23. Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
  24. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  25. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).
  26. Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
  27. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  28. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).
  29. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
  30. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  31. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).
  32. Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).
  33. Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).
  34. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  35. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400(2014).
  36. Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

String Assembly gRNA CloningMultiplex gRNA ExpressionGibson AssemblyCRISPR Cas9 SystemGuide RNA CloningDNA Template ReuseOverhang PrimersColony PCRPlasmid TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles