مقالة منهجية

توسيع نطاق ماتس نانوفيبير اليكتروسبون بعد يومين إلى ثلاثة-البعد السقالات

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا المقالة التقنية لتوسيع حصيرة نانوفيبير اليكتروسبون (2D) التقليدية، والبعد الثاني في سقالة (3D) 3-بعد عن طريق تنفيسها السائل2 CO دون الحرجة. هذه السقالات زيادة 3D، الرموز نانوتوبوجرافيك الخلوية تقليد عن كثب، والحفاظ على وظائف الجزيئات البيولوجية مغلفة داخل النانو.

الملخص

وقد اليكتروسبينينج هذه التكنولوجيا المفضلة في إنتاج سقالة الاصطناعية، والوظيفية بسبب بيوميميكري للمصفوفة خارج الخلية وسهولة السيطرة على تكوين وهيكل، وقطرها من الألياف. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا، نانوفيبير اليكتروسبون التقليدية السقالات تأتي مع القيود بما في ذلك مشوش المسامية منخفضة وحجم المسام الصغيرة، التوجه نانوفيبير والحصير أساسا ثنائي الأبعاد. على هذا النحو، هناك حاجة ماسة لتطوير عملية جديدة لاختلاق السقالات نانوفيبير اليكتروسبون أنه يمكن التغلب على القيود المذكورة أعلاه. ويرد هنا، طريقة مبتكرة وبسيطة. حصيرة نانوفيبير 2D تقليدية تتحول سقالة 3D مع سمك المرجوة ومسافة الفجوة، المسامية والعظة نانوتوبوجرافيك للسماح للخلية البذر والانتشار من خلال تنفيسها السائل2 CO دون الحرجة. بالإضافة إلى توفير سقالة لتجديد الأنسجة تحدث، يوفر هذا الأسلوب أيضا الفرصة لتغليف الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل الببتيدات المضادة للميكروبات لإيصال الأدوية المحلية. السقالات nanofiber2 توسع شركة إمكانات كبيرة في تجديد الأنسجة والتئام الجروح والأنسجة 3D النمذجة وإيصال الأدوية الموضعية.

المقدمة

مفهوم تطوير سقالة اصطناعية التي يمكن زرعها في المرضى للمساعدة في إصلاح الأنسجة والتجديد هو الذي قد ساد ميدان الطب التجديدي لعدة عقود. سقالة اصطناعية مثاليا يخدم للحث على الهجرة الخلية من الأنسجة السليمة المحيطة، ويوفر بنية للخلية البذر والالتصاق وإشارات، وانتشار والتمايز، تدعم الأوعية الدموية، يسمح للأوكسجين الكافي و إيصال التغذية، ويعزز النشاط المناعي المضيفة لضمان نجاح بعد غرس1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه كناقل لتضمين الجزيئات المضادة للميكروبات لمساعدة في الجرح الشفاء1،3،،من67،،من89. القدرة على التحكم في إطلاق هذه الجزيئات البيولوجية الزمانية من سقالة اصطناعية هي سمة مرغوب فيه آخر أن يعتبر عندما السقالات الهندسة1.

وقد تم اليكتروسبينينج تقنية استخداماً جيدا لإنتاج السقالات نانوفيبير1،3،2،4،،من56. وأجريت محاولات سابقة لإنشاء سقالة نانوفيبير مثل تلك التي تمت مناقشتها هنا بدرجات متفاوتة من النجاح. ومع ذلك، محدودة السقالات nanofiber التقليدية قدرات لتحقيق هذه الأهداف. وقد السقالات nanofiber التقليدية معظمهم الحصير ثنائي الأبعاد1،3. هذه السقالات نونيكسبانديد هي المزدحمة مع أحجام المسام الصغيرة؛ وهذا يحصر تسلل خلية، والهجرة، والتمايز كما أنها لا تعزز بيئة ما يكفي من مشابهة لتلك الموجودة في فيفو8،7،،من19. ولهذا السبب، تم إنشاء أحدث تقنيات إعداد السقالة نانوفيبير اليكتروسبون 3D لتعديل العيوب المتأصلة التي تأتي مع ماتس نانوفيبير 2D. تؤدي هذه التقنيات في السقالات 3D؛ ومع ذلك، محدودة الانطباق بسبب أساليب الإنتاج التي تتطلب المحاليل وإجراءات التجميد. نتائج هذه المعالجة في التوزيع العشوائي للنانو دون المنظمة مقيدة، سمك مناسب، و/أو المسامية المطلوب تقديم العظة نانوتوبوجرافيك الكافية اللازمة للهجرة الخلية وانتشار. هذه العوامل تؤدي السقالات نانوفيبير اليكتروسبون 3D السابقة التي تفتقر إلى تقليد الكافية للمعيشة الأنسجة1،7،،من89.

تم إجراء محاولات أكثر حداثة في تطوير سقالة الموسعة، 3D مع بيوميميكري أفضل من المصفوفة خارج الخلية (ECM) استخدام إجراء معالجة حل بورهيدريد (نأبه4) صوديوم مائية والقوالب المصممة مسبقاً للمساعدة في مراقبة أفضل شكل الناتج عن سقالة7،8. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير مثالية حيث أنها تتطلب استخدام المحاليل والتفاعلات الكيميائية، والتجميد التي قد تتداخل مع البوليمرات وأي الجزيئات الحيوية المغلفة التي للذوبان في الماء. الإضافات المستخدمة قد يسبب أيضا تأثيرات جانبية خلال الأنسجة التجدد8،9. CO2 التوسع في الأسلوب المبين في هذه المادة إلى حد كبير يقلل من الوقت اللازم للتجهيز ويلغي الحاجة للمحاليل، ويحافظ على المبلغ ووظيفة الجزيئات النشطة بيولوجيا بقدر أكبر مما السابق 9من الأساليب المتبعة.

في الدراسات السابقة والمضادات الحيوية، والفضة، 1α، 25 ديهيدروكسيفيتامين د3ومضادات الميكروبات الببتيد ليرة لبنانية-37 تم تحميلها في السقالات nanofiber منفردة ومجتمعة لإمكانات هذه السقالات للإفراج عن وكلاء للتحقيق زيادة المعونة في الجرح الشفاء9،10،،من1213. غرض إثبات هذا الأسلوب لتوسيع سقالة nanofiber، سيتم تحميل كومارن 6، صبغة فلورسنت، في سقالة تثبت إمكانية تضمين السقالة مع مختلف المركبات المطلوبة. هذا الأسلوب من تلفيق سقالة nanofiber الموسعة بالاقتران مع الجزيئات النشطة بيولوجيا مغلفة يحمل إمكانيات كبيرة لتجديد الأنسجة والتئام الجروح، وإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد من الأنسجة وإيصال الأدوية الموضعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كافة في فيفو الإجراءات المبينة أدناه بموافقة "اللجنة إياكوك" في المركز الطبي في جامعة نبراسكا.

1. إعداد الحلول لمعيار اليكتروسبينينج

  1. في أنبوب زجاج 20 مل، حل ز 2 من poly(ε-caprolactone) (PCL، Mw = كاتشين 80) في خليط المذيبات من الميثان (DCM) و N، N-dimethylformamide (DMF) بحصة 4:1 (v/v) بتركيز 10% (w/v).
    تنبيه: مقبض DCM و DMF في غطاء جيد التهوية لتجنب التعرض للأبخرة. لا تعرض DCM للمواد البلاستيكية.
  2. ضع أنبوب الزجاج إلى دوار مختبر حتى يصبح الحل واضح. الحل قد خلط بين عشية وضحاها.
  3. إذا كانت تنوي تضمين المواد النشطة بيولوجيا مثل الببتيدات أو المخدرات إلى السقالة، إنشاء حل منفصل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
    1. تحضير صبغة الفلورسنت الحل (50 ملغم/مل) باستخدام 20 مل من محلول PCL.

2. قم بإعداد الجهاز اليكتروسبينينج (الشكل 1A)

  1. إضافة حل PCL إلى 20 مل حقنه بإبرة حادة قياس 21 يعلق. تأكد من أنه لا يوجد أي هواء في الحقن والأنابيب المرتبطة بها.
  2. وضع اسطوانة الصلب الدورية مع الأرض وجامع 12 سم من طرف الإبرة.
  3. استخدام مقاطع التمساح، توصيل إمدادات الطاقة "عالية الجهد التيار المباشر" (DC) بالإبرة والتأكد من أن يستند إلى جامع.
    تنبيه: إيقاف دائماً في التيار الكهربائي قبل التعامل مع أي مواد متصلة.

3-اليكتروسبينينج

  1. لمل 20 من حل PCL، تعيين معلمات مضخة الحقن على النحو التالي: القطر = 20.27 مم، معدل التدفق = 0.5 مل/حاء الاختيار إذا هي تشكيل القطرات في غيض الإبرة.
  2. إذا كان المطلوب هو إدماج الجزيئات النشطة بيولوجيا، قم بإعداد الجهاز للسماح اليكتروسبينينج co-المحوري (الشكل 1B). إنشاء فوهة محوري مخصصة باستخدام الإبر إبر.
    ملاحظة: هذه الفتحات أيضا متاح تجارياً. علما بأن حل لصبغ مستعدة لمحاكاة إضافة مثل هذه الجزيئات.
    1. تعد حلاً 1% من صبغة الفلورسنت 6 الكومارين في المياه. أضف 3 مل الصبغة 1% للمحاقن صغيرة. قم بتوصيل المحاقن فوهة متحد المحور نفسه كحل PCL. مرة أخرى، تأكد أن هناك لا فقاعات الهواء.
    2. لهذا الحل 3 مل، تعيين معلمات مضخة الحقن على النحو التالي: القطر = 9.49 مم، معدل التدفق = 0.02 مل/حاء الاختيار إذا هي تشكيل القطرات في غيض الإبرة.
  3. تطبيق الجهد الكهربائي من 20 كيلوفولت بين مغزال (22-قياس الإبرة) وجامع أرض يقع 20 سم بعيداً عن مغزال. جمع الحصير nanofiber المنحازة في اسطوانة دوارة 2,000 لفة في الدقيقة. جمع الحصير nanofiber PCL بمجرد أن تصل إلى سمك ~ 1 ملم.

4-توليد PCL Nanofiber الحصير مع ثقوب صفت.

  1. اختﻻق ماتس nanofiber PCL.
    1. حل الخرز PCL في خليط المذيبات يتكون DCM و DMF بنسبة 4:1(v/v) بتركيز 10% (PCL) (w/v). مضخة الحل PCL بمعدل تدفق 0.7 مل/ساعة باستخدام مضخة الحقن بينما محتملة 20 كيلوفولت ويطبق بين مغزال (إبرة غيج 22) وجامع أسس الموقع 12 سم وبصرف النظر عن مغزال.
    2. جمع الغشاء nanofiber استخدام طبل الدورية مع الدورية بسرعة أكبر من 500 لفة في الدقيقة.
  2. تزج ماتس nanofiber PCL في سائل ن2 لمدة 5 دقائق (أي.، تصبح قاسية). الاحتفاظ الحصير nanofiber PCL في سائل ن2 ولكمه ماتس nanofiber PCL مع 0.5 مم لكمه.

5-التوسع في 2D Nanofiber الحصير مع أو بدون ثقوب صفت عبر شركة الحرجة2 السائل (الشكل 2).

  1. مكان ماتس nanofiber PCL في النتروجين السائل لمدة 5 دقائق ومقطعة مربعات 1 سم × 1 سم استخدام مقص جراحي حاد بينما أغرقت في النتروجين السائل لتجنب تشوه الحواف.
  2. وضع حصيرة قطع في أنبوب الطرد مركزي 30 مل مع ~ 1 g ثلج الجاف. محكم الغطاء الغطاء والسماح للجليد الجاف لتغيير إلى السائل CO2.
  3. مرة واحدة وقد شكلت السائل في الأنبوب، بسرعة الإفراج عن الضغط عن طريق فتح الغطاء.
    تحذير: استخدام معدات الوقاية الحرارية المناسبة عند العمل باستخدام النتروجين السائل والثلج الجاف. لا تقم بفتح أنبوب الضغط نحو الوجه. لا ينبغي أن تستخدم أنبوب الطرد المركزي مرارا وتكرارا.
  4. إزالة ومراقبة سقالة ينفخ من الأنبوب. ضع السقالة في أنبوب الطرد مركزي جديدة مع الثلج الجاف، وكرر حتى يتم تحقيق السمك المطلوب. تعقيم السقالات nanofiber الموسعة في أكسيد الإيثيلين قبل الحضانة مع الخلايا.

6-توصيف السقالات Nanofiber الموسعة

  1. تميز في مورفولوجيا وهيكل السقالات nanofiber الموسعة باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM).
    1. وضع العينات مع الشريط موصلة على الوجهين بمسمار معدني ومعطف مع البلاتين 40 s استخدام المغطى الرش في 40 اماه.
    2. دراسة الألياف باستخدام SEM وفقا للدراسات السابقة9. جمع الصور في جهد متسارع من 15 كيلو فولت.
  2. تميز في المختبر الإفراج عن التشكيلات الجانبية وبيواكتيفيتي من الببتيدات المفرج عنهم.
    1. الوزن 10 ملغ nanofiber الأغشية قبل وبعد التوسع في CO2.
    2. تزج العينات في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني وجمع 10 ميكروليتر من المادة طافية في نقاط زمنية مختلفة (0-28 يوما).
    3. استخدام أدوات المقايسة المناعية مسيل Enzyme-Linked (ELISA) لقياس تركيز الببتيد ليرة لبنانية-37 في جمع المادة طافية.
  3. دراسة استجابة تسلل الخلوية في فيفو والمضيف.
    1. وضع الفئران سبراغ داولي (SD) 9-الأسبوع القديمة في تشكيل غرفة تخدير والاتصال بالبخار إيسوفلوراني وتخدير الفئران. نقل الفئران إلى جدول تشغيل بعد أن أصبحت الفئران التخدير الكامل دون مشاعر. تخدير باستمرار على الفئران باستخدام مخروط آنف isoflurane مع المبخر أثناء الجراحة. حلاقة شعر ظهورهم في الفئران بماكينة الحلاقة الحيوان وتعقيم أنه مع اليود والكحول فرك الجلد. إنشاء جيوب تحت الجلد عبر شقوق 1.5 سم في مواقع سوبراسبينال على دورسوم استخدام مشرط.
    2. إدراج واحد nanofiber الموسعة سقالة (1.5 مم سميكة) في جيب تحت الجلد باستخدام الملقط لكل شق. إغلاق شق استخدام دباسة.
    3. 1، 2، و 4 أسابيع، euthanize على الفئران مع أول أكسيد الكربون 95%2. تشريح بلطف explant والأنسجة المحيطة باستخدام مقص جراحي. قبل التحليل النسيجي، تزج الأنسجة في الفورمالين لمدة 3 أيام على الأقل، ومن ثم تضمين مع البارافين. قسم الأنسجة مع مبضع، ثم أداء ويوزين (H & E)، وتوضع ماسون لتلطيخ trichrome.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الفعالية من توسيع ماتس نانوفيبير اليكتروسبون 2D التقليدية إلى السقالات 3D عبر تنفيسها السائل2 CO الحرجة قد تجلى بصفات مختلفة: زيادة سمك السقالات من 1 ملم عند دون علاج إلى 2.5 ملم و 19.2 مم مع واحد واثنين من العلاجات2 CO، على التوالي (الشكل 3 ألف-ج). خاصية المسامية بنية حاسمة بالنسبة للخلية البذر-زادت أيضا بطريقة المقابلة لزيادة سمك (الشكل 3). مسامية السقالات زاد من نسبة 79.5 في المائة الحصير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحويل ماتس نانوفيبير اليكتروسبون 2D التقليدية إلى السقالات 3D الموسعة تم التحقيق فيها عن طريق شركة تنفيسها2 . ماتس نانوفيبير 2D التقليدية هي الموسعة بنجاح عن طريق السوائل2 CO دون الحرجة. الخطوات الحاسمة هي اختﻻق ماتس نانوفيبير 2D تحت شرط أمثل وقطع الحصير دون تشويه الحواف (على سبيل المثال-، باستخدام حادة مقص جراحي). هذا CO2-السقالات nanofiber موسع لها فوائد عديدة على حصائر 2D التقليدية بما في ذلك هياكل الطبقات (الشكل 3 ألف-ب<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بالمنح من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) في المعاهد الوطنية للصحة (2 ف 20 GM103480/06 و 1R01GM123081 إلى J.X.)، الأموال أوتيس غليب مؤسسة البحوث الطبية، LB606 ني، وبدء التشغيل من جامعة نبراسكا الطبي مركز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي كابرولاكتونسيجما ألدريتش440744
N ، N-DimethlyformamideFisher ChemicalD-199-1
ثنائي كلورو ميثانفيشر كيميكالAC61093-1000
Coumarin 6Sigma-Aldrich546283
أسطوانة فولاذية دوارةمخصصةيعمل هذا كجامع أثناء الغزل الكهربائي.
مضخة حقنةفيشر Scientific14-831-200يتطلب الغزل المحوري مضختين أحاديتين للحقنة.
RevolverLab Net InternationalH5600مختبر دوار قابل للتعديل لخلط المحاليل
إبرة تحت الجلد (27 جم × 1 1/2 بوصة)EXCELINT International Co26426هذا جزء من المثال المخصص للعقدة المحورية الموضحة.
إبرة تحت الجلد (21 جم × 1 1/2 بوصة)EXCELINT International Co26416هذا جزء من المثال المخصص للعقدة المحورية الموضحة.
مزود طاقة تيار مستمر عالي الجهدجاما أبحاث الجهدالعالي ES30
مجهر إلكترونيماسح FEINova 2300
مجهر مضانZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

المراجع

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة