مقالة منهجية

تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير

DOI:

10.3791/59652

⸱

مايو 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Design Center, Boston University, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Boston University, 4Department of Bioengineering, Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح اطار ايفولفير للثقافة الميكروبية المستمرة عاليه الانتاجيه بدقه عاليه وتحكم ديناميكي علي المعلمات التجريبية. يوضح هذا البروتوكول كيفيه تطبيق النظام لاجراء تجربه اللياقة البدنية المعقدة ، وتوجيه المستخدمين علي برمجه التحكم الألى علي العديد من الثقافات الفردية ، وقياس ، وجمع ، والتفاعل مع البيانات التجريبية في الوقت الحقيقي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمكن أساليب الاستزراع المستمر الخلايا من النمو في ظل الظروف البيئية المضبوطة كميا ، التالي فهي مفيده علي نطاق واسع لقياس الأنماط الظاهرية للياقة البدنية وتحسين فهمنا لكيفيه تشكيل الأنماط الجينية عن طريق الاختيار. وقد كشفت الجهود المكثفة التي بذلت مؤخرا لتطوير وتطبيق أجهزه الثقافة المستمرة المتخصصة فوائد اجراء اشكال جديده من السيطرة علي ثقافة الخلية. ويشمل ذلك تعريف ضغوط الاختيار المخصصة وزيادة الانتاجيه للدراسات التي تتراوح من التطور التجريبي الطويل الأجل إلى اختيارات المكتبة علي نطاق الجينوم وتوصيف الدوائر الجينية التركيبية. تم تطوير منصة ايفولفير مؤخرا لتلبيه هذا الطلب المتزايد: منصة الثقافة المستمرة مع درجه عاليه من القابلية للتوسع ، والمرونة ، والاتمته. يوفر ايفولفير منصة موحده واحده يمكن ان تكون (أعاده)-تكوينها وتحجيمها مع الحد الأدنى من الجهد لأداء العديد من أنواع مختلفه من التجارب العالية الانتاجيه أو متعددة الابعاد الاختيار النمو. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتزويد مستخدمي اطار ايفولفير وصفا لتكوين النظام لاجراء تجربه النمو المستمر علي نطاق واسع العرف. وعلي وجه التحديد ، فان البروتوكول يرشد المستخدمين حول كيفيه برمجه النظام لتعدد ضغطين الاختيار-درجه الحرارة و الاسموليه-عبر العديد من قوارير ايفولفير من أجل تحديد المناظر الطبيعية اللياقة البدنية من المسوخ سيرميميسسيس سيريفيسياي في غرامه القرار. ونعرض كيف يمكن تكوين الجهاز برمجيا ، من خلال برامجه المفتوحة المصدر علي شبكه الإنترنت ، وفعليا ، عن طريق ترتيب التخطيطات الفلورية والاجهزه. عمليه اعداد الجهاز ماديا ، وبرمجه روتين الثقافة ، والرصد والتفاعل مع التجربة في الوقت الحقيقي عبر الإنترنت ، وقنينات أخذ العينات للتحليل اللاحقة دون اتصال ، وتحليل بيانات التجربة بعد ذلك مفصله. وهذا ينبغي ان يكون بمثابه نقطه انطلاق للباحثين عبر مختلف التخصصات لتطبيق ايفولفير في تصميم الخاصة بهم معقده وعاليه الانتاجيه تجارب نمو الخلايا لدراسة والتلاعب النظم البيولوجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات الخلية المستمرة الثقافة ، وضعت لأول مره تقريبا 70 منذ1،2، وتتمتع احياء الاخيره3،4. ويرجع ذلك إلى التقاء العوامل. أولا ، ان تطوير تقنيات إنتاجيه عاليه ، والتي جعلت من الممكن قراءه وتوليد اعداد كبيره من الأنماط الجينية5،6، خلقت الطلب المصاحب للتقنيات التجريبية التي تسهل نمو الخلايا التي تسيطر عليها جيدا والتنميط الظاهري. وتحقيقا لهذه الغاية ، تمثل الثقافة المستمرة نهجا تجريبيا قويا للاستفادة من التقدم الجيني الناشئ. من خلال تسهيل اختيارات النمو/التجارب علي السكان الخلويين في الظروف البيئية التي تسيطر عليها بدقه (وديناميكية) ، توفر الثقافة المستمرة وسيله لتحديد الأنماط الجينية بدقه إلى الأنماط الظاهرية7،8، وصف كميات السلالات المهندسة والكائنات9، وتتبع التغيرات الوراثية التكيفيه في دراسات تطور المختبرات10،11،12.

وثانيا ، مكن ظهور تقنيات النماذج الاوليه التي يمكن الوصول اليها مؤخرا ، مثل التصنيع المضاف وعناصر الاجهزه والبرمجيات المفتوحة المصدر ، مجموعه أوسع من المستخدمين من تصميم وبناء اشكال النظم الثقافية المستمرة الخاصة بهم والفعالة من حيث التكلفة مباشره في المختبر. وقد ادي كل هذا إلى مجموعه مثيره من تفعل ذلك بنفسك (DIY) الاجهزه التي تؤدي وظائف الثقافة المستمرة ، مثل chemostat13، turbidostat14، أو morbidostat15. ومن المؤسف ان هذه الحلول المخصصة ، رغم نجاحها في معالجه المشاكل المحددة (المتخصصة) التي صممت من أجلها ، تفتقر عموما إلى القدرة علي التوسع في الانتاجيه و/أو تعقيد التصميم التجريبي.

تم تصميم نظام ايفولفير بهدف إنشاء منصة واحده يمكنها استيعاب الاحتياجات التجريبية المتزايدة للثقافة المستمرة ومطابقه سرعه ونطاق التقنيات الجينية الناشئة16 (الشكل 1a). ويطبق تصميم ايفولفير المبادئ المشتركة الكامنة وراء التكنولوجيات القابلة للتطوير العالي من التخصصات الأخرى17، بما في ذلك بصمات الاقدام الموحدة والمكونات المعيارية ومبادئ التصميم المفتوح المصدر. التالي ، يمكن تصميم حلول للتطبيقات المتخصصة الجديدة دون إدخال تعديلات رئيسيه علي النظام. تتالف من وحدات عاليه ومفتوحة المصدر wetware ، والاجهزه ، والكترونيات ، والبرمجيات علي شبكه الإنترنت ، ايفولفير هو أول نظام الثقافة المستمر الألى التي يمكن ان تكون فعاله من حيث التكلفة وبسهوله أعاده تكوينها لتنفيذ اي نوع تقريبا من تجربه نمو عاليه الانتاجيه. من خلال الأكمام الذكية وحدات وبرمجه التي منزل جميع أجهزه الاستشعار والمحركات اللازمة للسيطرة علي الثقافات الفردية ، ايفولفير تمكن بشكل فريد من التوسع في كل من الانتاجيه والسيطرة الفردية للظروف الثقافية. وعلاوة علي ذلك ، وكمنصة علي شبكه الإنترنت ، تتبادل ايفولفير البيانات والمعلومات مع أجهزه الكمبيوتر البعيدة في الوقت الحقيقي ، مما يسمح بالرصد المتزامن لمئات الثقافات الفردية والاضطرابات الثقافية المؤتمتة من خلال السيطرة المحددة تعسفا خوارزميات.

في العمل السابق16, وقد تجلي أداء ايفولفير قويه في التجارب طويلة الأجل علي مدي مئات الساعات من العمل, وقدرته علي زراعه الكائنات الحية المختلفة, من e. كولاي و s. سيريفيسياي إلى غير المستانسه الميكروبات. وأجريت سلسله من التجارب المتميزة لاختيار النمو ، حيث طبقت تدرجات الاختيار المتعددة الابعاد المحددة برمجيا عبر مجموعه من الظروف الثقافية الفردية وكانت المناظر الطبيعية للياقة الخلوية الناتجة كميا. هنا ، والهدف هو تزويد المستخدمين ايفولفير مع وصفا لكيفيه استخدام النظام لتصميم وهذه الأنواع من التجارب. وكمثال توضيحي ، يتم تقديم طرق القياس الكمي للمشهد اللياقة البدنية من المسوخ s. سيريفيسياي عبر التدرج البيئي ثنائي الابعاد تتالف من درجه الحرارة والإجهاد الاسموزي. البروتوكول يرشد المستخدمين من خلال تكوين اطار ايفولفير لهذه التجربة علي حد سواء برمجيا ، في استخدام البرنامج لتعيين التعكر المخصصة وإجراءات التحكم في درجه الحرارة لكل من 16 الثقافات المستمرة موازيه ، وجسديا ، من خلال تخطيط فلويديكس لتوجيه الوسائط بشكل مناسب من تركيزات الملح المختلفة. وينبغي ان يكون هذا البروتوكول بمثابه قاعده عامه لتكوين ايفولفير لتنفيذ مجموعه واسعه من التجارب الثقافية المستمرة الألى للدراسات والتخصصات المتنوعة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد وسائل الاعلام ، قوارير ، والانسام

ملاحظه: يفترض هذا البروتوكول ان المستخدمين قاموا بالفعل بمعايره نظام ايفولفير ويستخدمون تكوين الكم الذكي الموصوف في العمل السابق16. الأكمام الذكية بسهوله أعاده تصميم أو تعديل ، ولكن تفاصيل الاعداد من حجم والتحكم المعلمات قد تختلف لتكوينات بديله.

  1. في اليوم السابق للتجربة ، واعداد 2 مل الثقافات السائلة بين عشيه وضحيها من s. سيريفيسياي BY4741 سلاله المرجعية وسلالات البديل في وسائل الاعلام ypd (الخميرة peptone سكر العنب) في 30 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز تعيين إلى ما لا يقل عن 300 r.p.m.
  2. نقل وسائل الاعلام العقيمة YPD إلى نظيفه ، وزجاجات معقمه مزوده بالأنابيب. وبدلا من ذلك ، يمكن تعقيم وسائل الاعلام مباشره في زجاجات مزوده مسبقا بالأنابيب.
    ملاحظه: زجاجات تناسب مع الأنابيب عن طريق حفر ثقب في الغطاء وتشغيل الأنابيب من خلال ذلك مع موصلات لتامينه في مكان. انظر جدول المواد.
  3. أضافه شريط تحريك لكل قارورة والمسمار علي غطاء قارورة مجهزه تدفق والقش افلوكس. تاكد من ان جميع المكونات نظيفه عن طريق الفحص البصري.
  4. وضع قوارير في رف معقم ، وتغطي مع إحباط ، والاوتوكلاف علي الجاذبية أو دوره فراغ مع خطوه التعقيم 20 دقيقه.

2. اعداد تجربه

  1. في ثلاثه أكواب كبيره ، واعداد 500 مل من التبييض 10 ٪ ، 200 مل من 10 ٪ التبييض ، و 300 mL من الايثانول 70 ٪.
  2. باستخدام رموز التبديل علي الجهاز ايفولفير ، بدوره علي إمدادات الطاقة 5 فولت علي ايفولفير ، والانتظار لمده 5 ليالي ، ثم بدوره علي إمدادات الطاقة 12 فولت.
  3. إذا كان تشغيل عده قوارير من نفس زجاجه الوسائط ، وربط عده خطوط الإدخال وسائل الاعلام مع الأنابيب الشريحة. ويمكن بناء الأنابيب المخصصة الشريحة مع مكونات Luer.
  4. دمج خطوط إدخال الوسائط في دورق التبييض الأول ، وخطوط الوسائط افلوكس في الكاس التبييض الثاني. وضع نهاية المصب من خطوط الإدخال وسائل الاعلام في الكاس الثاني مع خطوط افلوكس. وضع خطوط النفايات في carboy النفايات.
  5. أضافه 1-2 L من التبييض إلى كبيره فارغه النفايات carboy ، والتي سوف تعقيم النفايات المتولدة اثناء التجربة. التشاور مع منسق السلامة لضمان التخلص السليم من النفايات.
  6. باستخدام شاشه اللمس علي ايفولفير ، انتقل إلى قسم الاعداد ، وقم بتشغيل جميع المضخات لمده 20 ثانيه لتعبئة خطوط السوائل مع التبييض بنسبه 10%. اثناء التشغيل ، تاكد من خلال الفحص البصري ان جميع الخطوط قد تم ملؤها وان المضخات تعمل بشكل طبيعي. السماح التبييض للجلوس في خطوط لمده 30 دقيقه علي الأقل لتعقيم.
  7. تشغيل مضخات مره أخرى باستخدام التطبيق تعمل باللمس حتى لم تعد الخطوط المغمورة ، ودفع الهواء من خلال خطوط للحصول علي أكبر قدر ممكن من التبييض.
  8. وضع خطوط الإدخال وسائل الاعلام في الكاس الايثانول وتكرار كما في أعلاه ، وملء الخطوط مع الايثانول وبيغ مع الهواء.
    ملاحظه: كما يقتل الايثانول بسرعة ، ليست هناك حاجه للانتظار 30 دقيقه للتعقيم.
  9. قم بتوصيل خطوط إدخال الوسائط إلى زجاجات الوسائط مع موصلات Luer وتشغيل المضخات حتى يتم تشغيل الوسائط بالبالكامل من خلال الخطوط ، ومسح اي الايثانول المتبقي.
  10. ادراج جزئيا قوارير معقمه في الأكمام الذكية ايفولفير وربط الخطوط إلى المواقف المناسبة ، وفقا للون الترميز علي خطوط. تبدا من خلال ربط خطوط الإدخال إلى القش تدفق قصيرة ، ومن ثم النفايات خطوط إلى القش افلوكس طويلة.
    تحذير: من الضروري التحقق من الاتصالات الفضفاضة أو الخطوط الموجهة بشكل غير صحيح. سيؤدي الفشل في القيام بذلك إلى تجاوز التدفقات واحتمال تلف الأكمام الذكية.
  11. تشغيل جميع مضخات في 10 s زيادات لملء قوارير مع وسائل الاعلام. ضمان بواسطة مضخات افلوكس التفتيش البصرية بكفاءة أزاله وسائل الاعلام من خلال القش افلوكس ، لمنع التدفقات الزائدة. وإذا لم تظهر القشات التي تعمل بكفاءة ، فافحص الوصلات الخطية المميعة والمضخة التمعجيه. تصحيح أو استبدال الأجزاء حسب الحاجة.
  12. ادفع القارورات للأسفل حتى تغلف بالبالكامل بواسطة الأكمام الذكية.
  13. قم بتعيين الشروط الاوليه للمعلمات التجريبية باستخدام شاشه اللمس ايفولفير في صفحه الاعداد التفاعلية. لجميع قوارير ، تعيين درجه الحرارة إلى 30 درجه مئوية وأثاره إلى 10. ويمكن القيام بذلك لجميع القوارير في وقت واحد عن طريق سحب اصبع عبر شاشه اللمس لتحديد جميع القنينات.

3. تكوين البرامج والبرمجة الروتينية للثقافة اللوغاريتمية

  1. في لوحه معلومات ايفولفير علي جهاز كمبيوتر ، انتقل إلى صفحه مدير التجربة. حدد التجربة الاساسيه في لوحه متصفح التجربة أو تجربه موجودة كنقطه بداية وانقر علي استنساخ جديد.
    ملاحظه: من الممكن استخدام التجارب من المجموعات الأخرى عن طريق لصق الرابط جيثب إلى الريبو حيث يتم حفظ التعريف التجريبي في مدير التجربة.
  2. حدد اسم التجربة وجهاز ايفولفير الذي سيتم تشغيل التجربة عليه. تاكد من تحديد إعدادات المعايرة المطلوبة عن طريق تعديل هذه الحقول علي الصفحة.
  3. استخدام محدد القنينة وأجزاء تعريف المعلمة لتعيين الظروف التجريبية. علي سبيل المثال ، لتعيين درجه الحرارة لقوارير 0-4 إلى 30 درجه مئوية ، حدد القنينات في محدد القنينة ، قم بتعيين تعريف المعلمة إلى 30 ، ثم انقر فوق set. كرر هذا ل OD لتعيين عتبه العلوي والسفلي لكل قنينة.
  4. بعد اكتمال تعريفات المعلمات التجريبية ، احفظ التجربة بالنقر فوق حفظ وانقر فوق بدء تشغيل.

4. بدء التجربة والرصد في الوقت الحقيقي

  1. وبمجرد الانتهاء من التجربة ، انتقل إلى لوحه البيانات في الوقت الحقيقي في لوحه المعلومات التفاعلية. لكل قارورة ، تحقق من ان قيم OD القابضة عند الصفر ، وان درجات الحرارة في أو تتقدم نحو المستويات المبرمجة من خلال تصفح الرسوم البيانية.
  2. لاعداد الحقن ، وقياس OD من الثقافات بين عشيه وضحيها ، وحساب التخفيف اضعاف المطلوب علي افتراض حجم قارورة من 25 مل ، وماصه حجم محسوب من الداخل إلى قوارير من خلال ميناء أخذ العينات. علي سبيل المثال ، للوصول إلى الرغبة OD بدءا من حوالي 0.05 في قارورة الثقافة من الثقافات بين عشيه وضحيها التي هي في OD 2.0 ، 625 μL من الخلايا يجب ان تضاف إلى كل قنينة.
  3. تحقق من الرسوم البيانية علي لوحه القيادة لمعرفه ان الرسوم البيانية OD قد تم تحديثها وفقا لذلك. وينبغي ان ينظر إلى زيادة بالقرب من OD بداية المطلوب في الرسوم البيانية.
  4. تتبع أنواع بيانات مختلفه (مثل OD ، ودرجه الحرارة ، ومعدل النمو ، والأجيال ، واستهلاك الوسائط) خلال التجربة من خلال تصفح الرسوم البيانية المناظرة في لوحه المعلومات. قد تقوم هذه القيم بإبلاغ القرارات التجريبية من قبل المستخدم (علي سبيل المثال ، الجدولة الزمنيه) أو حتى المستخدمة في الوظائف لتنفيذ الملاحظات التلقائية.
  5. لاستبدال زجاجات الوسائط التجربة منتصف ، وقفه التجربة في لوحه مدير التجربة لمنع احداث المضخة من الحدوث. فك بسرعة خط وسائل الاعلام من زجاجه فارغه وتوصيله إلى زجاجه جديده. تجنب لمس نهايات الأنابيب لمنع التلوث. استئناف التجربة في أداره التجربة.

5. أخذ العينات خلايا الخميرة من قوارير ايفولفير

  1. اعداد محلول سيكلوهيكيمايد لمنع تخليق البروتين وإصلاح خلايا الخميرة لتحليل تدفق الخلوي. في أنبوب مخروطي 15 مل ، أضافه 12 مل من تلفزيوني و 12 μL من 20 ملغ/مل سيكلوهيكيمايد ودوامه لمده 5 ليالي.
  2. باستخدام ماصه متعددة القناات ، قسامه 100 μl في كل بئر من لوحه أسفل الجولة 96-بئر.
  3. التفاف لوحه في رقائق ألومنيوم لمنع الضوء والحفاظ علي 4 درجه مئوية حتى الحاجة.
  4. للعينه ، ماصه من خلال منفذ أخذ العينات علي غطاء القارورة باستخدام طول موسع 200 μL نصائح.
  5. ماصه 100 μL من قنينة إلى بئر في لوحه التثبيت ، خلط 2-3x عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا ، ثم استرداد في إحباط والعودة لوحه إلى 4 درجه مئوية.

6. تجربه كسر وتنظيف

  1. اعداد 1 لتر من 10 ٪ التبييض و 2 500 mL حلول المياه دي في أكواب كبيره.
  2. أوقف التجربة عن طريق إرسال أمر الإيقاف في لوحه أداره التجربة. ولا تزال البيانات مخزنه في قاعده البيانات التي تدعمها مجموعه النظراء ، ولا يزال من الممكن عرضها لاحقا في لوحه بيانات الوقت الحقيقي للوحه المعلومات ، أو تنزيلها للتحليل دون اتصال.
  3. أزاله قوارير من الأكمام الذكية ووضعها في رف الاوتوكلاف لتجنب الإفراط في الخطوات اللاحقة.
  4. فك خطوط إدخال وسائل الاعلام من زجاجات وسائل الاعلام ووضعها في الكاس من 10 ٪ التبييض. تشغيل مضخات من واجهه المستخدم ايفولفير كما في الاعداد لتعقيم الخطوط وقوارير.
  5. افصل الأسطر من القوارير وخطوط الدمج الفرعية في الماء DI. تشغيل مضخات لمسح جميع التبييض من النظام الأول مع المياه DI ، ثم مع الهواء.
  6. إيقاف ايفولفير عن طريق التبديل الأول من إمدادات الطاقة 12 فولت ، والانتظار 5 ليالي ، ومن ثم إيقاف تشغيل إمدادات الطاقة 5 فولت.
  7. نقع القضبان التقليب والقبعات في 10 ٪ التبييض ، ثم شطف مع المياه DI. تاكد من شطف تدفق والقش افلوكس من كل غطاء عن طريق تشغيل المياه DI من خلالها. فرك قوارير باستخدام اختبار أنبوب فرشاه إذا شكلت الفيلم علي الجدران.
  8. التخلص من النفايات بشكل مناسب وشطف حاويات النفايات جيدا.
    تحذير: وسوف تحتوي حاويات النفايات علي خليط من 10 ٪ التبييض ، والنفايات المعقمة ثقافة الخلية ، وكميات ضئيله من الايثانول. استشر منسق السلامة للمعالجة السليمة والتخلص منها.

7. القياس الكمي اللياقة البدنية باستخدام تحليل التدفق الخلوي للسكان كسور

  1. تحليل العينات المجمعة من القسم 5 باستخدام مقياس التدفق الخلوي المجهز بالقناة الفلورية المناسبة وأجهزه الكشف16.
  2. الحصول علي ما لا يقل عن 10,000 الاحداث لكل عينه ، وبوابه للخلايا سليمه باستخدام البيانات إلى الامام والجانب مبعثر.
  3. بوابه تستند إلى القناة الفلورية المناسبة (مثل GFP) لتحديد التوزيع الكسري لكل السكان.
  4. علي جهاز كمبيوتر ، احفظ البيانات إلى الموقع المطلوب من صفحه أداره التجربة بالنقر فوق الزر "تصدير".
  5. من ملفات بيانات ايفولفير ، حدد عدد الأجيال التي تم إكمالها بواسطة كل نقطه زمنيه لكل قنينة. في رمز ايفولفير ، يتم حساب الأجيال من خلال تقسيم البيانات OD أولا بين كل حدث تخفيف ، ثم كل قطعه تناسب مع الاسي الاساسيه للنموذج figure-protocol-1 لكل قطعه ، الغلة r ، ومعدل النمو16. ثم يتم حساب عدد الأجيال علي مدي فتره زمنيه باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-2
  6. ارسم نسبه السجل للسكان الموسومين وغير المسميين من بيانات قياس التدفق الخلوي مقابل رقم الجيل من الحسابات المذكورة أعلاه في الوقت الذي تم فيه أخذ عينات. تحديد المنطقة الخطية وتناسب الميل وفقا للمعادلة التالية. ويعرف هذا الميل عاده بأنه اللياقة التنافسية18,19.
    figure-protocol-3

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا لبناء خرائط اللياقة البدنية للمتغيرات الجينية لل s. سيريفيسياي عبر التدرج الإجهاد ثنائي الابعاد من درجه الحرارة والملوحة. علي وجه التحديد ، لكل سلاله المتغير ، استخدمنا ايفولفير لاجراء تجارب المنافسة الزوجية ضد سلاله مرجعيه فلوريسسينتلي (s. سيريفيسياي سلاله BY4741 مع مراسل التاسيسيه المتكاملة mولدان غرين) في 16 مختلفه مجموعات من هذه الضغوط (الشكل 1). للمتغيرات, تم اختيار اثنين من سلالات الضربة القاضية كل توقع ان تكون حساسة لأحد محاور حاله الإجهاد: ΔPRX1 التي تم الإبلاغ عن وجود عيوب اللياقة البدنية في درجات حرارة عاليه20 و ΔPBS2 مع عيوب اللياقة البدنية في ارتفاع تركيزات الملح21. كمتغير للتحكم ، تم استخدام سلاله BY4741 البرية غير المسمية ، والمتوقع ان تؤدي علي نحو مماثل للضغط المرجعي. في المجموع ، أجريت هذه التجارب المنافسة 3 72 ساعة في وقت واحد في 48 قارورة عبر ثلاثه أجهزه ايفولفير (16-فيال) تشغيل جميع من جهاز كمبيوتر واحد.

يتم استخدام لوحه المعلومات التفاعلية ايفولفير للتنقل بين كميه كبيره من البيانات التي يتم إنشاؤها اثناء كل تجربه (الشكل 2A). تظهر اثار OD التمثيلية عبر جميع قوارير 16 من جهاز ايفولفير واحد في الشكل 2B. كل تتبع يعرض نمط الأسنان التقليدية من خوارزميه التحكم turbidostat ، الذي يستخدم التغذية المرتدة علي OD لتحريك التخفيفات والحفاظ علي الثقافات في نطاق كثافة ضيقه (0.2-0.3 في هذه الحالة). يتم قياس بيانات التطوير التنظيمي ودرجه الحرارة بشكل مستمر ، ويتم دفقها إلى قاعده البيانات التي تدعمها مجموعه النظراء ، ويتم تحديثها في الوقت الفعلي في لوحه المعلومات التفاعلية ل ايفولفير. ومن البيانات المتدفقة باستمرار ، يمكن حساب مقاييس النظام الأعلى (مثل معدل النمو والأجيال المتراكمة) ورسمها في لوحه المعلومات (الشكل 2 ج) وحتى استخدامها كمعلمات تغذيه مرتده في مخططات اختيار مختلفه (علي سبيل المثال ، morbidostat).

لتوليد خرائط اللياقة البدنية ، ونحن قياس المعدل الذي السلالة المرجعية تتفوق علي سلاله المتغير من خلال دمج كل من قياسات التدفق الخلوي وبيانات النمو ايفولفير. علي وجه التحديد ، يتم حساب الكسور السكانية كنسبه السجل من سلاله متغير علي السلالة المرجعية باستخدام بيانات التدفق الخلوي من كل عينه مرجعيه. بالنسبة لكل ثقافة ونقطه زمنيه ، يتم استيفاء العدد المنقضي من الأجيال من بيانات معدل نمو ايفولفير في كل فتره تخفيف. التامر علي نسب سجل ضد الأجيال ، والاختلافات النوعية بين الظروف تبدا في الظهور (الشكل 3A). لحساب اللياقة البدنية ، وتناسب المنحدر من خلال الجزء الخطي من كل مؤامرة18،19، الغلة قيمه اللياقة البدنية الكمية (مع كل من علامة ومعدل) الذي يصف كيف تتنافس سلاله متغير ضد السلالة المرجعية ( الشكل 3 ب). في هذه التجربة ، تشير قيم اللياقة البدنية السلبية إلى ان السلالة المتغيرة تفوقها السلالة المرجعية. بناء خرائط الحرارة من جميع حسابات اللياقة البدنية يسمح التصور من المشهد اللياقة البدنية ثنائي الابعاد ، والكشف عن الاختلافات الكمية خفيه في الأداء بين السلالات والظروف (الشكل 3C).

من خرائط الحرارة اللياقة البدنية ، ونحن نري ان كل سلاله المتغير يسلك عيوب اللياقة البدنية التي تظهر بطرق مختلفه. ΔPRX1 هو في المقام الأول حساسة لدرجات الحرارة العالية ، ولكن الإجهاد الملح يبدو ان لها تاثير مضافه ، وزيادة عيب اللياقة البدنية. وعلي العكس من ذلك, ΔPBS2 يظهر عيوب اللياقة البدنية في المقام الأول استجابه لتركيزات الملح عاليه, مع الحد الأدنى من الاختلافات علي طول محور درجه الحرارة. وتسلط هذه النتائج الضوء علي فائده تجارب الاختيار عاليه الاستبانة ولا سيما لفك رموز التفاعلات المتعددة لعوامل الإجهاد البيئية التي يمكن ان تكون لها اثار مضافه أو متازره أو معرفيه.

وأخيرا ، من المهم ان نلاحظ انه في بعض الحالات ، وخاصه بالنسبة لظروف الإجهاد الشديد ، يمكن ان تؤدي حسابات اللياقة البدنية إلى نتائج مبالغ فيها أو منحرفة. علي سبيل المثال ، يظهر ΔPBS2 لإظهار منحدر إيجابي حاد في 39 درجه مئوية/1 م nacl الشرط بالنسبة لسلاله مرجع (الشكل 3a). ويعزي ذلك إلى ضعف النمو في كلا السلالتين ، وهو ما ينعكس في بيانات النوع البري ويحد من فائده هذا المقياس بالذات في هذه الحالة. ينتج عدد غير كاف من الأجيال في 1) سوء الفصل بين النقاط الزمنيه التي تتداخل مع المنحدر المناسب ، و 2) حساسية للآثار العشوائية الناشئة من مرحله التاخر. وفي حين لم نكن قد اخترنا القيام بذلك في هذه الدراسة ، فان بيانات النمو في الوقت الحقيقي التي جمعها ايفولفير اثناء التجربة كان يمكن استخدامها لإبلاغ القرار بتمديد التجربة وجمع النقاط الزمنيه الاضافيه لهذا الشرط بجهد ضئيل. في تجارب المتابعة ، يمكن أيضا ان يتم تضمين نسب البدء لتوسيع طول المنطقة الخطية قبل حدوث التشبع.


figure-results-1
الشكل 1: نظره عامه علي اطار ايفولفير والتصميم التجريبي. (ا) ايفولفير هي منصة ثقافيه مؤتمتة ومستمرة تسمح بالتحكم في الظروف الثقافية بتعدد المعلمات. تتكون المنصة من الأكمام الذكية ، والتي تضم أجهزه الاستشعار والمحركات للسيطرة علي الظروف الثقافية ، ومجموعه المضخات التمعجيه لتدفق الوسائط والنفايات داخل وخارج الثقافات ، وشاشه تعمل باللمس للتفاعل يدويا مع الجهاز ، وجهاز كمبيوتر تستخدم للتفاعل مع البنية التحتية سحابه حيث يتم دفق البيانات من النظام الأساسي. (B) يمكن تكوين ايفولفير بطرق متعددة: جسديا ، من خلال الخلايا والمدخلات الاعلاميه ، وبرمجيا عن طريق ضبط الخوارزميات السيطرة علي الوحدات النمطية قارورة الثقافة كم الذكية. ويمكن استخدام ذلك لبرمجه الاختيارات المتعددة الابعاد/التدرجات البيئية بدقه عاليه ، مع مخرجات تتكون من خلايا تم جمعها ماديا عند نقاط زمنيه محدده وتدفق بيانات الثقافة في الوقت الحقيقي. (ج) تكوين ايفولفير لاجراء تجربه نمو اللياقة البدنية عبر التدرج اختيار ثنائي الابعاد ، وتتالف من درجه الحرارة والإجهاد الاسموزي. وقد تم بذر قوارير الثقافة ايفولفير بنسب متساوية من المرجع وسلاله الخميرة البديلة. تم برمجه روتين turbidostat للحفاظ علي جميع الثقافات في المرحلة الاسيه في اطار OD محدده (OD 0.2-0.3). وكانت درجه الحرارة وظروف وسائل الاعلام متنوعة عبر صفيف الأكمام الذكية لتشكيل التدرجات الإجهاد المستقلة اثنين. وتتالف وسائل الاعلام الاساسيه من YPD (2 ٪ الجلوكوز) + 100 ميكروغرام/مل كاربينسيلين + 25 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول كاجراء وقائي ضد التلوث البكتيري. وقد تنوعت التراكيب وسائل الاعلام باضافه NaCl تكميليه إلى 0 M, 0.6 M, 0.8 M, أو 1.0 m. وقد برمجت درجات الحرارة القارورة إلى واحده من أربعه قيم: 30 درجه مئوية ، 35 درجه مئوية ، 37 درجه مئوية ، أو 39 درجه مئوية. (د) أمثله للإنتاج الخام للثقافة وكسور السكان من ثلاثه ظروف مجربه. تم الحفاظ علي تجربه المنافسة ل 72 h ، أخذ العينات في 24 ساعة وبعد ذلك كل 12 ساعة حتى الانتهاء من التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: لوحه معلومات تحليل البيانات في الوقت الحقيقي من ايفولفير. (ا) تتم معالجه بيانات ايفولفير وبثها في الوقت الحقيقي عن طريق البرامج المستندة إلى السحابة إلى لوحه معلومات تفاعليه. من خلال لوحه القيادة ، يمكن للمستخدمين تحديد وبدء الإجراءات الثقافية الخاصة بهم علي ايفولفير متصلة ، ورصد حاليا تشغيل التجارب عبر جميع وحدات ايفولفير ، وتختلف الظروف التجريبية يدويا علي قنينة فرديه أو مجموعه من قوارير إذا لزم الأمر. (ب) اثار OD لكل قنينة عبر مصفوفة الشروط التي تم اختبارها لمده التجربة بأكملها. يمكن عرض الآثار في الوقت الحقيقي لضمان تشغيل التجربة حسب الرغبة واستخدامها بعد التجربة لمزيد من التحليل. (ج) يمكن حساب معدلات النمو وأجيال الخلايا من اثار OD علي الطاير لتتبع تقدم التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: بناء أسطح اللياقة البدنية. (ا) الخلية السكان كسور السجل الطبيعي (سلاله المتغير/السلالة المرجعية) تامر ضد أجيال الخلية. يشير اللون إلى درجه حرارة التحديد بينما الشرطات تميز تركيزات الملح. (ب) ولقياس الملاءمة النسبية للمتغير إلى السلالة المرجعية ، يستمد مقياس اللياقة البدنية من المعدل الذي يتغير عنده كسر الشريحة السكانية الخلوية علي مدي أجيال. يتم احتساب هذا المقياس من المنطقة الخطية لقطع الكسور الخلوية باستخدام ثلاث نقاط كحد ادني. (ج) يتم عرض مقاييس اللياقة النسبية في خريطة الحرارة لبناء سطح اللياقة البدنية علي التدرجات الإجهاد البيئي. اعلي الزاوية اليمني الشرط (39 درجه مئوية/1.0 M NaCl) للنوع البرية و ΔPBS2 غير المدرجة في هذا التحليل كما مرت الثقافات من خلال أجيال غير كافيه (انظر النتائج التمثيلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختيار النمو هو أداه لا غني عنها في علم الاحياء ، وتستخدم علي نطاق واسع لتوليد وتوصيف الاختلافات الظاهرية بين السكان الخلويين. وفي حين تسمح ثقافات الدفعات باختيار النمو بطريقه محدوده ، فان تقنيات الثقافة المستمرة توسع بشكل كبير من درجه التحكم والقابلية للتنبؤ بهذه التجارب ، من خلال ممارسه التنظيم الدقيق للشكل وديناميات الاختيار لتوليد النتائج الكمية القابلة للتكرار22. وقد استخدمت الثقافة المستمرة للسيطرة الصارمة علي اختيار المكتبات العالية التنوع20،23،24،25، وتنفيذ الانظمه التكيفيه المتطورة في التجريبية موجه تطور11,12,26,27. كما تمكن الثقافة المستمرة من التوصيف الدقيق للخلايا عبر مجموعه من الظروف المضبوطة كميا لتحسين فهم النظم الوراثية المعقدة وتحسين سلالات الإنتاج الحيوي المهندسة9و14 , 28-

ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول عالمي للثقافة المستمرة ، حيث ان التغييرات الدقيقة في الظروف الانتقائية يمكن ان تؤدي إلى تغييرات جذريه في النتائج البيولوجية4،29،30. ويجب ان تكون التجارب قادره علي الاختيار بين نظم الاختيار وتكييف البروتوكولات والمعدات التجريبية وفقا لذلك. بالاضافه إلى تقديم الاختيار بين معلمات التحكم ، مثل هذه الانظمه من الناحية المثالية ان تكون متطورة بما يكفي لأداره العديد من المعلمات بشكل مستقل في وقت واحد في التجارب المتوازية للغاية التي تحتاج إلى فك التفاعل المدخلات في معقده النظم البيولوجية (مثل الرسائل المعرفية). وتتصدي ايفولفير لهذا التحدي من خلال تمكين المستخدمين من التحكم التعسفي في التغذية المرتدة بين الظروف الثقافية والوظائف المميعة من أجل تحديد المنافذ البيئية المتخصصة للغاية.

للتغلب علي القيود في الاعداد الحالي وتوسيع أو تغيير معلمات التحكم ، يمكن بسهوله أعاده تصميم الأكمام الذكية لأضافه أجهزه استشعار جديده أو المحركات. الاضافه إلى ذلك ، فان خفض حجم القارورة سيقلل من النفقات الاعلاميه التي يمكن ان تكون كبيره في الثقافة المستمرة. وفي حين يسمح التصميم الحالي بقياس ومراقبه درجه الحرارة ، والانفعالات الثقافية ، والحث الخفيف ، والتعكر ، والمزامير ، يجب قياس البارامترات الأخرى خارجيا عن طريق أخذ العينات من القنينات. ويشمل العمل الحالي دمج القدرة علي مراقبه النشاط الانزيمي عن طريق لوسيفيراز وتنظيم الأكسجين المذاب والحموضة مباشره في الثقافات ايفولفير. بالاضافه إلى ذلك ، في حين لم تظهر في هذا العمل ، يمكن ايفولفير واجهه مع الاجهزه الجديدة الإرسال المضاعف ميليفلويدريك16 التي تعتمد علي مبادئ التكامل علي نطاق واسع (الناشئة من الكترونيات والتي اعتمدتها ميكروفلويديكس) من أجل بشكل غير مكلف تمكين معالجه فلويدريك أكثر تعقيدا (علي سبيل المثال المدخلات فلويدريك متعدد الإرسال ، والنقل من قارورة إلى قنينة). ويمكن تصميم هذه الوحدات المبللة وتصنيعها بالبالكامل في المختبر ، مما يسمح للمستخدمين بتوجيه السوائل عن طريق التفعيل البرمجي لتركيبات مختلفه من الصمامات في الروتين الألى للسوائل. وهذا يتيح للمستخدمين التغلب علي التصاميم المرنة التي تستخدم تقليديا في الثقافة المستمرة ، ولكن أيضا لقياس القدرات المميعة إلى الانتاجيه العالية مع عدد اقل من عناصر التحكم المكلفة (مثل المضخات التمعجيه). وأخيرا ، فاننا نامل في دمج منصة التشكيل التلقائي التي سوف تستخدم هذه المكونات ميليفلويديكس وDIY ، والتغلب علي الحد من التفاعل اليدوي خلال التجارب أطول وأكبر حيث الثقافات أخذ العينات ستكون مرهقه.

الاضافه إلى التعديلات المادية علي المنصة ، يفتح البرنامج القائم علي شبكه الإنترنت درجات جديده من الحرية من خلال السماح للمستخدمين بكتابه وتحرير ومشاركه البرامج النصية المخصصة للايفولفر ، والقيام بالبرمجة المؤتمتة بالبالكامل ، وتمكين التغذية المرتدة. يمكن للمستخدمين المسح برمجيا عبر نطاقات المعلمات في الاختلافات الدقيقة علي نفس نظام التحديد أو ربط خوارزميات التحكم في تركيبات جديده لتحديد اي عدد من مخططات الاختيار المتطورة. وعلاوة علي ذلك ، فان القدرة علي رصد الثقافات بسهوله في الوقت الحقيقي تحول الطريقة التي تجري بها التجارب. مع الرصد في الوقت الحقيقي ، يمكن للمستخدمين 1) التحقق من الاتساق بين أشواط ، ميزه حرجه للتطبيقات الإنتاج الحيوي والتجارب عاليه الانتاجيه ، و 2) التدخل اثناء التجارب إذا لزم الأمر ، لاستكشاف السلالات الصعبة التي تظهر ضعف النمو أو تكوين بيوفيلم ، أو تشخيص أخطاء المستخدم (علي سبيل المثال ، التلوث). وأخيرا ، مع جمع تدفقات البيانات المتعددة وتفسيرها في الوقت الحقيقي لكل ثقافة علي حده ، يولد ايفولفير كثافة عاليه من البيانات ، والتي قد تسهل نهج التعلم الألى للتحليل النهائي الرواية.

إلى جانب الاستخدامات الموضحة لتوصيف اللياقة البدنية ، واختيار المكتبة ، وتطور المختبرات ، فاننا نري عددا من المجالات ذات الصلة جاهزه للتنفيذ في ايفولفر مع فلويديكس متكاملة. تجارب ايفولفير مع عينات الميكروبيوم يمكن ان مقايسة استقرار المجتمع في بيئات تسيطر31,32, استكشاف تكوين الكائنات المجهرية باستخدام تقنيات الثقافات33, أو خلط الأنواع بشكل حيوي استجواب الديناميات الايكولوجيه للاستعمار أو الغزو34،35. ويمكن بسهوله تنفيذ العديد من الطرق للتطور الموجه المستمر من الجزيئات الحيوية علي الجهاز وكذلك26,36,37, زيادة كبيره في امكانيه الوصول والانتاجيه لهذه النظم. القدرة علي تحسين ظروف النمو مثل تكوين وسائل الاعلام ، ودرجه الحرارة ، والسلالات في ديناميكية ، ويمكن ان تساعد في طبيعة الانتاجيه العالية في الجهود الأمثل للتطبيقات الحيوية الصناعية9. ونحن نتصور أيضا دمج عموديا ايفولفير مع تقنيات التحليل الأخرى مثل المجهر والتدفق الخلوي في حلقه مغلقه الأزياء ، وتوفير نظام مؤتمتة بالبالكامل للنمو وتحليل الثقافات الخلوية في كل خليه واحده والسكان مستويات. وعلاوة علي ذلك ، مع بعض التعديلات الاجهزه علي الأكمام الذكية مثل ختم السفينة والسيطرة علي محتوي الغاز ، ويمكن تكييفها ايفولفير لدعم نمو مجموعه أوسع من أنواع الخلايا ، مثل تعليق خلايا الثدييات. ومن الممكن أيضا وضع الإطار بأكمله في غرفه لاهوائية لثقافة الخلايا لاهوائية. نتطلع إلى الامام ، ونحن نهدف إلى بناء اطار البرمجيات لدينا في البنية التحتية سحابه مركزيه ونعتقد ان هذا من شانه ان يسمح للمستخدمين بسهوله تكوين وتحليل وتبادل البيانات الخاصة بهم عن بعد دون الحاجة إلى ان تكون موجودة جسديا في المختبر. ومن شان البنية التحتية للسحابة ، التي تعمل كامينه للبيانات ، ان تصلح أيضا للتحليلات الفوقية الواسعة النطاق عبر التجارب. ونتوقع ان توسع ايفولفر وهذه التطورات المستقبلية إلى حد كبير نطاق التجارب المحتملة لاختيار النمو من خلال تسهيل الاتمته والابتكار في الثقافة المستمرة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ، براندون ج. وونغ واحمد س. خليل ، هم المؤسسون المشاركون لشركه Fynch للعلوم البيولوجية ، التي تطور منصة ايفولفير المستخدمة في هذه المادة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ب. ستافورد لمساعدته في تصميم النظام ، و h. خليل ، ا. سولتانيانزاده ، ا. صن ، s. الأنابيب ، و ا. كافالي للمساعدة في بناء النظام. ونحن نعترف بمرفق تصميم الكترونيات ، ومركز الابتكار المنتجات الهندسية (EPIC) ، والبرمجيات & تطبيقات مختبر الابتكار (الشراع) في معهد الحريري للحوسبة في جامعه بوسطن لخدماتهم. وكان هذا العمل مدعوما بجائزه NSF المهنية (MCB-1350949 إلى A.S.K.) ، ومنح داربا HR0011-15-0091 و HR0011-2-0014 (إلى A.S.K.). وتعترف A.S.K. أيضا بالتمويل من جائزه المبتكر الجديد لمدير المعاهد القومية للصحة (1DP2AI131083-01) ، وجائزه كليه داربا الشبابية (D16AP00142) ، وحملات NSF في الحوسبة (CCF-1522074).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5 جالون من البلاستيك Hedpack مع غطاءمستلزمات التخمير وصناعة النبيذ في الغربالأوسط 45-56Y8-E2FRلجمع النفايات
A-D (+) -GlucoseChem-Impex00805ل YPD Medium
Attune NxT Autosamplerيسمح Thermo Fisherلمقياس التدفق الخلوي بتشغيل عينات من 96 لوحة بئر
Attune NxT FlowCellular Thermo Fisherتستخدم لتحديد كسور السكان عبر الخلية المفردة الفلورية
Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-07-0ل YPD Medium
CarbenicillinFisherScientific BP2648250لموصل YPD المتوسط
المقاوم للمواد الكيميائية الشائكة المناسب المحملة ، ل 1/8 "معرف الأنبوب ، 250 درجة ؛ F درجة الحرارة القصوىMcMaster- Carr5121K731لتفرع مدخلات
الوسائط ChloramphenicolFisher ScientificBP904-100ل YPD مبيض مبيد
للجراثيم متوسط الكلوركس 8.2550371500 فيشر العلميلتعقيم الخطوط السائلة
غطاء قارورة eVOLVER مخصصيحتوي غطاء FynchBioعلى منافذ لأخذ العينات والمدخلات / الإخراج
السائلCycloheximideFisherScientific ICN10018301لقياس التدفق الخلوي لوحات أخذ العينات
الإيثانول ، اللامائي (النسيجي)فيشر ScientificA405P-4لتعقيم الخطوط السائلة
eVOLVER UnitFynchBio
Fisherbrand نصائح ممتدة الطول (رف الرفع ؛ 1 إلى 200 أول)فيشر سينتيفيك02-681-420لأخذ عينات
القارورةقضبان التحريك المغناطيسية Fisherbrand Octagon SpinbarFisher Scientific14-513-57القطر: 4.5 مم ، الطول ، 12 مم
زجاجات الوسائط الزجاجية القابلة لإعادة الاستخدام Fisherbrand مع غطاءFB8002000 Fisher Scientificيجب أن تكون مزودة بأنابيب
مطاطية من السيليكون ذات درجة حرارة عالية شبه شفافة بيضاء ، مقياس التحمل 70A ، 1/8 بوصة ID ، 1/4 بوصة ODMcMaster- Carr51135K73لزجاجات الوسائط
Mac ميني أبللإجراء التجربة / جمع البيانات
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)BP243820 فيشر Scientificللوحات أخذ عينات قياس التدفق الخلوي
PipettesEppendorf
البلاستيك Quick Turn Tube Coupling ، المقابس ، لمعرف الأنبوب الشائك 1/16 بوصة ، مادة البولي بروبيلينماك ماستر- Carr51525K141لزجاجات
الوسائطاقتران أنبوب بلاستيكي سريع الدوران ، مقابس ، لمعرف الأنبوب الشائك مقاس 5/32 بوصة ، مادة البولي بروبيلينماكماستر - Carr51525K144لزجاجات الوسائط ،
اقتران الأنبوب البلاستيكي سريع الدوران ، المقابس ، لمعرف الأنبوب الشائك 1/16 بوصة ، مادة البولي بروبيلينماك ماستر- كار51525K291لزجاجات الوسائط البلاستيكية
اقتران الأنبوب السريع ، المقابس ، لمعرف الأنبوب الشائك مقاس 5/32 بوصة ، مادة البولي بروبيلينماك ماستر- كار51525K294للوسائط زجاجات
أغطية لولبية ، قمة مفتوحة ، مع PTFE تواجه حواجز سيليكون ، مختبر باك ، حاجز. حجم الخيط اللولبي: 24-400 ، قوارير GREENChemglassCG-4910-04
كلوريد الصوديوم (NaCl)Fsher ScientificS271-3ل YPD
Medium SpectraMax M5 Multi-Mode MicroplateReader الأجهزةلقياس OD600 من مزارع الخلايا الليلية
قارورة فقط ، عينة ، 40 مل ، شفافة ، 28 مم × 95 مم ، GPI 24-400قوارير مزرعةChemglassCG-4902-08
مستخلص الخميرةفيشر العلميBP1422-500لوسط YPD
أنابيب الجزيئية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168(2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585(2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536(2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546(2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202(2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42(2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051(2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

eVOLVER Saccharomyces cerevisiae

مقالات ذات صلة