الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Katherine Chan; Amy  Hin Yan Tong; Kevin  R Brown; Patricia Mero; Jason Moffat

doi:10.3791/59780

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

23.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59780

⸱

سبتمبر 4, 2019

Katherine Chan^*¹ , Amy Hin Yan Tong^*¹ , Kevin R Brown¹ , Patricia Mero¹ , Jason Moffat¹^,²^,³

¹Donnelly Centre, University of Toronto, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.

الملخص

وقد أدى تحرير الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس إلى تقدم كبير في القدرة على تحرير الجينومات من مختلف الكائنات الحية بدقة. وفي سياق خلايا الثدييات، تمثل هذه التكنولوجيا وسيلة جديدة لإجراء شاشات جينية على نطاق الجينوم من أجل دراسات علم الجينوم الوظيفية. تسمح مكتبات الإرشاد RNAs (sgRNA) التي تستهدف جميع إطارات القراءة المفتوحة بتوليد الآلاف من الاضطرابات الوراثية السهلة في مجموعة واحدة من الخلايا التي يمكن فحصها لأنواع ظاهرية محددة لتوريط وظيفة الجينات والعمليات الخلوية في بطريقة غير متحيزة ومنهجية. توفر شاشات CRISPR-Cas للباحثين طريقة بسيطة وفعالة وغير مكلفة للكشف عن المخططات الوراثية للأنماط الظاهرية الخلوية. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل التفاضلي للشاشات التي يتم إجراؤها في مختلف خطوط الخلايا ومن أنواع السرطان المختلفة يمكن أن يحدد الجينات الضرورية من حيث السياق في الخلايا السرطانية، مما يكشف عن الأهداف المحتملة لعلاجات محددة مضادة للسرطان. ويمكن أن يكون أداء الشاشات على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية أمراً شاقاً، لأن ذلك ينطوي على معالجة عشرات الملايين من الخلايا ويتطلب تحليلاً لمجموعات كبيرة من البيانات. غالباً ما يتم تجاهل تفاصيل هذه الشاشات، مثل توصيف خط الخلية، واعتبارات مكتبة CRISPR، وفهم حدود وقدرات تقنية CRISPR أثناء التحليل. ويرد هنا بروتوكول مفصل للأداء الناجح للشاشات المجمعة على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9.

المقدمة

كريسبر-كاس، قصيرة لتتجمع بانتظام بين المسافات قصيرة باليندروميك وتكرار المرتبطة كريسبر، يتكون من بروتين nuclease واحد (على سبيل المثال، Cas9) في مجمع مع الحمض النووي الريبي دليل الاصطناعية (sgRNA). يستهدف هذا المركب الريبونوكليوبروتين إنزيم Cas9 للحث على فواصل الحمض النووي المزدوج ة في موضع جيني محدد¹. يمكن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق إصلاح موجه ة (HDR) أو، بشكل أكثر شيوعًا، من خلال الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ)، وهي آلية إصلاح عرضة للخطأ تؤدي إلى الإدراج و/أو الحذف (INDELS) التي تعطل في كثير من الأحيان وظيفة الجينات ^1.كفاءة وبساطة كريسبر تمكن من مستوى لا يمكن تحقيقه من قبل من استهداف الجين....