يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

12.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59830

⸱

يوليو 17, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, 3School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 4Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تُعرض هنا بروتوكولات للاختبارات البيوكيميائية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين التي قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة تفاعلات حمض البروتين والنوى.

الملخص

تلعب تفاعلات حمض البروتين والنوى أدوارًا هامة في العمليات البيولوجية مثل النسخ وإعادة التركيب والتمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي. تتطلب الطرق التجريبية لدراسة تفاعلات الأحماض النووية البروتينية استخدام علامات الفلورسنت أو النظائر المشعة أو التسميات الأخرى للكشف عن جزيئات مستهدفة محددة وتحليلها. البيوتين، وهو تسمية حمض نووي غير مشع، يستخدم عادة في اختبار التحول التنقل الكهربائي (EMSA) ولكن لم يتم استخدامه بانتظام لرصد نشاط البروتين أثناء عمليات الحمض النووي. يوضح هذا البروتوكول فائدة وضع العلامات على البيوتين أثناء التفاعلات الأنزيمية في المختبر، مما يدل على أن هذه التسمية تعمل بشكل جيد مع مجموعة من الاختبارات البيوكيميائية المختلفة. على وجه التحديد، تمشيا مع النتائج السابقة باستخدام النظائر المشعة 32P-المسمى ركائز، وأكد عن طريق EMSA المسمى البيوتين أن MEIOB (بروتين تشارك على وجه التحديد في إعادة تركيب meiotic) هو بروتين الحمض النووي ملزمة، أن MOV10 (وهو حل حالة طائرات الهليكوبتر RNA) الهياكل المزدوجة RNA المسمى البيوتين، وأن MEIOB يشق الحمض النووي الذي يحمل اسم البيوتين. توضح هذه الدراسة أن البيوتين قادر على استبدال 32P في مختلف الاختبارات الكيميائية الحيوية المتعلقة بالحمض النووي في المختبر.

المقدمة

وتشارك تفاعلات حمض البروتين والنوى في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل إصلاح الحمض النووي، والنسخ المتماثل، والنسخ، ومعالجة الحمض النووي الريبي، والترجمة. التفاعلات البروتينية مع تسلسل الحمض النووي محددة داخل الكروماتين مطلوبة للسيطرة الصارمة على التعبير الجيني في المستوى النسخي1. التنظيم الدقيق بعد النسخ من العديد من الترميز وعدم الترميز RNAs يتطلب تفاعلات واسعة ومعقدة بين أي بروتين وRNA2. هذه الطبقات من آلية تنظيم التعبير الجيني تشمل سلسلة من الأحداث الديناميكية بين الجزيئيات، والتي يتم تنسيقها من خلال تفاعلات العوامل النسخ / الجيني أو البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي مع أهدافها حمض نووي، فضلا عن تفاعلات البروتين والبروتين. لتشريح ما إذا كانت البروتينات في الجسم الحي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر مع الأحماض النووية وكيف تحدث مثل هذه الجمعيات وتتوج، في المختبر يتم إجراء الاختبارات الكيميائية الحيوية لدراسة التقارب ملزمة أو النشاط الأنزيمي من البروتينات ذات الأهمية على تصميم ركائز الحمض النووي و / أو الحمض النووي الريبي.

وقد تم تطوير العديد من التقنيات للكشف عن وتوصيف المجمعات حمض النووي البروتين، بما في ذلك اختبار التحول التنقل الكهربائي(EMSA)، وتسمى أيضا اختبار التخلف هلام أو الفرقة التحول اختبار 3،4،5 . EMSA هو طريقة كيميائية حيوية متعددة الاستخدامات وحساسة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الربط المباشر للبروتينات مع الأحماض النووية. EMSA يعتمد على التحول الكهربائي هلام في العصابات، والتي يتم تصورها بشكل روتيني باستخدام chemiluminescence للكشف عن تسميات البيوتين6،7، الفلورة من تسميات فلوروفور8،9،أو عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي للأشعة 32P التسميات10،11. أغراض أخرى من الدراسات البيوكيميائية هي تحديد وتوصيف نشاط معالجة الحمض النووي للبروتينات، مثل التفاعلات القائمة على النوى لتقييم المنتجات الانقسام من الركيزات حمض نووي12، 13 , 14 والحمض النووي / الحمض النووي الريبي هيكل الفك الاختبارات لتقييم أنشطة طائرات الهليكوبتر15،16،17.

وفي مثل هذه الاختبارات الأنزيمية، كثيراً ما تستخدم الأحماض النووية التي تحمل اسم النظائر المشعة أو التي تحمل اسم الفلوروفور كركائز بسبب حساسيتها العالية. وقد تبين أن تحليل التصوير الإشعاعي لردود الفعل الأنزيمية التي تنطوي على 32P المسمى radiotracers حساسة واستنساخ18 . ومع ذلك، ففي عدد متزايد من المختبرات في العالم، يكون استخدام النظائر المشعة مقيداً أو حتى محظوراً بسبب المخاطر الصحية المرتبطة بالتعرض المحتمل. وبالإضافة إلى الشواغل المتعلقة بالسلامة الأحيائية، تتمثل العيوب الأخرى في المعدات اللازمة اللازمة للقيام بأعمال مع النظائر المشعة، وترخيص النشاط الإشعاعي المطلوب، وفترة نصف العمر القصيرة البالغة 32P (حوالي 14 يوما)، والتدهور التدريجي لنوعية المسبار بسبب الإنهاليس الإشعاعي. وهكذا، تم تطوير أساليب بديلة غير متساوية النظائر (أي أن وضع العلامات على المسبار بالفلوروفوريس يمكّن من الكشف عن طريق التصوير الفلوري19). ومع ذلك، هناك حاجة إلى نظام تصوير عالي الدقة عند استخدام تحقيقات تحمل علامة الفلورسنت. البيوتين، وهي تسمية شائعة الاستخدام، يرتبط بسهولة إلى الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات والأحماض النووية. البيوتين-streptavidin نظام يعمل بكفاءة ويحسن حساسية الكشف دون زيادة خلفية غير محددة20،21. إلى جانب EMSA، يستخدم البيوتين على نطاق واسع لتنقية البروتين وRNA سحب إلى أسفل، من بين أمور أخرى22،23،24.

يستخدم هذا البروتوكول بنجاح الأحماض النووية التي تحمل اسم البيوتين كركائز للاختبارات البيوكيميائية في المختبر التي تشمل EMSA، بالإضافة إلى التفاعلات الأنزيمية التي لم يتم استخدام البيوتين فيها بشكل شائع. يتم بناء المجال OB MEIOB ويتم التعبير عن اثنين من المسوخ (اقتطاع ونقطة طفرة) كما GST البروتينات الانصهار25،26،27، وكذلك الماوس MOV10 المؤتلف علم الانصهار البروتين16. ويسلط هذا التقرير الضوء على فعالية هذا البروتوكول المشترك لتنقية البروتين والاختبارات التي تحمل علامة البيوتين لأغراض تجريبية متنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد البروتين

  1. بنيات تعبير MEIOB وMOV10
    1. إنشاء تعبير cDNA ترميز الماوس MEIOB-A و C و E (الشكل1A)و MOV10.
      1. إعداد ردود الفعل سلسلة البوليمر (PCR) لكل جزء. مزيج 1 μL من cDNA الماوس (من C57BL/6 testis الماوس)، 1 ميكرولتر من dNTP، 2 μL من 10 μM التمهيدي إلى الأمام، 2 μL من 10 μM التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي، 25 ميكرولتر من 2X PCR العازلة، و 18 ميكرولتر من المقطر المزدوج H2O (ddH2O) في نهائي حجم 50 ميكرولتر.
        ملاحظة: ترد في الجدول 1 المواد التمهيدية لتضخيم شظايا الجينات ميوب وموف 10.
      2. تنفيذ ردود فعل PCR باستخدام البرامج التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 35 دورات من التدفئة في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق، الصلب في 64 درجة مئوية لمدة 15 ق، تمديد في 72 درجة مئوية لمدة 20 ق (2 دقيقة لتمديد كامل طول MOV10)، والتمديد النهائي في 68 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة.
        ملاحظة: استخدم زوج التمهيدي MEIOB-E (F1) وMEIOB-E-mut (R1) وMEIOB-E-mut (F2) وMEIOB-E (R2) لتضخيم جزأين يحتويان على تسلسل متحول ضمن تسلسل متداخل في الطرفين 3 و5 على التوالي لتوليد قالب PCR متحول.
    2. تحليل الحمض النووي PCR تضخيم بواسطة الكهربائي هلام، وقطع الفرقة من الحجم المطلوب من هلام بسرعة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.
      ملاحظة: أحجام المنتجات المتوقعة مرئية على هلام أغاروز لMEIOB-A هو 536 نقطة أساس، MEIOB-C هو 296 نقطة أساس، MEIOB-E هي 312 نقطة أساس و 229 نقطة أساس، وMOV10 هو 3015 نقطة بيوم.
    3. تنقية الحمض النووي PCR مع مجموعة استخراج هلام بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
      1. إضافة حجم متساو من حل العازلة في أنبوب الطرد المركزي من الخطوة 1.1.2 وتذوب هلام في حمام المياه 50-55 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة، وضمان أن تذوب قطع هلام تماما. الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع أي قطرات من جدار الأنبوب.
        ملاحظة: تركيز الكتلة/الحجم للجل والمخزن المؤقت المذاب هو 1 ملغم/ميكرولتر.
      2. ضع عمود الامتزاز في أنبوب التجميع، ونقل الحل الذي يحتوي على جزء الجل المذاب إلى عمود الامتزاز، والطرد المركزي في 12000 × ز لمدة دقيقتين.
      3. تخلص من الفيلتر في الجزء السفلي من أنابيب التجميع. إضافة 600 درجة مئوية من المخزن المؤقت للغسيل إلى العمود، والطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة دقيقة واحدة، وتجاهل filtrate.
      4. كرر الخطوة 1.1.3.3 مرة واحدة.
      5. ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع، والطرد المركزي في 12000 × ز لمدة 2 دقيقة لإزالة كل المخزن المؤقت للغسيل المتبقي.
      6. ضع عمود الامتزاز في أنبوب طرد مركزي معقم بـ 1.5 مل، وأضف 50 ميكرولتر من ddH2O إلى مركز عمود الامتزاز والطرد المركزي عند 12000 × ز لمدة دقيقة واحدة.
    4. تقييد هضم البلازميدات
      1. هضم pGEX-4T-1 ناقلات مع بامهي ونوتي. للقيام بذلك، مزيج 4 ميكروغرام من pGEX-4T-1 ناقلات، 5 ميكرولتر من 10X ملخص العازلة، 1 ميكرولتر من BamHI، و 1 ميكرولتر من نوتي وddH2O إلى حجم رد فعل نهائي من 50 ميكرولتر. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      2. هضم pRK5 ناقلات مع BamHI وXhoI عن طريق خلط 4 ميكروغرام من ناقلات pRK5, 5 € L من 10X ملخص العازلة, 1 € L من BamHI, و 1 € L من XhoI و ddH2O إلى حجم التفاعل النهائي من 50 € L. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    5. تحليل الحمض النووي ناقلات عن طريق الكهربائي هلام، وقطع الفرقة الحجم المطلوب من هلام بسرعة مع مشرط تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.
    6. تنقية الحمض النووي ناقلات مع مجموعة استخراج هلام كما 1.1.3 بعد تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: طول بلازميدات خطية: pGEX-4T-1، 4.4 كيلو بايت؛ pRK5، 4.7 كيلو بايت.
    7. إعداد رد فعل الربط المؤتلف القياسية عن طريق الجمع بين 0.03 pmol من ناقلات خطية، 0.06 pmol من جزء cDNA، 2 ميكرولتر من ligase، و 4 ميكرولتر من 5X المخزن المؤقت ligase و ddH2O في حجم رد فعل نهائي من 10 درجة مئوية.
      ملاحظة: استنساخ MEIOB-A، C، و E في متجه pGEX-4T-1 وMOV10 إلى متجه pRK5.
    8. تحضن الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يبرد رد الفعل على الفور لمدة 5 دقائق على الجليد. حوّل بلازميدات مؤتلفة MEIOB إلى بكتيريا BL21 وبلازميدات مؤتلفة MOV10 إلى بكتيريا DH5α.
      ملاحظة: تحقق من كافة البنيات المؤتلف بواسطة تسلسل Sanger.
    9. إعداد مخزونات الجلسرين من الثقافات البكتيرية التي تحتوي على بلازميدات المؤتلف التحقق من خلال إضافة حجم متساو من 50٪ الجلسرين إلى الثقافات السائلة، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: لكل تجربة لاحقة، قم بفصل البكتيريا من مخزونات الجلسرين على طبق أجار طازج واستخدم مستعمرة واحدة للتوسع كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  2. مقتطفات بروتين MEIOB من البكتيريا
    1. اختيار مستعمرة واحدة من كل سلالة BL21 المنقولة مع pGEX-4T-1 بلازميد فارغة أو مؤتلف التحقق من خلال التسلسل وتلقيح في 3 مل LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع هز في 220 دورة في الدقيقة.
    2. انحنوا 300 مل رطل تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين من 3 مل ثقافة بين عشية وضحاها (من الخطوة 1.2.1). تنمو الثقافات مع الهز في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة حتى OD600 تصل 0.5-1.0.
    3. حث التعبير البروتين عن طريق إضافة إيزوبروبيل بيتا-D-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) إلى تركيز نهائي من 0.2 mM. احتضان الثقافات لمدة 3 ساعة إضافية مع هز في 180 دورة في الدقيقة و 18 درجة مئوية.
    4. طرد مركزي للثقافة البكتيرية في 3500 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. إعادة تعليق بيليه في 20 مل من الجليد البارد دولبكو الفوسفات المخزنة المالحة (DPBS) العازلة. سونيكات تعليق البكتيرية على الجليد لمدة 25 دورات في رشقات نارية قصيرة 10 ق (انتاج الطاقة 20٪) تليها 2-3 s يستريح على الجليد.
    6. الطرد المركزي lysate في 12،000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    7. قبل غسل الخرز.
      1. إضافة 300 درجة مئوية من الخرز الجلوتاثيون-سيفروز إلى أنبوب 15 مل الطازجة وغسل الخرز مع 10 مل من الجليد الباردة PBS العازلة.
      2. الطرد المركزي في 750 × ز و 4 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لبيليه الخرز وتجاهل الحل غسل.
    8. يُضاف الليسات إلى الخرز المغسول والحضانة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. شطف الخرز في 10 مل من الجليد الباردPBS 8X.
    9. Elute الخرز مع 1 مل من العازلة elution (10 مل الجلوتاثيون في 50 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 8.0) 6X، وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل كل خطوة elution. الطرد المركزي في 750 × ز و 4 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لبيليه الخرز. جمع وتجميع الكسور 6.
    10. نقل البروتينات المنقولة إلى فلتر الطرد المركزي والتركيز عن طريق الطرد المركزي في 7500 × ز للحصول على حجم نهائي من 100-200 درجة مئوية.
  3. مستخلصات البروتين MOV10 من خلايا HEK293T
    1. عبّر عن بروتينات MOV10 بشكل عابر في خلايا HEK293T المستزرعة.
      1. إعداد MOV10-pRK5 بلازميد بتركيز > 500 نانوغرام / ميكرولتر.
      2. خلايا البذور HEK293T في أطباق 15 سم. عندما تصل كثافة الخلية إلى ~ 70٪ -90٪، استبدال وسط ثقافة الخلية مع الطازجة دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-العقديات.
      3. لإلتصاص واحد، تمييع 60 ميكروغرام من الحمض النووي بلازميد MOV10-pRK5 في 3 مل من وسط المصل المنخفض، ثم إضافة 120 ميكرولتر من كاشف محسن الانفسي، واخلط جيدا.
      4. في أنبوب منفصل تمييع 90 درجة مئوية من كاشف التغوط مع 3 مل من المصل المتوسط المنخفض (بدون البنسلين-ستربيتموميكسين) ومزيج جيدا.
      5. إضافة الحمض النووي المخفف إلى كل أنبوب من الكاشف الانف المخفف. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      6. أضف خليط التغوط إلى ثقافة الخلية، وخلايا الثقافة لمدة 36-48 ساعة تقريبًا.
    2. بعد 36-48 ساعة، وجمع الخلايا من كل لوحة في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. غسل كل بيليه مع 10 مل من الجليد الباردة PBS، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    3. إعادة تعليق بيليه في 3 مل من العازلة اللليس الخلية التي تحتوي على حمض الهيلينيديامينيتيتيك الكامل (EDTA) خالية من البروتياز كوكتيل المانع. الحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي lysate في 20،000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. إضافة 100 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي المضادة للعلم لكل طبق من الخلايا في أنبوب 1.5 مل.
    5. غسل الخرز المغناطيسي 2X مع K150 العازلة (50 M HePES في درجة الحموضة 7.5، 150 MM كواك، 1 MDTT، 0.1٪ NP-40).
      1. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 1 مل من الجليد الباردة K150 العازلة.
      2. احتضان الخرز المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية مع تناوب لطيف وبيليه الخرز المغناطيسي مع مساعدة من المغناطيس. إزالة وتجاهل supernatant.
    6. إضافة الخرز المغناطيسي إلى الخلية lysate supernatant من الخطوة 1.3.3 وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    7. غسل حبات البروتين ملزمة المغناطيسي 3X مع K150 العازلة، ثم 2X مع K150 تحتوي على 250 مل NaCl، ثم 3X مع K150 العازلة كما 1.3.5.
    8. إعادة تعليق الخرز في 300 درجة مئوية من العازلة ELUTIon العلم (100 مل NaCl، 20 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.5، 5 مل ملغ كل2،10٪ الجلسرين)، إضافة الببتيد العلم إلى تركيز نهائي من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وحضانة مع الخرز على الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم بيليه الخرز المغناطيسي مع مساعدة من المغناطيس.
    9. جمع supernatant الذي يحتوي على البروتينات MOV10 eluted، وتحديد التركيز، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

2. إعداد الحمض النووي

  1. شراء الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides (oligos) مع أو بدون تسميات البيوتين من مصدر مناسب. تمييع كل القلة في DdH2O إلى 20 درجة مئوية خالية من RNase والاحتفاظ بها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظة: ترد في الجدول 2تسلسلات القلة من ركائز الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذه الدراسة.
  2. إعداد الخليط التالي لرد فعل الأنيل الحمض النووي الريبي (dsRNA) المزدوج الذين تقطعت بهم السبل لـ MOV10 اختبار نشاط الهيليكيس: مزيج 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic Acid (HEPES) في درجة الحموضة 7.5، 6 مل كيلو كل، 0.2 مليون متر من ملغ كل2 و RNase خالية من ddH2 O في حجم رد الفعل النهائي من 20 درجة مئوية.
  3. oligos RNA الصلب لتشكيل الحمض النووي الريبي دوبلكس عن طريق تسخين خليط من حبلا أعلى biotin المسمى (2 μM، التركيز النهائي) و 1.5 أضعاف حبلا أسفل تكميلية غير مسمى في العازلة الصلب (الخطوة 2.2) في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومن ثم تبريده ببطء إلى غرفة درجة الحرارة (RT).

3. في المختبر الاختبارات البيوكيميائية

  1. EMSA وردود الفعل الأنزيمية
    1. بالنسبة لـ MEIOB EMSA، قم بمزج 50 مليون متر من حمض المشعرات في درجة الحموضة 7.5، 2 مليون متر من حمض الهيدروكلوريك 2، 50 مل NaCl، 10 mM EDTA، 2 m dithiothreitol (DTT)، 0.01٪ NP-40، 0.8 mM (أو التركيزات الأخرى ذات الصلة كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3) بروتين MEIOB، و 10 مليون متر biotin المسمى oligonucleotides وddH2O في حجم رد فعل نهائي من 20 درجة مئوية. حضانة في RT لمدة 30 دقيقة، وإضافة 5X وقف العازلة (125 mM EDTA، 50٪ الجلسرين) لوقف رد الفعل.
    2. إعداد ردود فعل نشاط MEIOB nuclease كما هو موضح في الخطوة 3.1.1 ولكن دون إضافة 10 MM EDTA.
    3. للحصول على مراقبة نشاط طائرات الهليكوبتر MOV10، مزيج 50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة7.5، 20 mM KoAc، 2 MM MgCl 2، 0.01٪ NP-40، 1 MM DTT، 2 U /μL RNase المانع، 10 nM البيوتين المسمى RNA الركيزة، 2 m أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، 100 نانومتر RNA فخ، و 20 نانوغرام من البروتين MOV10 و DDH >2O في حجم رد الفعل النهائي من 20 درجة مئوية. احتضان خليط التفاعل في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 30 دقيقة، و 60 دقيقة.
      ملاحظة: فخ الحمض النووي الريبي، وهو oligo البيوتين غير المسمى مع تسلسل، والتكامل إلى oligo المسمى، والذي يمنع dsRNA غير الجرح من الصلب مرة أخرى.
  2. هلام البولي أكريلاميد
    1. اغسل أطباق الجل (16 سم × 16 سم) و1.5 مم. تجميع وحدات الكهربائي هلام.
    2. لإعداد هلام بوليأكريلاميد الأصلي 10٪، مزيج 14 مل من ddH2O، 1.25 مل من 10X تريس-بوريك حمض إدتا (TBE)، 8.3 مل من 30٪ أكريلاميد، 1.25 مل من 50٪ الجلسرين، 187.5 ميكرولتر من 10٪ أعدت حديثا كبريتات الأمونيوم (APS)، و 12.5 ميكرو ل من 50٪ الجلسرين، 187.5 ميكرولتر من 10٪ أعدت حديثا كبريتات الأمونيوم (APS)، و 12.5 ميكرو من رباعي ميثيل الإيثيلينديامين (TEMED).
    3. لإعداد هلام بوليأكريلاميد الأصلي 20٪، مزيج 5.5 مل من ddH2O، 1.25 مل من 10X TBE، 1.25 مل من 50٪ الجلسرين، 16.7 مل من 30٪ أكريلاميد، 187.5 ميكرولتر من 10٪ APS، و 12.5 ميكرولتر من TEMED.
    4. صب محلول الأكريلاميد على الفور إلى هلام وإدراج المشط. يُترك المزيج معمرة لمدة 30 دقيقة تقريبًا.
  3. هلام تشغيل
    1. إزالة المشط، وملء الدبابات مع المخزن المؤقت تشغيل الكهربائي (0.5x TBE).
    2. شطف الآبار عينة مع 0.5x TBE العازلة، ثم قبل تشغيل هلام في 100 V على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. تحميل عينات 20-25 درجة مئوية في كل بئر.
    4. استخدم جل أكريلاميد أصلي بنسبة 10% لدراسة EMSA وجل أكريلاميد أصلي بنسبة 20% للحصول على الاختبارات الأنزيمية. تشغيل الكهربائي في 100 V على حمام الجليد حتى يتم ترحيل علامة الأزرق بروموفينول إلى الربع السفلي من هلام.
  4. تفكيك لوحات هلام، وتقليم هلام عن طريق إزالة آبار التحميل والممرات غير المستخدمة. ضع الجل في المخزن المؤقت TBE 0.5x.
  5. قطع ورقة فلتر وغشاء النايلون إلى حجم الجل. قبل الرطب ورقة مرشح نظيفة وغشاء النايلون.
  6. تجميع المكدس للنقل.
    1. ضع الغشاء قبل الرطب على ورقة التصفية قبل الرطب.
    2. ضع الجل على الغشاء.
    3. قم بتغطية الجل بطبقة أخرى من ورق الفلتر قبل الرطب.
    4. إزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق المتداول ماصة نظيفة من مركز إلى حافة.
  7. نقل العينات من هلام إلى الغشاء في جهاز الكهربائي شبه الجافة في 90 مانا لمدة 20 دقيقة.
  8. إيقاف نقل، ومن ثم تجفيف الغشاء على ورقة فلتر جديدة لمدة دقيقة واحدة.
  9. Crosslink العينات عن طريق تشعيع الغشاء في 120 mJ/cm2 لمدة 45-60 ق في كروسلينكر الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة مجهزة 254 نانومتر المصابيح (السيارات كروسلينك وظيفة). الهواء يجف الغشاء في RT لمدة 30 دقيقة.
  10. الكشف عن الكيمياء
    1. البروتوكول 1: استخدام حجم قياسي من مجموعة الكشف عن الأحماض النووية الكيميائية التجارية.
      1. إضافة 20 مل من حجب العازلة إلى الغشاء وحضانة لمدة 15-30 دقيقة مع هز لطيف على الدوار في 20-25 دورة في الدقيقة.
      2. إعداد حل المخزن المؤقت conjugate/blocking عن طريق إضافة 66.7 ميكرولتر استقرت streptavidin-الفجل peroxidase conjuasgate إلى 20 مل من حظر العازلة.
      3. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بلطف واستبداله بالمخزن المؤقت المترافق/الحظر. حضانة لمدة 15 دقيقة على الدوار في 20-25 دورة في الدقيقة.
      4. غسل الغشاء 4X مع هز في 40-45 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
      5. إضافة 30 مل من الركيزة العازلة التعادل إلى الغشاء. احتضان الغشاء لمدة 5 دقائق مع هز في 20-25 دورة في الدقيقة.
      6. إعداد حل العمل الركيزة عن طريق إضافة 6 مل من حل luminol / محسن إلى 6 مل من محلول بيروكسيد مستقرة. تجنب الضوء.
      7. تغطية سطح كامل من الغشاء مع الركيزة حل العمل وحضانة لمدة 5 دقائق.
      8. مسح الغشاء في نظام التصوير الكيميائي لمدة 1-3 s.
    2. البروتوكول 2: استخدام مجموعة الكشف عن الأحماض النووية الكيميائية التجارية المخففة 2x واتبع الخطوات 3-10-1-1-3-10-1-8.
    3. البروتوكول 3: استخدام الكواشف ذاتية الصنع6.
      1. إعداد المخزن المؤقت حظر: مزيج 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.5، 0.1 م حمض الهيدروكلوريك، 2 مل مغكل2،و 3٪ مصل البقر الزلال كسر V. AP 7.5 العازلة: مزيج 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.5، 0.1 M حمض الهيدروكلوريك، و 2 م م مغكل2. AP 9.5 العازلة: مزيج 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 9.5، 0.1 M NaCl، و 50 مل ملغ كل2. TE العازلة: مزيج 10 M تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 8.0، 1 MM EDTA في درجة الحموضة 8.0.
      2. نقع الغشاء في العازلة حجب في 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. إضافة 8.5 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية streptavidin إلى 10 مل من AP 7.5 العازلة. هز الغشاء بلطف في هذا الحل في RT لمدة 10 دقائق. ثم، وغسل الغشاء 2X في 15 مل من AP 7.5 العازلة لمدة 10 دقيقة.
      4. غسل الغشاء مرة واحدة أكثر في 20 مل من AP 9.5 العازلة لمدة 10 دقيقة.
      5. إضافة 7.5 مل من حل التنمية على الغشاء، وتفحص الغشاء في نظام التصوير chemiluminescent ل 1-3 s.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويتضح في الشكل 1ألفهيكل البروتين من MEIOB وبنيات التعبير المستخدمة في هذه الدراسة . طيات OB في MEIOB هي هياكل صغيرة تشبه برميل التي يمكن التعرف على والتفاعل مع الأحماض النووية التي تقطعت بها السبل واحدة. واحدة من مجالات OB (aa 136-307، بناء A) يربط الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA)، والبروتين المقتطع (aa 136-178 اقتطاع، وبناء C) وشكل نقطة متحولة (R235A طفرة، بناء E) من MEIOB لم يكن لديك نشاط الحمض النووي ملزمة26. تم الإعراب عن البروتينات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التحقيق في تفاعلات الحمض النووي البروتين أمر بالغ الأهمية لفهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء العمليات البيولوجية المتنوعة. على سبيل المثال، MEIOB هو بروتين الخصية محددة ضرورية لmeiosis والخصوبة في الثدييات25،26،27. MEIOB يحتوي على مجال OB الذي يربط الحمض النووي الذي تقطعت به السبل واحد ويعرض 3 ' إلى 5 ' النشاط exonuclease26، والتي تتعلق مباشرة إلى أهميتها الفسيولوجية أثناء إعادة تركيب meiotic. على سبيل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يُعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر ب. جيريمي وانغ (جامعة بنسلفانيا) على المناقشات والمناقشات المفيدة. كما نشكر سيغريد إيكاردت على تحرير اللغة. تم دعم K. Z. من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2016YFA0500902، 2018YFC1003500) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). تم دعم L. Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502، 31871503) وبرنامج الابتكار وريادة الأعمال في مقاطعة جيانغسو. J. N. بدعم من تشجيانغ الطبية للعلوم والتكنولوجيا المشروع (2019KY499). تم دعم M. L. من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771588) وخطة المواهب الشبابية 1000.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المعدات< / قوي >
جهاز طرد مركزيEppendorf ، ألمانيا5242R
نظام التصوير الكيميائيTanon ، الصين5200
سونيفر رقميبرانسون ، الولايات المتحدة الأمريكيةBBV12081048A450 واط ؛ 50/60 هرتز
نشاف كهربائي شبه جافHoefer ، الولايات المتحدة الأمريكيةTE77XP
مسدس أنبوبي كريستال ، الولايات المتحدة الأمريكية3406051
الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة عبر الرابطUVP ، USACL-1000
< قوي > المواد < / قوي >
Amicon Ultra-4 مرشح الطرد المركزي   ؛ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكيةUFC8010964 مل / 10 كيلو
غشاء نايلونThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةTG263940A
ثقافة معالج TCCorning ، الولايات المتحدة الأمريكية430167100 مم   ؛
ثقافة معالج TCCorning ، الولايات المتحدة الأمريكية430597150 مم   ؛
أنابيب الأنابيب الدقيقةAXYGEN ، USAMCT-150-C1.5 مل & nbsp ؛
أنابيبكورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية43079115 مل
< قوي > كواشف   ؛ < / قوي >
AmpicillinSunShine Bio ، الصين8h288h28
الخرز المغناطيسي المضاد للعلم M2سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكيةM8823
ATPThermo Scientific ، الولايات المتحدةالأمريكية 591136
BCI / NBT طقم تطوير لون الفوسفاتيز القلويBeyotime ، الصينC3206
CelLyticTM< / sup> M Cell Lysis الكاشف سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية107M4071V
ClonExpress II طقم استنساخ خطوة واحدة Vazyme ، الصينC112
للكشف عن الحمضThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةT1269950
dNTPSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةDNTP100-1KT
DMEMGibco ، الولايات المتحدة الأمريكية10569044
DPBS bufferGibco ، الولايات المتحدة الأمريكية14190-136
EDTAInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9260G0.5 م
كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTAروش ، الولايات المتحدة الأمريكية04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit   ؛Vazyme, China 
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini KitVazyme ، الصينDC301-01
FBSGibco ، الولايات المتحدة الأمريكية10437028
FLAG الببتيدسيجما ، الولايات المتحدة الأمريكيةF4799
GlycerolSigma ، الولايات المتحدة الأمريكيةSHBK3676
GST Bulk KitGE Healthcare ، الولايات المتحدة الأمريكية27-4570-01
HEPES bufferSigma، الولايات المتحدة الأمريكيةSLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية34060
KoAcSangon Biotech ، الصين127-08-02
Lipofectamin 3000 كاشف الإرسالالحراري العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةL3000001
MgCl2< / sub>Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9530G1 M
NaClInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9759
  ؛		5 M 
NP-40Amresco ، الولايات المتحدة الأمريكيةM158-500ML
Opti-MEM متوسطGibco ، الولايات المتحدةالأمريكية 31985062
PBSGibco ، الولايات المتحدة الأمريكية10010023PH 7.4
RNase InhibitorPromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةN251B
Streptavidin القلوي فوسفاتيزPromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةV5591
TBEInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15581044
Tris-HCI Buffer Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية155670271 M ، PH 7.4
Tris-HCI Buffer   ؛Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية155680251 M ، PH 8.0
Tween-20Sangon Biotech ، الصينA600560
طبق طبق كيميلومينيسنت النووي

المراجع

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788(2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

توسيم بالبيوتينمقايسة إزاحة الحركية الكهربائيةارتباط MEIOB بالحمض النووي DNAنشاط هليكاز MOV10أحماض نووية موسومة بالبيوتينالكشف بالتلألؤ الكيميائيتحليل لطخة ويسترنصبغ كوماسي الأزرق
في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.