تُعرض هنا بروتوكولات للاختبارات البيوكيميائية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين التي قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة تفاعلات حمض البروتين والنوى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب تفاعلات حمض البروتين والنوى أدوارًا هامة في العمليات البيولوجية مثل النسخ وإعادة التركيب والتمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي. تتطلب الطرق التجريبية لدراسة تفاعلات الأحماض النووية البروتينية استخدام علامات الفلورسنت أو النظائر المشعة أو التسميات الأخرى للكشف عن جزيئات مستهدفة محددة وتحليلها. البيوتين، وهو تسمية حمض نووي غير مشع، يستخدم عادة في اختبار التحول التنقل الكهربائي (EMSA) ولكن لم يتم استخدامه بانتظام لرصد نشاط البروتين أثناء عمليات الحمض النووي. يوضح هذا البروتوكول فائدة وضع العلامات على البيوتين أثناء التفاعلات الأنزيمية في المختبر، مما يدل على أن هذه التسمية تعمل بشكل جيد مع مجموعة من الاختبارات البيوكيميائية المختلفة. على وجه التحديد، تمشيا مع النتائج السابقة باستخدام النظائر المشعة 32P-المسمى ركائز، وأكد عن طريق EMSA المسمى البيوتين أن MEIOB (بروتين تشارك على وجه التحديد في إعادة تركيب meiotic) هو بروتين الحمض النووي ملزمة، أن MOV10 (وهو حل حالة طائرات الهليكوبتر RNA) الهياكل المزدوجة RNA المسمى البيوتين، وأن MEIOB يشق الحمض النووي الذي يحمل اسم البيوتين. توضح هذه الدراسة أن البيوتين قادر على استبدال 32P في مختلف الاختبارات الكيميائية الحيوية المتعلقة بالحمض النووي في المختبر.
المقدمة
وتشارك تفاعلات حمض البروتين والنوى في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل إصلاح الحمض النووي، والنسخ المتماثل، والنسخ، ومعالجة الحمض النووي الريبي، والترجمة. التفاعلات البروتينية مع تسلسل الحمض النووي محددة داخل الكروماتين مطلوبة للسيطرة الصارمة على التعبير الجيني في المستوى النسخي1. التنظيم الدقيق بعد النسخ من العديد من الترميز وعدم الترميز RNAs يتطلب تفاعلات واسعة ومعقدة بين أي بروتين وRNA2. هذه الطبقات من آلية تنظيم التعبير الجيني تشمل سلسلة من الأحداث الديناميكية بين الجزيئيات، والتي يتم تنسيقها من خلال تفاعلات العوامل النسخ / الجيني أو البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي مع أهدافها حمض نووي، فضلا عن تفاعلات ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد البروتين
- بنيات تعبير MEIOB وMOV10
- إنشاء تعبير cDNA ترميز الماوس MEIOB-A و C و E (الشكل1A)و MOV10.
- إعداد ردود الفعل سلسلة البوليمر (PCR) لكل جزء. مزيج 1 μL من cDNA الماوس (من C57BL/6 testis الماوس)، 1 ميكرولتر من dNTP، 2 μL من 10 μM التمهيدي إلى الأمام، 2 μL من 10 μM التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي، 25 ميكرولتر من 2X PCR العازلة، و 18 ميكرولتر من المقطر المزدوج H2O (ddH2O) في نهائي حجم 50 ميكرولتر.
ملاحظة: ترد في الجدول 1 المواد التمهيدية لتضخيم شظايا الجينات ميوب وموف 10. - تنفيذ ردود فعل PCR باس....
- إعداد ردود الفعل سلسلة البوليمر (PCR) لكل جزء. مزيج 1 μL من cDNA الماوس (من C57BL/6 testis الماوس)، 1 ميكرولتر من dNTP، 2 μL من 10 μM التمهيدي إلى الأمام، 2 μL من 10 μM التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي، 25 ميكرولتر من 2X PCR العازلة، و 18 ميكرولتر من المقطر المزدوج H2O (ddH2O) في نهائي حجم 50 ميكرولتر.
- إنشاء تعبير cDNA ترميز الماوس MEIOB-A و C و E (الشكل1A)و MOV10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويتضح في الشكل 1ألفهيكل البروتين من MEIOB وبنيات التعبير المستخدمة في هذه الدراسة . طيات OB في MEIOB هي هياكل صغيرة تشبه برميل التي يمكن التعرف على والتفاعل مع الأحماض النووية التي تقطعت بها السبل واحدة. واحدة من مجالات OB (aa 136-307، بناء A) يربط الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA)، والبروتين المقتطع (aa 136-178 اقتطاع، وبناء C) وشكل نقطة متحولة (R235A طفرة، بناء E) من MEIOB لم يكن لديك نشاط الحمض النووي ملزمة26. تم الإعراب عن البروتينات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التحقيق في تفاعلات الحمض النووي البروتين أمر بالغ الأهمية لفهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء العمليات البيولوجية المتنوعة. على سبيل المثال، MEIOB هو بروتين الخصية محددة ضرورية لmeiosis والخصوبة في الثدييات25،26،27. MEIOB يحتوي على مجال OB الذي يربط الحمض النووي الذي تقطعت به السبل واحد ويعرض 3 ' إلى 5 ' النشاط exonuclease26، والتي تتعلق مباشرة إلى أهميتها الفسيولوجية أثناء إعادة تركيب meiotic. على سبيل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يُعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر ب. جيريمي وانغ (جامعة بنسلفانيا) على المناقشات والمناقشات المفيدة. كما نشكر سيغريد إيكاردت على تحرير اللغة. تم دعم K. Z. من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2016YFA0500902، 2018YFC1003500) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). تم دعم L. Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502، 31871503) وبرنامج الابتكار وريادة الأعمال في مقاطعة جيانغسو. J. N. بدعم من تشجيانغ الطبية للعلوم والتكنولوجيا المشروع (2019KY499). تم دعم M. L. من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771588) وخطة المواهب الشبابية 1000.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>المعدات< / قوي > | |||
| جهاز طرد مركزي | Eppendorf ، ألمانيا | 5242R | |
| نظام التصوير الكيميائي | Tanon ، الصين | 5200 | |
| سونيفر رقمي | برانسون ، الولايات المتحدة الأمريكية | BBV12081048A | 450 واط ؛ 50/60 هرتز |
| نشاف كهربائي شبه جاف | Hoefer ، الولايات المتحدة الأمريكية | TE77XP | |
| مسدس أنبوبي | كريستال ، الولايات المتحدة الأمريكية | 3406051 | |
| الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة عبر الرابط | UVP ، USA | CL-1000 | |
| < قوي > المواد < / قوي > | |||
| Amicon Ultra-4 مرشح الطرد المركزي ؛ | ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية | UFC801096 | 4 مل / 10 كيلو |
| غشاء نايلون | Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | TG263940A | |
| ثقافة معالج TC | Corning ، الولايات المتحدة الأمريكية | 430167 | 100 مم ؛ |
| ثقافة معالج TC | Corning ، الولايات المتحدة الأمريكية | 430597 | 150 مم ؛ |
| أنابيب الأنابيب الدقيقة | AXYGEN ، USA | MCT-150-C | 1.5 مل & nbsp ؛ |
| أنابيب | كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية | 430791 | 15 مل |
| < قوي > كواشف ؛ < / قوي > | |||
| Ampicillin | SunShine Bio ، الصين | 8h288h28 | |
| الخرز المغناطيسي المضاد للعلم M2 | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific ، الولايات المتحدة | الأمريكية 591136 | |
| BCI / NBT طقم تطوير لون الفوسفاتيز القلوي | Beyotime ، الصين | C3206 | |
| CelLyticTM< / sup> M Cell Lysis الكاشف | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | 107M4071V | |
| ClonExpress II طقم استنساخ خطوة واحدة | Vazyme ، الصين | C112 | |
| للكشف عن الحمض | Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | AM9260G | 0.5 م |
| كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA | روش ، الولايات المتحدة الأمريكية | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit ؛ | Vazyme, China | DC202 | |
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme ، الصين | DC301-01 | |
| FBS | Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10437028 | |
| FLAG الببتيد | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | F4799 | |
| Glycerol | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare ، الولايات المتحدة الأمريكية | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma، الولايات المتحدة الأمريكية | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech ، الصين | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 كاشف الإرسال | الحراري العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية | L3000001 | |
| MgCl2< / sub> | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | AM9759 ؛ | 5 M |
| NP-40 | Amresco ، الولايات المتحدة الأمريكية | M158-500ML | |
| Opti-MEM متوسط | Gibco ، الولايات المتحدة | الأمريكية 31985062 | |
| PBS | Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية | N251B | |
| Streptavidin القلوي فوسفاتيز | Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية | V5591 | |
| TBE | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15567027 | 1 M ، PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer ؛ | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15568025 | 1 M ، PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech ، الصين | A600560 |
المراجع
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
