التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus 'الفسفورية رموز ' مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.
المقدمة
تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات4 وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin5.
وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التمهيدي استراتيجية التصميم
- تصميم مواد أولية لإدخال الجينات ذات الأهمية في pBiT1.1-C [TK/LgBiT]، pBiT2.1-C [TK/SmBiT]، pBiT1.1-N [TK/LgBiT] وpBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
- حدد واحدًا على الأقل من هذه المواقع الثلاثة كواحد من اثنين من إنزيمات التقييد الفريدة اللازمة للاستنساخ الاتجاهي نظرًا لوجود codon توقف في الإطار يقسم موقع الاستنساخ المتعدد كما هو موضح في الشكل 111.
- إدراج تسلسل النيوكليوتيد في المواد التمهيدية كما هو مبين في الجدول 1 لترميز بقايا الرابط المبينة باللون الأحمر في الجدول 211.
- بالنسبة لناقلات pBiT1.1-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم رصد التفاعلات بين GPCR نموذجي واثنين من isoforms β-arrestin. تم إجراء الجلوكاجون مثل مستقبلات الببتيد (GLP-1r) المنشآت باستخدام التمهيديات التي تحتوي على مواقع تقييد إنزيم NheI وEcoRI واستنساخها في ناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] بينما في حالة بيتا-arrestins، كان اثنان من ناقلات إضافية تستخدم pBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] باستخدام مواقع تقييد الإنزيم BgIII و EcoRI في حالة β-arrestin2 وNheI وXhoI في حالة β-arrestin1. تم نقل خلايا HEK293 باستخدام 50 نانوغرام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-arrestin معقدة بضع دقائق بعد الوصول إلى الحد الأقصى إشارة مضيئة.
من أجل الحصول على أفضل حساسية في نظام فحص التكملة الهيكلية، تم فحصه مع أربعة اتجاهات مكانية مختلفة بين ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحوث (NRF- 2015M3A9E7029172) من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المضادات الحيوية البنسلين ستربتومايسين | Welgene | LS202-02 | بكتيرية البنسلين / الستربتومايسين |
| حاضنة | JEIO Tech | IB-05G | (سترة هوائية) ، |
| وسط زراعة الخلايا | Welgene | LM 001-05 | DMEM وسط زراعة الخلايا |
| وسط تعداء ثقافة الخلية | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X وسط |
| حاضنة CO2 | NUAIRE | NU5720 | حاضنة CO2 للحرارة |
| المباشرة حمام مائي رقمي | Lab Tech | LWB-122D | مختبر حمام مائي رقمي تكنولوجيا |
| DNA Polymerase قراءة إثبات | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA تنقية طقم تنقية الحمض | النووي Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit البلازميد الصغير |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| تقييد إنزيم BglII | نيو إنجلاند Biolabs | R0144L | BglII |
| مخزن تقييد الإنزيم | نيو إنجلاند Biolabs | B72045 | CutSmart 10X تقييد |
| إنزيم عازلة EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| تقييد الإنزيم NheI | نيو إنجلاند Biolabs | R01315 | NheI |
| تقييد الإنزيم XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco كندا | 12483020 | جل مصل الأبقار الجنيني |
| / PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel / PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| المجهر الخفيف | أوليمبوس | CKX53SF | CKX53 المجهر أوليمبوس |
| كاشف تعداء الدهون | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek / Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 قارئات صفيحة دقيقة متعددة الأوضاع |
| نظام NanoBiT | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS نظام بدء |
| التشغيل Nanoluciferase الركيزة | Promega | N2012 | Nano-Glo نظام فحص الخلية الحية |
| PCR Thermal Cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | محلول بولي إل ليسين |
| تريبسين EDTA | جيبكو | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| ثقافة الخلايا البيضاء 96 لوحة بئر Corning | 3917 | لوحة الفحص 96 لوحة بئر |
المراجع
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
