يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات

6.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59994

⸱

يونيو 28, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Korea University

في هذه المقالة

ملخص

التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.

الملخص

التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus 'الفسفورية رموز ' مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.

المقدمة

تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات4 وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin5.

وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام6 وأيضا الآثار الجانبية الشديدة في بعض الأدوية مثل المورفين7.

الأساليب الحالية المستخدمة لرصد هذه التفاعلات عادة لا تمثل المستويات الذاتية الفعلية للبروتينات في الدراسة، في بعض الحالات أنها تظهر إشارة ضعيفة، وتبييض الصور واعتمادا على GPCR قد يكون من الصعب من الناحية الفنية لإعداد8. هذا الفحص التكامل الهيكلي الجديد يستخدم ناقلات المروج التعبير المنخفض من أجل تقليد المستويات الفسيولوجية الذاتية ويوفر حساسية عالية بالمقارنة مع الأساليب الحالية9. باستخدام هذا النهج، كان من الممكن بسهولة توصيف مستقبلات Galanin-β-arrestin € وأيضا β-arrestin2-clathrin التفاعلات10. ويمكن استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع إلى أي GPCR ذات أهمية خاصة حيث β-arrestins تلعب وظيفة فسيولوجية رئيسية أو إشاراتها ذات الصلة في بعض الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التمهيدي استراتيجية التصميم

  1. تصميم مواد أولية لإدخال الجينات ذات الأهمية في pBiT1.1-C [TK/LgBiT]، pBiT2.1-C [TK/SmBiT]، pBiT1.1-N [TK/LgBiT] وpBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
  2. حدد واحدًا على الأقل من هذه المواقع الثلاثة كواحد من اثنين من إنزيمات التقييد الفريدة اللازمة للاستنساخ الاتجاهي نظرًا لوجود codon توقف في الإطار يقسم موقع الاستنساخ المتعدد كما هو موضح في الشكل 111.
  3. إدراج تسلسل النيوكليوتيد في المواد التمهيدية كما هو مبين في الجدول 1 لترميز بقايا الرابط المبينة باللون الأحمر في الجدول 211.
  4. بالنسبة لناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] وpBiT2.1-C [TK/SmBiT]، تأكد من أن الدليل التمهيدي 5 يحتوي على codon ATG وتسلسل توافق الآراء Kozak قوية (GCCGCCACC).
  5. لpBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] ناقلات, تأكد من أن التمهيدي 3 € يحتوي على وقف codon.
    ملاحظة: يحتوي كل ناقل على مروج HSV-TK لتقليل الارتباط غير المحدد وتقليل القطع الأثرية التجريبية، كما أن كل ناقل لديه كاسيت تعبير لمقاومة أمبيسيلين في البكتيريا.

2. PCR

  1. إعداد وتشغيل ردود فعل PCR لتضخيم الحمض النووي إدراج الجين ذات الفائدة باستخدام التمهيديات المصممة من الخطوة 1. من المهم استخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة للحد من الطفرات.
  2. استخدم بالضبط الترتيب التالي لإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل PCR. إضافة 35.5 ميكرولتر من الماء المقطر، و5 ميكرولتر من 10 x عازلة للبوليميراز، و5 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مليمتر لكل منهما)، و1 ميكرولتر من قالب البلازميد (200 نانوغرام/لتر)، و1.25 ميكرولتر من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر) و1 ميكرولتر من بوليميراز عالية الدقة (5 U/μL).
  3. باستخدام دراجة حرارية إعداد برنامج تضخيم الحمض النووي التالي.
    1. تشوه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. كرر 25 مرة الدورة الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لكل 1 كيلوبت في الدقيقة ليتم تضخيمها.
    3. تشغيل ملحق النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. عقد العينات في 4 درجة مئوية داخل دراجة حرارية.
      ملاحظة: من المستحسن للغاية استخدام بوليميراز عالية الدقة من أجل تقليل الطفرات نقطة خاصة تلك التي تحدث أثناء تضخيم تسلسل طويل. كما يصبح amplicon أطول، ودرجة الدقة في النسخ المتماثل للحمض النووي يقلل. لرد فعل PCR، اختر درجة حرارة الصلب على أساس درجة حرارة ذوبان المنطقة حيث القلة تهجين مباشرة مع قالب الحمض النووي وليس مع كل تسلسل التمهيدي.
  4. PCR تنقية المنتج
    1. عزل المنتج PCR من بقية رد فعل PCR باستخدام مجموعة من الشركة المصنعة للتفضيل12. منتج PCR جاهز الآن لتقييد الهضم.

3. هضم الحمض النووي

  1. لهضم المنتج PCR إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي.
    1. باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 12 ميكرولتر من الماء المقطر.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
    3. من الخطوة 2.4 إضافة 30 μL من المنتج PCR
    4. وأخيرا، إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
    5. مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. للهضم بلازميد المتلقي إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي:
    1. باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 23 ميكرولتر من الماء المقطر.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
    3. إضافة 15 ميكرولتر من بلازميد المتلقي (200 نانوغرام / ميكرولتر).
    4. إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
    5. مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: من المهم استخدام 3 ميكروغرام من بلازميد المتلقي من أجل الحصول على ما يكفي من المواد بعد تنقية هلام أغاروز الحمض النووي. ومن المهم أيضا أن تترك هضم الحمض النووي بين عشية وضحاها باستخدام كلا الإنزيمات للحصول على كفاءة استنساخ عالية.

4. الحمض النووي أغاروز هلام تنقية والاستنساخ

  1. إعداد هلام أغاروز 1٪ لتشغيل بلازميد الحمض النووي المهضوم وإدراج والمضي قدما في خفض العصابات المقابلة. وبمجرد تنقية المتجهات المقابلة ونطاقات الإدراج12، حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. إجراء ربط الحمض النووي لصهر إدراج إلى بلازميد المتلقي.
  3. إعداد ردود الفعل الربط من حوالي 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي بما في ذلك 50 نانوغرام من ناقلات بلازميد.
  4. إعداد نسبة بلازميد-إدراج المستلم من حوالي 1:3; يمكن حسابها باستخدام آلة حاسبة إدراج ناقلات13.
  5. إعداد عناصر تحكم سالبة في نفس الوقت. على سبيل المثال، فإن ربط الحمض النووي بلازميد المتلقي دون أي إدراج سوف توفر معلومات حول مدى الخلفية من بلازميد المتلقي غير مهضوم أو الذاتي الربط موجود.

5- تحويل الحيوانات المستنسخة

  1. وضع أنبوب من الخلايا المختصة DH5α من الثلاجة في -80 درجة مئوية ونقلها على الفور على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد ذلك الوقت، تأخذ 55 درجة مئوية من الخلايا المختصة DH5α وإضافة 4 ميكرولتر من رد فعل الربط ومزيج عن طريق نفض الغبار الأنبوب وتخزينها على الجليد لمدة 45 دقيقة.
  3. وضع الأنبوب في حمام مائي كان يسخن سابقا في 42 درجة مئوية ل48 ق بالضبط والحصول على الفور أنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 3 دقائق أخرى.
  4. إضافة 600 درجة مئوية من المرق لوريا (LB) المتوسطة التي كانت تسخن سابقا في 37.5 درجة مئوية وحضانة مع الهز لمدة 1 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
  5. نقل 200 درجة مئوية في لوحة أجار تحتوي على أمبيسيلين 100 ميكروغرام / مل وتنتشر بلطف على السطح مع يتم امتصاص السائل في الغالب.
  6. احتضان لوحات بين عشية وضحاها لرؤية المستعمرات صباح اليوم التالي. يجب أن يكون البلازميد المتلقي على لوحة إدراج المستعمرات أكثر بكثير من لوحة بلازميد المتلقي وحدها.

6. عزل بلازميد الانتهاء

  1. اختيار 3-10 المستعمرات البكتيرية الفردية ونقل إلى 1 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) وحضانة لمدة 6 ساعة.
  2. خذ 200 ميكرو لتر من التعليق البكتيري ونقل إلى 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على نفس تركيز أمبيسيلين كما هو الحال في الخطوة 6.1 وحضانة بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية مع هز في 200 دورة في الدقيقة.
  3. باستخدام تنقية مجموعة الحمض النووي miniprep، إجراء تنقية الحمض النووي miniprep باستخدام 5 مل من LB نمت بين عشية وضحاها بعد تعليمات الشركة المصنعة14.
  4. ولتحديد الأربطة الناجحة، قم بإعداد ردود فعل تفاعل PCR بنفس الطريقة الواردة في القسم 2 باستخدام الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من الخطوة 6-3 كقالب بنفس المواد التمهيدية كما هو الحال في القسم 2 أثناء الـ PCR الأول. سوف استنساخ إيجابية تنتج منتجات PCR مع الحجم المقابل.
  5. بعد تنقية الحمض النووي الإعدادية الكبيرة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية، وإجراء عملية هضم تقييد التشخيص من 500 نانوغرام من الحمض النووي النقي مع الإنزيمات المستخدمة خلال خطوة الاستنساخ وتشغيل المنتجات المهضومة على هلام أغاروز 1٪. يجب أن يكون هناك نطاقين: واحد حجم المتجه وواحد في حجم إدراج جديد.
  6. تحقق من تسلسل الإنشاء عن طريق التسلسل باستخدام التمهيديات التالية: إلى الأمام 5 '- aaggtgacgcgtgggcctcgaac-3' وعكس 5 '-gcatttttttcactccttagtt-3'.
    ملاحظة: عندما يتم نسخ الحمض النووي باستخدام PCR، هناك دائماً إمكانية حدوث أخطاء أثناء التضخيم حتى عند استخدام بوليميراز عالية الدقة، وبالتالي من المهم جداً تسلسل المنشآت النهائية.

7. التغوط والتعبير عن البروتين

  1. في لوحة بيضاء مغلفة سابقا بولي-L-يسين 96 جيدا، وأداء البذر الخلية يوم واحد قبل transfection في 2.5 × 104 خلايا لكل بئر باستخدام دولبكو تعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ من المصل البقري الجنين، 100 U / مل البنسلين G، و 100 ميكروغرام / 100 ميكروغرام / مل ستربيومسين.
  2. استخدم فقط الآبار الداخلية الـ 60 لتقليل إمكانية التدرجات الحرارية عبر اللوحة وآثار الحافة من التبخر. إضافة 200 درجة مئوية من المياه المقطر المعقمة إلى 36 آبار خارجية و 150 درجة مئوية في المساحات بينالآبار والحضانة بين عشية وضحاها عند 37.5 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون 2.
  3. في صباح اليوم التالي إجراء التغوط باستخدام 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي (50 نانوغرام كل بناء).
  4. إعداد أربع تركيبات بلازميد مختلفة (مستقبلات: β-arrestin) وفقا للرقم 2ب.
  5. لكل تركيبة بلازميد استخدام 20 €L من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES باستخدام 0.3 ميكرولتر من الكاشف الانجليب الدهون لكل بئر.
  6. إضافة 20 درجة مئوية من خليط الكاشف الحمض النووي الكاشف الدهون إلى كل بئر وخلط لوحة في دوائر لمدة 10 ثانية.
  7. تغيير المتوسطة الطازجة بعد حضانة 6 ساعة في 37.5درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  8. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة في 37.5 درجةمئوية و 5٪ CO 2.

8. رصد مستقبلات بيتا-arrestin € التفاعلات في خلايا HEK293

  1. يستنشق المتوسطة وإضافة 100 درجة مئوية من الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES إلى كل بئر والسماح لللوحة استقرار في RT لمدة 10 دقيقة.
  2. إعداد الركيزة furimazine عن طريق الجمع بين 1 حجم من الركيزة 100X مع 19 مجلدات من LCS تخفيف العازلة (20 أضعاف تخفيف)11، وخلق مخزون 5X لخلط مع وسط ثقافة الخلية.
  3. إضافة 25 درجة مئوية من 5x furimazine إلى كل بئر وتخلط بلطف في دوائر لمدة 10 ثانية.
  4. قياس الإنارة لمدة 10 دقيقة لتثبيت إشارة في RT.
    ملاحظة: باستخدام إشارة خط الأساس هذه لتطبيع استجابة كل بئر سوف يساعد على الحد من التباين الناجم عن الاختلافات في عدد الخلايا المطلية في البئر، وكذلك الاختلافات في كفاءة الانف، الخ. بمجرد حسابها، متوسط الاستجابة العادية من تكرار الآبار لعلاج المخدرات معين.
  5. إعداد 13.5x حل ligand في تعديل النسر الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المخزنة مؤقتا مع HEPES.
  6. بالنسبة للتجارب في درجة حرارة الغرفة مع 10 ميكرولتر من 13.5x ligand بالإضافة، إضافة المركبات باستخدام الحقن أو ماصة متعددة القنوات وخلط لوحة باليد أو باستخدام شاكر المداري (20 ثانية في 200 دورة في الدقيقة).
  7. بالنسبة للتجارب عند درجة حرارة 37.5 درجة مئوية مع إضافة 10 ميكرولتر من 13.5 x ligand، استخدم الحقن لتوزيع المركبات والاختلاط باستخدام الهزاز المداري للأداة. في حالة عدم استخدام الحقن، قم بإزالة اللوحة من مقياس الإنارة، وأضف الأربطة واخلط اللوحة باليد أو باستخدام شاكر مداري (20 s at 200 rpm).
    ملاحظة: استخدام الحقن وشاكر داخل أداة الكشف لتقليل تقلبات درجة الحرارة المرتبطة بإزالة لوحة من مقياس الإنارة. ويمكن استخدام أجهزة قياس الإضاءة القياسية من أعلى مقاعد البدلاء لهذا الفحص. استخدم وقت تكامل من 0.25-2 s.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم رصد التفاعلات بين GPCR نموذجي واثنين من isoforms β-arrestin. تم إجراء الجلوكاجون مثل مستقبلات الببتيد (GLP-1r) المنشآت باستخدام التمهيديات التي تحتوي على مواقع تقييد إنزيم NheI وEcoRI واستنساخها في ناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] بينما في حالة بيتا-arrestins، كان اثنان من ناقلات إضافية تستخدم pBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] باستخدام مواقع تقييد الإنزيم BgIII و EcoRI في حالة β-arrestin2 وNheI وXhoI في حالة β-arrestin1. تم نقل خلايا HEK293 باستخدام 50 نانوغرام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-arrestin معقدة بضع دقائق بعد الوصول إلى الحد الأقصى إشارة مضيئة.

من أجل الحصول على أفضل حساسية في نظام فحص التكملة الهيكلية، تم فحصه مع أربعة اتجاهات مكانية مختلفة بين ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحوث (NRF- 2015M3A9E7029172) من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المضادات الحيوية البنسلين ستربتومايسينWelgeneLS202-02بكتيرية البنسلين / الستربتومايسين
حاضنةJEIO TechIB-05G(سترة هوائية) ،
وسط زراعة الخلاياWelgeneLM 001-05DMEM وسط زراعة الخلايا
وسط تعداء ثقافة الخليةGibco31985-070Optimem 1X وسط
حاضنة CO2NUAIRENU5720حاضنة CO2 للحرارة
المباشرة حمام مائي رقميLab TechLWB-122Dمختبر حمام مائي رقمي تكنولوجيا
DNA Polymerase قراءة إثباتELPIS BiotechEBT-1011PfU DNA polymerase
DNA تنقية طقم تنقية الحمضالنووي CosmogenetechCMP0112miniprepLaboPass Purificartion Kit البلازميد الصغير
DNA Taq PolymeraseEnzynomicsP750nTaq DNA polymerase
تقييد إنزيم BglIIنيو إنجلاند BiolabsR0144LBglII
مخزن تقييد الإنزيمنيو إنجلاند BiolabsB72045CutSmart 10X تقييد
إنزيم عازلة EcoRINew England BiolabsR3101LEcoRI-HF
تقييد الإنزيم NheIنيو إنجلاند BiolabsR01315NheI
تقييد الإنزيم XhoINew England BiolabsR0146LXhoI
مصل الأبقار الجنينيGibco كندا12483020جل مصل الأبقار الجنيني
/ PCR DNA MiniKitReal Biotech CorporationKH23108HiYield Gel / PCR DNA MiniKit
LigaseELPIS BiotechEBT-1025T4 DNA Ligase
المجهر الخفيفأوليمبوسCKX53SFCKX53 المجهر أوليمبوس
كاشف تعداء الدهونInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000
LuminometerBiotek / Fisher Scientific12504386Synergy 2 قارئات صفيحة دقيقة متعددة الأوضاع
نظام NanoBiTPromegaN2014NanoBiT PPI MCS نظام بدء
التشغيل Nanoluciferase الركيزةPromegaN2012Nano-Glo نظام فحص الخلية الحية
PCR Thermal CyclerEppendorf6336000015Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysineSigma AldrichP4707-50MLمحلول بولي إل ليسين
تريبسين EDTAجيبكو25200-056Trysin EDTA 10X
ثقافة الخلايا البيضاء 96 لوحة بئر Corning3917لوحة الفحص 96 لوحة بئر
حاضنة الأساسية زراعة الخلايا

المراجع

  1. Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
  4. Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
  5. Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
  6. Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
  7. Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
  8. Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
  9. Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  10. Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
  11. Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
  12. Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
  13. New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
  14. Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
  15. Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
  16. ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
  17. Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تفاعلات مستقبلات البروتين جي المقترنة (GPCR) مع بيتا-أريستينمقايسة التكامل البنيوياكتشاف أدوية مستقبلات البروتين جي المقترنة (GPCR)دراسة التفعيل المتحيزنظائر بيتا-أريستينبروتوكول بناء البلازميدتقنية قياس التألق الكيميائيتجارب إضافة الربيطةمنحنيات الاستجابة للجرعة
رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.