يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة لدراسة تشكيل دي نوفو من مجالات الكروماتين

5.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

أغسطس 23, 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

في هذه المقالة

ملخص

تم تصميم هذه الطريقة لمتابعة تشكيل مجالات الكروماتين بوساطة PRC2 في خطوط الخلايا، ويمكن تكييف الطريقة مع العديد من الأنظمة الأخرى.

الملخص

تنظيم وهيكل مجالات الكروماتين فريدة من نوعها لسلالات الخلايا الفردية. وقد يؤدي سوء تنظيمها إلى فقدان الهوية الخلوية و/أو المرض. على الرغم من الجهود الهائلة، فإن فهمنا لتكوين وانتشار مجالات الكروماتين لا يزال محدوداً. وقد درست مجالات الكروماتين في ظل ظروف الحالة الثابتة، والتي لا تؤدي إلى متابعة الأحداث الأولية أثناء إنشائها. هنا، نقدم طريقة لإعادة بناء مجالات الكروماتين بشكل غير صحيح واتباع إعادة تشكيلها كدالة للوقت. على الرغم من أنه، تطبيق لأول مرة على حالة تكوين المجال الكروماتين القمعية بوساطة PRC2، فإنه يمكن تكييفها بسهولة مع مجالات الكروماتين الأخرى. وسيؤدي تعديل و/أو الجمع بين هذه الطريقة وتكنولوجيات علم الجينوم والتصوير إلى توفير أدوات لا تقدر بثمن لدراسة إنشاء مجالات الكروماتين بقدر كبير من التفصيل. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة سوف تحدث ثورة في فهمنا لكيفية تشكيل مجالات الكروماتين والتفاعل مع بعضها البعض.

المقدمة

الجينوم Eukaryotic هي منظمة للغاية والتغيرات في إمكانية الوصول الكروماتين يتحكم مباشرة في نسخ الجينات1. يحتوي الجينوم على أنواع متميزة من مجالات الكروماتين، والتيترتبط بنشاط النسخ ووقت النسخ المتماثل 2،3. تتراوح هذه المجالات الكروماتين في الحجم من عدد قليل من كيلوباسي (كيلو بايت) إلى أكثر من 100 كيلو بايت وتتميز بإثراء في تعديلات الهيستون متميزة4. والأسئلة الرئيسية هي: كيف تتشكل هذه المجالات وكيف يتم نشرها؟

يتم تعزيز واحدة من مجالات الكروماتين الأكثر تميزا من خلال نشاط مجمع بوليكومب القمعية 2 (PRC2). PRC2 هو مجمع متعدد الوحدات الفرعية يتكون من مجموعة فرعية منمجموعة بوليكومب (PcG) من البروتينات 5،6،ويحفز أحادية، دي، وثلاثي ة من يسين 27 من الهيستون H3 (H3K27me1/me2/me3)7،8، 9،10. ويرتبط H3K27me2/me3 مع حالة الكروماتين القمعية، ولكن وظيفة H3K27me1 غير واضح6،11. واحدة من المكونات الأساسية لPRC2، تطوير ectoderm الجنينية (EED)، يربط إلى المنتج النهائي من الحفز PRC2، H3K27me3، من خلال قفصه العطرية وهذه الميزة النتائج في تحفيز allosteric من PRC212،13. نشاط PRC2 الأنزيمي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الهوية الخلوية أثناء التنمية كما التعبير غير المناسب لبعض الجينات التنموية التي يتم بطلان لسلالة معينة، سيكون ضارا5،6 . وبالتالي، فإن تفكيك الآليات التي تعزز بها PRC2 تشكيل مجالات الكروماتين القمعية في الثدييات له أهمية أساسية لفهم الهوية الخلوية.

تم تنفيذ جميع الأنظمة التجريبية السابقة المصممة للتحقيق في تكوين نطاق الكروماتين بما في ذلك مجالات الكروماتين بوساطة PRC2، في ظل ظروف ثابتة الحالة، والتي هي غير قادرة على تتبع الأحداث التي تتكشف من تكوين المجال الكروماتين في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نظام خلوي غير قابل للتشغيل الذي يراقب التوظيف الأولي ونشر مجالات الكروماتين. وعلى وجه التحديد، نركز على تتبع تشكيل نطاقات الكروماتين القمعية التي تتوسط فيها PRC2 التي تضم H3K27me2/3. هذا النظام الذي يمكن التقاط التفاصيل الميكانيكية لتكوين المجال الكروماتين، يمكن تكييفها لتشمل مجالات الكروماتين الأخرى، مثل المجالات التي درست على نطاق واسع التي تتألف إما H2AK119ub أو H3K9me. وإلى جانب علم الجينوم وتقنيات التصوير، ينطوي هذا النهج على إمكانية معالجة مختلف المسائل الرئيسية في بيولوجيا الكروماتين بنجاح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

توليد أجهزة الإنقاذ من الـ EED غير القابلة للاستنساخ

1. خلية ثقافة

  1. استخدام الخلايا الجذعية الجنينية خالية من التغذية C57BL/6 (mESCs) تمتلك ترانسجين CreERT2 المتكاملة بشكل لا بأس به، والتي يمكن أن تنتقل إلى النواة عند إعطاء 4-هيدروكسيتاموكسيفين (4-OHT)13.
  2. تنمو mESCs في التقليدية ESC المتوسطة14،15، تستكمل مع 1000 U / مل LIF ، 1 μM ERK مثبطات PD0325901 و 3 μM GSK3 المانع CHIR99021. لمتوسطة ESC التقليدية، استخدم DMEM بالضربة القاضية التي تحتوي على 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 mM L-الجلوتامين، 1X البنسلين / العقديات و 0.1 مليون متر 2-mercaptoethanol.
  3. استخدام لوحات المغلفة مع 0.1٪ محلول الجيلاتين لmESCs زراعة.

2. توليد كلونال EED بالضربة القاضية (KO) mESCs

  1. تصميم دليل RNAs (gRNAs) لحذف Exon 10 و Exon 11 من نسخة محلية من EED في أجهزة الإس إس إي باستخدام أداة تصميم كريسبر في Benchling16. EED-KO-gRNA-1 يستهدف الإنترون على الفور المنبع من exon 10 وEED-KO-gRNA-2 يستهدف الإنترون على الفور المصب من Exon 11. التطبيق المتزامن لهذه gRNAs يحذف كل من Exon 10 و Exon 11 من قبل نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ).
  2. استنساخ gRNAs في pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) باستخدام تعليمات في رانوآخرون.
  3. في شكل لوحة 6 جيدا، transfect 2 × 105 mESCs مع 1 ملغ من كل EED-KO-gRNA-1 و EED-KO-gRNA-2 (انظر جدولالمواد) باستخدام كاشف الانف عبر التغوط باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تغيير وسائل الإعلام 24 ساعة بعد التغوط.
  4. بعد يومين من الانتراب، عزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). نتوقع أن تختلف كفاءة التغوط حول 10-30٪. فرز حوالي 5 × 105 خلايا لالتقاط خلايا إيجابية GFP كافية للطلاء.
  5. طبق MESCs GFP إيجابية معزولة في لوحات 15 سم المغلفة مسبقا مع الجيلاتين 0.1٪ (10-20 x103 خلايا لكل لوحة) لاختيار مستعمرة.
  6. قم بزراعة الخلايا في وسط ESC لمدة أسبوع تقريبًا حتى تظهر مستعمرات واحدة. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.
  7. اختيار ما لا يقل عن 48 مستعمرات باستخدام 20 ميكروغرام تلميح micropipette. كشط على المستعمرة في حين aspirating في طرف micropipette. لا تقم بفصل المستعمرة إلى خلايا واحدة. نقل المستعمرة إلى accutase التي تحتوي على (20 مل) 96 لوحة جيدا.
  8. احتضان المستعمرات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل جميع الخلايا.
  9. إضافة 200 مل من وسائل الإعلام ESC في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  10. تُمزج الخلايا جيداً وتُمزج في لوحتين منفصلتين من 96 بئراً باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  11. استخدام واحدة من لوحات جيدا 96 للكتابة الجينية والحفاظ على الآخر ينمو حتى يتم الانتهاء من علم الوراثة. استخدام محلول استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من لوحة بئر 96 باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  12. استخدام النماذج الجينية التمهيدية Gnt_EED-KO-up و Gnt_EED-KO_down، والتي تمتد على الموقع المحذوفة وأداء PCR علم الوراثة مع بوليميراز الحمض النووي طاقة بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن أيضا ً استخدام أنواع أخرى من بوليميراز الحمض النووي للكتابة الجينية، ومع ذلك، فإن بوليميراز الحمض النووي من طاقة التقوى يوفر الراحة حيث يمكن تحميل تفاعل PCR مباشرة على جل عند استخدام حاجز التفاعل الملون الخاص به.
    1. مراقبة منتج الحمض النووي من انخفاض الوزن الجزيئي في الخلايا مع حذف متجانسة نسبة إلى حالة من النوع البري (WT).
      ملاحظة: لإنشاء الخلايا الخالية PRC2، الحذف المتجانس للطاردات 10 و 11 ضروري لزعزعة استقرار وتدهور EED، وهي وحدة فرعية أساسية من PRC2الأساسية 13. كفاءة استهداف كريسبر حوالي 10%.
  13. التحقق من حذف EED exon 10 و 11 وفقدان بروتين EED بواسطة تسلسل Sanger والنشاف الغربي، على التوالي.
  14. تأكيد استنفاد EED و H3K27me2/me3 من الكروماتين في خلايا EED KO بواسطة ChIP-seq باستخدام الأجسام المضادة ضد H3K27me2/me3 وEED. استخدم البروتوكول الوارد في Oksuz وآخرون، 201715 لتجارب ChIP-seq.

3. هندسة EED خروج المغلوب mESCs لإيواء Cre-ERT2 على أساس التعبير EED inducible

  1. تصميم gRNA (EED-gRNA-inducible) لإدخال قطع داخل الإنترون بعد exon 9 من EED باستخدام أداة تصميم كريسبر في Benchling16 (انظر جدول المواد).
  2. استنساخ gRNAs في pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) باستخدام تعليمات في رانوآخرون.
  3. تصميم الحمض النووي قالب المانحة التي تتألف من EED cDNA تسلسل بعد exon 9 وC-المحطة الطرفية العلم-HA علامة المنبع من تسلسل T2A-GFP، كل ذلك في الاتجاه العكسي فيما يتعلق تسلسل الجينات الذاتية.
    1. يحيط بالكاسيت مع مقبل لصق وتسلسل تعدد الإنكار المتداخلة بين مواقع loxP المقلوبة غير المتجانسة (lox66 و lox71)18.
    2. وتشمل ما لا يقل عن 500 نقطة أساس من الأسلحة homology من كل نهاية. تقسيم قالب المانحين إلى 2 أجزاء من شظايا الجينات gBlocks (انظر gBlock-1، gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" و gBlock-2-قفص متحولة "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") وتجميعها في PCR متجه حادة باستخدام استنساخ جيبسون بعد تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: gblock-2 يحتوي على بقايا العطرية (Y365) داخل قفص EED التي هي مهمة للتفاعل مع H3K27me312. gBlock-2-Wt يحتوي على بقايا نوع البرية، في حين أن gblock-2-قفص متحولة يحتوي على قفص متحولة من EED (Y365A)، غير قادر على ربط H3K27me3. ويشار إلى إنقاذ EED WT اللاإمتز ايندوب كما i-WT-r وeED غير قابللل للنسخ يتم الإشارة إلى الإنقاذ EED قفص متحولة كما i-MT-r للراحة.
  4. في شكل لوحة 6-جيدا، transfect 2 × 105 mESCs مع 1 ملغ من gRNA (EED-gRNA-inducible) و 1 ملغ من قوالب المانحين (i-WT-r أو i-MT-r) باستخدام كاشف الانف المتحول وعزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام FACS.
  5. اتبع الخطوات 2.3-2.11 لعزل المستعمرات الفردية الجاهزة للكتابة الجينية للاستهداف الناجح.
  6. استخدام النماذج الجينية التمهيدية Inducible_Genotype-FW-1 وInducible_Genotype-REV-1، والتي تمتد على شريط إدراج وأداء PCR علم الوراثة باستخدام بوليميراز الحمض النووي طاقة.
    ملاحظة: كفاءة الاستهداف لـ CRISPR حوالي 10%.
    1. تأكد من التكامل الصحيح للكاسيت من قبل PCR باستخدام Inducible_Genotype-FW-2 وInducible_Genotype-REV-2 التمهيديات، والتي هي خارج الأسلحة الهولوجية.
      ملاحظة: التكامل المتجانس للكاسيت ضروري لإنجاز الإنقاذ الفعال للEED. لاحظ أن الخلايا مع التكامل المتجانس سوف تنتج منتج الحمض النووي كبيرة واحدة بالمقارنة مع EED WT، والتي سوف تنتج منتج قصير.
  7. تأكيد تكامل الكاسيت بواسطة تسلسل Sanger.
  8. تأكيد التقليب من كاسيت والتعبير عن EED وغيرها من المكونات الأساسية PRC2 (على سبيل المثال، EZH2 وSUZ12) على إدارة 4-OHT من قبل النشاف الغربية.
  9. تأكيد التعبير عن T2A-GFP ونسبة الوجه عن طريق قياس التدفق. لاحظ أن التعبير عن GFP يدل على التقليب من كاسيت والتعبير عن EED.

4. بعد النوى وانتشار نشاط PRC2 على الكروماتين

  1. تأكد من أن i-WT-r و i-MT-r mESCs ليس لديها تعبير متسرب من GFP عن طريق قياس التدفق. في حالة التعبير راشح من GFP، عزل الخلايا السلبية GFP من قبل FACS قبل بدء التجربة.
  2. قم بتوسيع الـ i-WT-r وi-MT-r mESCs إلى خمس لوحات بحجم 15 سم (5x 106 خلايا لكل لوحة).
  3. حث التعبير عن WT أو قفص متحولة EED عن طريق إدارة 0.5 mM 4-OHT لمدة 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة و 8 أيام (لوحة واحدة 15 سم لكل شرط). تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة للعلاجات أطول من 12 ح. عزل الخلايا المعاد دمجها بنجاح من قبل FACS باستخدام GFP. ضبط وقت العلاجات بحيث يتم جمع جميع الشروط في وقت واحد.
  4. أداء ChIP-seq لH3K27me2، H3K27me3 للتحقيق في ترسبها الزمنية للكروماتين ردا على إعادة التعبير عن WT أو قفص متحولة EED. استخدام بروتوكول ChIP-seq بما في ذلك إعداد المكتبة مفصلةفي Oksuz وآخرون.
  5. استخدام التحكم في ارتفاع في كل عينة للسماح للمقارنة الكمية بين نقاط زمنية مختلفة19.
    1. للتحكم في ارتفاع، استخدم الكروماتين من Drosophila melanogaster (في نسبة 1:50 إلى الكروماتين المستمدة من mESC) وكذلك Drosophila محددة H2Av الأجسام المضادة (1 ميكرولتر من الأجسام المضادة H2Av لكل 4 ميكروغرام من كروماتين دروسوفيلا وفقا ل تعليمات الشركة المصنعة) في كل عينة.
    2. إعداد الكروماتين من دروسوفيلا بطريقة مماثلة لتلك التي من mESCs باستخدام البروتوكول المفصل في Oksuz وآخرون.
  6. خريطة تسلسل يقرأ لChIP-seq إلى مم10 الجينوم مع بوتي 2 باستخدام المعلمات الافتراضية20.
  7. تطبيع الماوس ChIP-seq يقرأ إلى ارتفاع في Drosophila قراءة التهم21. حساب عامل التسوية ارتفاع في باستخدام الصيغة التالية: 1 × 106/unique Drosophila قراءة التهم. نتوقع الحصول على حوالي 1 × 106Drosophila قراءة التهم و 20 × 106 الماوس قراءة التهم لكل تجربة.
    1. لا تقم بتضمين كروماتين دروسوفيلا عند تسلسل عينات الإدخال.
  8. استخدام أداة جينومكوف من bedtools لتحويل ملف بام إلى bedgraph22. المقبل، وتحويل bedgraph إلى ملف bigwig باستخدام أداة bedGraphToBigWig من USCS23،24. راجع البرنامج النصي التالي:
    gen ="المسار إلى الجينوم mm10"
    chr ="المسار إلى أحجام الكروموسوم mm10"
    inp_bam ="مسار لإدخال ملف بام "
    ضرب ="حساب عامل التطبيع ارتفاع في"
    كراسي السرير جينومكوف -bg-مقياس $multiply-ibam $inp_bam-g $gen > output.bedGraph
    فرز -k1،1 -k2،2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    بيدغرافتوبيجويج output_sorted.bedالرسم البياني $chr output.bw
  9. تصور كثافات قراءة ChIP-seq عن طريق تحميل ملفات bigwig على متصفح الجينوم USCS24.

5. رصد ظهور ونمو بؤر H3K27me3 في نوى mESCs

  1. لوحة 1X 104 mESCs في 8 جيدا غرفة الشرائح المغلفة مسبقا مع 0.1٪ الجيلاتين.
  2. في اليوم التالي، ابدأ في إجراء دورات تعريف ية متتالية 4-OHT (0.5 mM) لجمع الخلايا التي تعبر عن EED للنقاط الزمنية المشار إليها (0 ساعة و12 ساعة و24 ساعة و36 ساعة). تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة للعلاجات أطول من 12 ساعة.
  3. إصلاح mESCs مع 4٪ paraformaldehyde في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
  4. Permeabilize الخلايا مع PBS / 0.25٪ تريتون X-100 في RT لمدة 30 دقيقة.
  5. منع الخلايا مع PBS / 5٪ مصل الحمار / 0.1٪ تريتون X-100 (حظر العازلة) في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. تمييع H3K27me3 الأجسام المضادة الأساسية 1:500 في المخزن المؤقت حظر وإضافة إلى الخلايا.
  7. حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي، قم بإجراء 3 عمليات تذما مع PBS/0.1% Triton X-100.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 595) 1:1000 في المخزن المؤقت حظر وإضافة إلى الخلايا.
    1. تنفيذ جميع الحضانة في الظلام في الخطوات التالية كما الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع اليكسا فلور حساسة للضوء.
  10. احتضان الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في RT.
  11. إجراء 3 عمليات الشهي مع PBS /0.1% تريتون X-100.
  12. تمييع DAPI (1 ملغ / مل) 1:4000 مع PBS / 0.1٪ تريتون X-100 وإضافة إلى الخلايا.
  13. حضانة الخلايا مع DAPI لمدة 10 دقيقة في RT.
  14. جبل الخلايا مع جبل أكوا.
  15. صورة الخلايا مع الفحص المجهري البؤري في التكبير 63X.
  16. عملية والزائفة اللون الصور باستخدام توزيع ImageJ، فيجي25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مخطط عام لنظام الإنقاذ المشروط
ويبين الشكل 1 مخطط الاستهداف لإنقاذ خلايا EED KO بشروط مع إما WT أو قفص متحولة (Y365A) EED التي يتم التعبير عنها من موضع EED الذاتية. بعد الخروج EED، وهي وحدة فرعية أساسية من PRC2 التي هي ضرورية لاستقرارها والنشاط الأنزيمي،يتم تقديم كاسيت داخل الإنترون بعد exon 9 من EED (الشكل 1). يتكون الكاسيت من تسلسل cDNA 3 المتبقية من EED، في الاتجاه العكسي فيما يتعلق بتسلسل الجينات الذاتية.  يحيط بالشريط مواقع loxP المقلوبة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نهج قوي نحو فهم التفاصيل الميكانيكية أثناء تشكيل مجال كروماتين معين، هو أولا تعطيل المجال ومن ثم تتبع إعادة بنائه في التقدم داخل الخلايا. يمكن إيقاف العملية مؤقتاً في أي وقت أثناء إعادة الإعمار لتحليل الأحداث الجارية بالتفصيل. ولم تتمكن الدراسات السابقة المتعلقة بمجالات الكروماتين من حل مثل هذه الأحداث لأنها أجريت في ظل ظروف ثابتة (مثل مقارنة النوع البري وخروج الجينات من المغلوب). هنا، نحدد الخطوط العريضة لنظام لتقييم التكوين الديناميكي لمجالات الكروماتين، كما يُبرز ذلك من خلال توظيف ونشر المجالات القمعية التي تتوسط فيها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

D.R. هو أحد مؤسسي شركة كوكبة المستحضرات الصيدلانية وFulcrum Therapeutics. ويعلن المؤلفون أن ليس لهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتورس ل. فالى، د. أوزاتا وه. مو على مراجعة المخطوطة. ويدعم مختبر D.R. من قبل معهد هوارد هيوز الطبي والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA199652 و R01NS100897).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(Z) -4-هيدروكسي تاموكسيفين (5 مجم)سيجماH7904-5MGلتحريض تعبير EED
16٪ محلول مائي بارافورمالديهايد (10 × 10 مل) علومالمجهر الإلكتروني15710للتألق المناعي
2-mercaptoethanolLifeTechnologies21985-023لثقافة mESCs
2٪ محلول جيلاتينSigmaG1393-100mlل mESCs ثقافة
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech / FISHERAT 104-500لثقافة mESCs
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) Jacksonimmunoresaerch711-585-152للتألق المناعي
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER / VWR41799-008للتألق المناعي
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKللتأمل المناعي
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 ملغLife TechD1306
لمثبط ERK المناعي الفلور ، PD0325901Stemgent04-0006لثقافة mESCs
ESGRO المؤتلف فأر LIF بروتينMillipore / FisherESG1107 لثقافة mESCs
الخلايا الجذعية FBS المؤهلةأتلانتاS10250لثقافة mESCs
، Gibson Assembly Master MixNEBE2611Lلاستنساخ قالب المتبرع
مثبط GSK3 ، CHIR99021Stemgent04-0004لثقافة mESCs
H3K27me2 (D18C8) أرنب mABخلية إشارات9728Sللجسم المضاد ل ChIP-seq
H3K27me3خليةالإشارات 9733Sللجسم المضاد ل ChIP-seq
Histone H2Av الجسم المضاد (pAb)الشكل النشط39715التحكم في سبايك ل ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018لثقافة mESCs
L-glutamineSigmaG7513لثقافة mESCs
Lipofectamine 2000LifeTech11668019للتعداء
MangoTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21079للتنميط الجيني PCR
مصل الحمار العادي (10 مل)Jackson ImmunoResearch017-000-121للتألق المناعي
Penicillin-StreptomycinSigma / RocheP0781لثقافة mESCs
pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) Addgene48138لاستنساخ gRNA
محلول استخراج الحمض النووي السريعLucigenQE0905Tللتنميط الجيني PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Zero Blunt PCR SimulatorThermo FisherK270020لاستنساخ قالب
المانح<قوي > بادئات / gBlocks < / قوي>
EED-KO-gRNA-1تسلسل: ctctggctactgtcaactag. أزواج gRNAs للتخلص من EED في C57BL / 6 ESCs لأنظمة i-WT-r و i-MT-r.
تسلسل EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. أزواج gRNAs للتخلص من EED في C57BL / 6 ESCs لأنظمة i-WT-r و i-MT-r.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA والمانح لإنشاء نظام i-WT-r في خلفية EED-KO.
i-WT-r مانحhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA ومانح لإنشاء نظام i-WT-r في خلفية EED-KO.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA والمانح لإنشاء نظام i-WT-r في خلفية EED-KO.
i-MT-r مانحhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA ومانح لإنشاء نظام i-MT-r في خلفية EED-KO.
<قوي > التنميط الجيني الاشعال < / strong>
Gnt-EED-KO-FW-1تسلسل: ctgtaggctgccatctgtga. سينتج الأليل من النوع البري منتجا يبلغ 1.9 كيلو بايت. سينتج أليل خروج المغلوب منتجا 200 نقطة أساس.
تسلسل Gnt-EED-KO-REV-1: agccagggctacacagagaa. سينتج الأليل من النوع البري منتجا يبلغ 1.9 كيلو بايت. سينتج أليل خروج المغلوب منتجا 200 نقطة أساس.
تسلسل Inducible_Genotype-FW-1: tgcagtgaaacaaatttggaa. عند إدخال الكاسيت ، ستنتج البادئات 1863 نقطة أساس. سينتج الأليل من النوع البري منتجا ~ 200 نقطة أساس.
تسلسل Inducible_Genotype-REV-1: gagaggggtggcactgtaaaa. عند إدخال الكاسيت ، ستنتج البادئات 1863 نقطة أساس. سينتج الأليل من النوع البري منتجا ~ 200 نقطة أساس.
تسلسل Inducible_Genotype-FW-2: ccccctctctctccttct. عند إدخال الكاسيت ، ستنتج الاشعال 3200 نقطة أساس. سينتج الأليل من النوع البري منتجا يبلغ 1560 نقطة أساس.
تسلسل Inducible_Genotype-REV-2: atgcctgggtgaatgaa. عند إدخال الكاسيت ، ستنتج الاشعال 3200 نقطة أساس. سينتج الأليل من النوع البري منتجا يبلغ 1560 نقطة أساس.
Kit التسلسل المحفز التسلسل المحفز

المراجع

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تكوين نطاقات الكروماتينالكروماتين بوساطة PRC2تعطيل CRISPR-Cas9تحليل قياس التدفق الخلويتحليل ChIP-seqالمجهر الفلوريالخلايا الجذعية الجنينية للفئرانحذف جين EEDالحث بـ 4-Hydroxytamoxifenترسيب H3K27me3
طريقة لدراسة تشكيل دي نوفو من مجالات الكروماتين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.