مقالة منهجية

التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني للاوعيه الدموية

5.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60493

⸱

نوفمبر 18, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

في هذه المقالة

ملخص

لقياس تدفق الاوعيه الدقيقة من السرعة العالية تسلسل صوره تدفق الشعرية ، قمنا بتطوير الموظفين (التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني) البرمجيات. ويقوم الموظفون ، عبر حقل الصورة الكاملة وبمرور الوقت ، بتقييم سرعات التدفق ويولد سلسله من الخرائط المكانية المرمزة بألوان لأغراض التصور والمخرجات الجدولية للتحليلات الكمية.

الملخص

التغييرات في سرعه تدفق الدم والتوزيع هي حيوية في الحفاظ علي الانسجه والجسم الانصهار استجابه لاحتياجات الخلوية المختلفة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون ظهور العيوب في دوران الاوعيه الدقيقة مؤشرا أساسيا في تطور الامراض المتعددة. وقد جعلت التطورات في التصوير البصري انترافيتال المجهري (IVM) نهجا عمليا ، مما يسمح بالتصوير علي المستوي الخلوي ودون الخلوي في الكائنات الحية بسرعة عاليه مع مرور الوقت. ومع ذلك ، وعلي الرغم من اهميه الحفاظ علي الانسجه الكافية ، ونادرا ما يتم توثيق التغير المكاني والزماني في تدفق الشعرية. في النهج القياسي ، يتم اختيار عدد صغير من الشرائح الشعرية للتصوير علي مدي فتره زمنيه محدوده. لقياس التدفق الشعري بشكل شامل بطريقه غير متحيزة قمنا بتطوير التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني (الموظفين) ، وهو ماكرو لبرنامج تحليل الصور المفتوح المصدر من فيجي. باستخدام تسلسلات الصور عاليه السرعة من الحقول الكاملة لتدفق الدم داخل الشعيرات الدموية ، والموظفين تنتج الصور التي تمثل الحركة علي مر الزمن تسمي kymographs البيانية لكل فاصل زمني لكل قطعه الاوعيه الدموية. ويحسب الموظفون السرعات من المسافة التي تتحرك بها خلايا الدم الحمراء بمرور الوقت ، وينتجون بيانات التسارع كسلسلة من الخرائط المكانية المرمزة بألوان لأغراض التصور والمخرجات الجدولية للتحليلات الكمية. في كبد الفار العادي ، يحلل الموظفون الاختلافات العميقة الكمية في سرعه التدفق بين مناطق بيريسينترال والمداخل داخل اللوصات. حتى أكثر غير متوقعه هي الاختلافات في سرعه التدفق ينظر بين جيوب التي هي جنبا إلى جنب والتقلبات التي شوهدت داخل أجزاء الاوعيه الدموية الفردية علي مدي ثوان. الموظفين هو أداه جديده قويه قادره علي توفير رؤى الرواية من خلال تمكين قياس ديناميات المكانية المعقدة للتدفق الشعرية.

المقدمة

يلعب الاوعيه المجهرية دورا حاسما في علم وظائف الجسم ، وضمان الانصهار الفعال للانسجه في ظل الظروف المتغيرة. يرتبط ضعف الاوعيه الدموية المجهرية مع العديد من الظروف بما في ذلك الامراض القلبية الوعائية علي المدى الطويل والوفاات ، وتطوير الخرف، والمرض من الكبد والكلي علي حدسواء ،التالي هو عامل رئيسي للاهتمام في مجموعه واسعه منالتحقيقات الطبيةالحيوية في حين تم استخدام تقنيات متعددة لتقييم perfusion الانسجه ، فقط انترافيتال المجهر تمكن جمع البيانات في الدقة الزمانيه والمكانية اللازمة لتوصيف تدفق الدم علي مستوي الشعيرات الدموية الفردية.

يمكن تصور تدفق الاوعيه الدقيقة في المجهر الفلوري اما عن طريق حركه الفلورسنت المجهرية أو عن طريق حركه خلايا الدم الحمراء علي خلفيه من الغشاء-التي تهدد علامات الفلورسنت (علي سبيل المثال ، فلوريسسينتلي المسمية ديكسان أو الزلال)6،7. يمكن ان يكون تدفق الاوعيه الدموية المجهرية في طبقات الخلايا السطحية باستخدام المجهر المجهري ، أو في العمق باستخدام اما المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات. ومع ذلك ، فان معدلات تدفق الشعرية هي بحيث لا يمكن عموما القبض علي مرور خلايا الدم الحمراء بسرعات اقل من 60 الإطارات/ثانيه. وبما ان معظم المجهر الضوئي بالليزر والمجاهر متعددة الفوتونات تتطلب 1 – 5 ثانيه لمسح حقل الصورة الكاملة ، فان هذه السرعة يمكن ان تنجز بشكل عام فقط عن طريق الحد من مجال الرؤية ، وأحيانا إلى خط مسح واحد8. عمليه الحد من القياسات لشرائح شعريه مختاره (1) لديها القدرة علي إدخال التحيز الاختيار و (2) يجعل من المستحيل للتقاط التغاير المكاني والزماني في معدلات تدفق الدم الشعرية. وفي المقابل ، يمكن جمع الصور من الشبكات الشعرية بسرعات تتجاوز 100 fps باستخدام ويديفيلد المجاهر الرقمية مجهزه العلمية التكميلية أكسيد المعادن أشباه الموصلات (scmos) كاميرات9،10. هذه النظم غير مكلفه ، الشائعة في المختبرات الطبية الحيوية النموذجية تجعل من الممكن للصورة تدفق الاوعيه الدقيقة عبر الشبكات ثنائيه الابعاد بأكملها ، أساسا بشكل مستمر. ثم تصبح المشكلة واحده من العثور علي نهج تحليل قادره علي استخراج بيانات كميه ذات مغزى من مجموعات الصور الضخمة والمعقدة المتولدة عن المجهر الفيديو عاليه السرعة.

لتمكين تحليل بيانات تدفق الحقول الكاملة قمنا بتطوير الموظفين ، والبرمجيات الجديدة لتحليل الصور التي يمكن ان تقيس باستمرار تدفق الاوعيه الدقيقة في جميع انحاء حقول المجهر كامله من سلسله الصور التي تم جمعها بسرعة عاليه11. ويتوافق هذا النهج مع مجموعه متنوعة من النظم التجريبية المختلفة وطرائق التصوير ، وينفذ برنامج تحليل صور الموظفين كمجموعه أدوات ماكرة لتنفيذ فيجي ل ImageJ12. المبدا الأساسي المستخدم هنا لتصور تدفق الاوعيه الدموية المجهرية هو ان أولا ، يجب توفير بعض التباين لتكون قادره علي صوره خلايا الدم الحمراء داخل الشعيرات الدموية. في دراساتنا ، يتم توفير التباين من خلال مسبار الفلورسنت السائبة التي يتم استبعادها من قبل خلايا الدم الحمراء. ويمكن بعد ذلك تحديد سرعه تدفق من النزوح من خلايا الدم الحمراء التي تظهر كوصمه عار السلبية داخل فلوريسسينتلي المسمي البلازما في الصور التي تم جمعها بسرعة عاليه من الحيوانية الحية8. ثم نستخدم الموظفين لجعل قطع المسافة علي طول كل قطعه شعريه علي فترات متعددة من الوقت يسمي kymographs ، ثم الكشف عن المنحدرات الموجودة في kymographs13، ومن تلك المنحدرات حساب معدلات تدفق ميكرووعائي. ويمكن تطبيق هذا النهج علي الصور التي تم جمعها من اي سرير الشعرية التي يمكن الوصول اليها للتصوير. هنا نحن وصف تطبيق IVM والموظفين لدراسات تدفق الدم في الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة علي جميع التجارب الحيوانية وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه إنديانا ، وانضم إلى دليل اللجنة النرويجية لرعاية واستخدام الماشية.

1. التحضير الجراحي لانترافيتال المجهري

ملاحظه: هذه ليست جراحه للبقاء علي قيد الحياة. وبمجرد بدء القسم 1 "التحضير الجراحي لانترافيتال المجهري" ، لا يمكن إيقاف العمل مؤقتا حتى الانتهاء من القسم 2 "المجهر الانترافيتال".

  1. التاقلم 9 – 10 من العمر أسبوع الذكور C57BL/6 الفئران ، لمده 4 أيام علي الأقل وبسرعة لمده 16 ساعة قبل الدراسات.
  2. تزن الحيوانية ، مع 5 ٪ ايزوفلواني ومكان علي وساده التدفئة للحفاظ علي درجه حرارة الجسم. استخدام معدل تدفق الأكسجين من 1 – 2 لتر/دقيقه والحفاظ علي التخدير مع 1-2 ٪ ايزوفلواني. التحقق من ردود الفعل عن طريق قرصه اصبع القدم. مراقبه درجه الحرارة باستخدام ترمومتر المستقيم. رصد معدل ضربات القلب والتنفس بصريا.
  3. عندما يكون التخدير مستقرا ، حلق المنطقة لوضع التعليب الوداجي والمنطقة تحت القفص الصدري للتعرض للكبد.
  4. للحصول علي التعليب الوداجي ، وجعل 1 سم اليسار شق بطني 1-2 سم تحت الفك الماوس. مسح بعيدا كل الدهون واللفافة المحيطة بالوريد الوداجي. التعادل قباله الطرف الامامي من الوداجي باستخدام 06 خياطه سلسله لمنع النزيف.
    1. جعل شق صغير في الوريد الوداجي والشريحة قني (30 ز س 1/2 في ، ابره) ، حامل ابره وأنابيب البولي إيثيلين (0.011 × 0.024 بوصه2 تعلق علي محول كعب العروة ومليئه بالمحلول الملحي 0.9 ٪) في حوالي 1 سم ، وأمنه في الطرف الخلفي من الوداجي باستخدام سلسله خياطه 0-6.
  5. باستخدام كانولا الوداجي تسليم 70 كده فلوريسئين ديكديكان (إلى جرعه 30 مغ/كغ عن طريق الحقن من 0.1 مل من محلول 9 ملغ/مل في المحلول الملحي).
  6. تعرض الكبد للتصوير عن طريق اجراء شق بطول 4 – 6 سم عبر الجذع ، 1 – 2 سم تحت منتصف القفص الصدري.
  7. وضع الرطب (غارقه في 0.9 ٪ المالحة) 2 × 2 بوصه 2 الشاش الإسفنج تحت فص الكبد الجانبي الأيسر. وضع الشريط علي هامش النافذة الزجاجية من الطبق المسطح الشفة 40 ملم وتطبيق لاصق السيانولات إلى الشريط. اضغط علي لوحه الزجاج إلى الكبد واستخدام القطن يميل الضغط علي الشاش في الغراء علي الشريط للتقليل من حركه الانسجه لمجهر.
  8. نقل الحيوانية إلى مرحله المجهر. يضاف المحلول الملحي المعقم بنسبه 0.9% إلى الطبق المسطح للحفاظ علي رطوبة الكبد طوال جلسة التصوير. الحفاظ علي درجه الحرارة في 36-37 درجه مئوية عن طريق منصات التدفئة التي شنت علي خشبه المسرح ، وساده التدفئة وضعت علي الحيوانية وسخان الهدف.

2. انترافيتال المجهر

  1. قم باجراء المجهر الانترافيتال علي منظار مقلوب بالنقش مزود بكاميرا فيديو قادره علي التقاط الصور عاليه السرعة.
    ملاحظه: هنا ، مصباح قوس زينون ، والاثاره فلوريسئين محدده (480-500 نانومتر) والانبعاثات (507-543 نانومتر) مرشحات ، خطه فلور 20x ، N.A. 0.75 المياه الغمر الهدف ، وكاميرا sCMOS عاليه السرعة وقد استخدمت.
  2. حدد منطقه الاهتمام لتحليل تدفق الدم الشعرية باستخدام الحد الأدنى من الاضاءه.
  3. تعيين وقت التعرض قصيرة بما يكفي للكاميرا لتكون قادره علي الحصول علي 100 fps. تعيين مستوي الاضاءه لتصور بوضوح ظلال خلايا الدم الحمراء وطوبولوجيا الاوعيه الدموية في حين تجنب أيضا السمية الضوئية والتصوير الضوئي لمسبار الفلورسنت.
  4. جمع الصور بمعدل 100 اطارا في الثانية. تعيين دقه الكاميرا بكسل بين ~ 0.65 و ~ 1.3 μm/بكسل. تعيين حجم الإطار بين 512 x 512 و 1024 × 1024 بكسل. تعيين عمق بت بين 8 و 16 بت. استخدم الدقة الأعلى وحجم الإطار وعمق البت الذي لا يزال يسمح بجمع صوره 100 fps علي النظام.
  5. حفظ ملفات السلاسل الزمنيه كسلسلة من ملفات TIF أو كتنسيق الكاميرا/المجهر الأصلي إذا كانت الاشكال الحيوية14 في فيجي يمكن فتح ملفات التنسيق الأصلي.
  6. صوره مناطق متعددة مع مرور الوقت. الحفاظ علي الماوس علي مرحله المجهر لمده تصل إلى 2 ح. موت ببطء الماوس في نهاية التصوير.
    ملاحظه: ستستند مده السلسلة الزمنيه إلى الموازنة بين الحاجة إلى الصورة لفتره زمنيه تحتضن التغير ، في حين لا تؤثر علي قابليه الانسجه للاستمرار. قد تكون مده السلسلة الزمنيه أيضا تمليها اعتبارات حجم الملف; سلسله زمنيه 1 دقيقه من 1024 × 1024 بكسل 16-بت الصور التي تم جمعها في 100 fps سيتم إنشاء ملف الذي هو 12 غيغابايت في الحجم. قد تملي اعتبارات حجم الملف أيضا حجم الإطار وعمق البت المستخدم. ولا توجد حدود واضحة للحجم داخل الموظفين.

3. تعريف شبكه الاوعيه الدموية باستخدام TrakEM2 في فيجي

ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا بعد حفظ العمل في اي نقطه في القسم 3.

  1. تحميل وتثبيت فيجي من https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    ملاحظه: تم استخدام الإصدار 1.51 n من فيجي لهذا المشروع ، ويمكن تحميلها من https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. لاحظ انه في Windows ، يجب تثبيت فيجي في مساحة المستخدم وليس في "ملفات البرامج".
  2. فتح ملف الفيلم في فيجي باستخدام ملف > فتح أو استخدام ملف > استيراد > تسلسلالصورة. حدد صوره واحده من الصور الثابتة بين التنفس حيث من السهل رؤية طبولوجيا شبكه الاوعيه الدموية. حدد صوره > تكرار وتكرار الصورة المفردة المحددة (وليس المكدس) وحفظ الصورة في مجلد جديد. لا تقم بتضمين مسافات في أسماء الملفات أو المجلدات.
  3. قم باعداد مشروع TrakEM2 فارغ جديد عن طريق تحديد ملف > جديد > TrakEM2 (فارغ). حدد المجلد الجديد الذي يحتوي علي الصورة المفردة من الفيلم كمجلد المشروع. سيتم فتح windows TrakEM2.
  4. انقر بزر الماوس الأيمن في منطقه العمل الرئيسية وحدد استيراد > استيراد الصورة. انتقل إلى الصورة المفردة المحفوظة في الخطوة 3.3 وحددها.
  5. انقر بزر الماوس الأيمن في منطقه العمل الرئيسية مره أخرى وحدد عرض > تغيير الحجم التلقائي لمجموعه القماش/الطبقة . انقر بزر الماوس الأيسر في نافذه العمل الرئيسية. ستملا الصورة منطقه العمل.
  6. لتحديد المناطق في الصورة التي تحتوي علي شبكه الاوعيه الدموية ، تحديد قائمه منطقه الاعداد في TrakEM2. في اطار TrakEM2 أصغر (قالب ، كائنات المشروع ، طبقات) انقر بزر الماوس الأيمن علي "• اي شيء". حدد أضافه قائمه منطقه تابعه جديده >.
  7. في اطار TrakEM2 أصغر ، اسحب "قالب > اي شيء" إلى "مشروع كائنات > مشروع". ثم اسحب "قالب > اي شيء > • قائمه المنطقة" علي "كائنات المشروع > مشروع > اي شيء". ضمن "كائنات المشروع > مشروع > اي شيء" ، • ستكون قائمه المناطق الآن موجودة.
  8. في الإطار TrakEM2 الرئيسي ضمن علامة التبويب المسافة Z، تم إنشاء شريط يسمي قائمه المنطقة. انقر لتحديده. في الإطار TrakEM2 الرئيسي أيضا تحديد أداه الرسام. اضغط علي Shift ولفه عجله الماوس لتحديد حجم مناسب لفرشاه الطلاء ، علي سبيل المثال ، أصغر من قطر الاوعيه الدموية. لحفظ اعداد TrakEM2 الصحافة التحكم + S مفاتيح.
  9. طلاء شبكه الاوعيه الدموية باستخدام أداه فرشاه الرسام. لمسح اضغط باستمرار علي Alt اثناء استخدام أداه الرسام. لا تقم بتضمين مناطق خارج التركيز. حفظ غالبا باستخدام التحكم + S.
  10. عند وضع العلامات علي شبكه الاوعيه الدموية كامله ، انقر بزر الماوس الأيمن في النافذة TrakEM2 الرئيسية وحدد تصدير ≫ العلماء كما تسميات (tif). في النافذة المنبثقة حدد مقياس 100% وتصدير كافة المنطقة قائمه. إغلاق TrakEM2 windows واختر نعم لحفظ المشروع.
  11. سيتم فتح صوره الارييون وقد تظهر كصوره سوداء فارغه. في القائمة فيجي الرئيسية حدد الصورة > ضبط > السطوع/التباين. في النافذة B & C اضغط علي زر السيارات وسوف تصبح مرئية الفيلسوف. في القائمة فيجي الرئيسية حدد الصورة > جداول البحث > عكس لوط. حفظ هذه الصورة من التسميات السوداء علي خلفيه بيضاء وإغلاق الصورة.
  12. فتح ملف التسميات في فيجي. حدد الإضافات ≫ الهيكل العظمي > كثير. حفظ الصورة بقايا ك tif. استخدم الملف .tif الهيكل العظمي كاحد ملفات الإدخال المطلوبة لتشغيل تحليل تدفق الموظفين. عند حفظ الملف ، لا تستخدم مسافات في اسم الملف.
  13. تحرير ملف الهيكل العظمي يدويا حسب الحاجة ، عن طريق وضع فجوه (باستخدام أداه الطلاء) في رسم الخط علي سبيل المثال في المواقع التي لم يتم القبض علي فروع في الاوعيه الدموية لأنها تخرج من الطائرة صوره.

4. اعداد تسلسل الفيلم لتحليل الموظفين

  1. فتح ملف الفيلم في فيجي باستخدام ملف > فتح أو ملف > استيراد > تسلسل الصورة. حدد فتره زمنيه لتسلسل الصورة لتحليل التدفق (يمكن ان تكون ثواني إلى دقائق ، مئات إلى عشرات آلاف من الإطارات) حيث ظلت وضعيه الانسجه مستقره مع مرور الوقت ، باستثناء اثناء التنفس.
  2. حدد الصورة > تكرار الجزء المحدد من التسلسل وتكراره عن طريق كتابه أرقام إطارات البداية والنهاية. تحقق من المعايرة المكانية والزمانيه للصورة ضمن خصائص الصورة > وصححها إذا لزم الأمر. احفظ ملف الصورة علي انه TIF (أو باعتباره AVI غير مضغوط). هذا الفيلم. tif مطلوب كملف إدخال لتشغيل تحليل الموظفين. لا تقم بتضمين مسافات في اسم الملف.

5. تثبيت وحدات الماكرو الموظفين في فيجي

ملاحظه: (هام) مجلدات متعددة ضمن الدلائل الفرعية مجلد فيجي لها أسماء ملفات متشابهة ، بعض الأحرفالكبيرة، بعض لا. تاكد من تحديد المجلدات الصحيحة عند تثبيت الموظفين.

  1. تحميل وحدات الماكرو الموظفين من https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. لتثبيت ، أولا فتح المجلد فيجي.
    1. علي Windows العثور علي المجلد حيث يتم تثبيت فيجي في مساحة المستخدم ، الأكثر شيوعا علي سطح المكتب. علي MacOS العثور علي رمز فيجي في مجلد التطبيقات ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد فتح.
  3. في المجلد فيجي ، افتح مجلد الإضافات. داخل مجلد الإضافات ، افتح مجلد وحدات الماكرو. نسخ فريق العمل. ijm في هذا المجلد وحدات الماكرو: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
  4. في المجلد فيجي ، افتح مجلد الإضافات. نسخ STAFF_Dir في هذا المجلد الإضافات: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. جره.
  5. في المجلد فيجي ، افتح مجلد وحدات الماكرو. داخل مجلد وحدات الماكرو هذا ، افتح مجلد التشغيل التلقائي. نسخ STAFF_Loader. ijm في هذا المجلد التشغيل التلقائي: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader.
  6. بدء تشغيل فيجي والتحقق من تثبيت الماكرو. للتحقق من التثبيت ، حدد الإضافات > وحدات الماكرو. عند تثبيت بشكل صحيح سوف تشمل القائمة المنسدلة: فتح مشروع إنشاء, تحليل الهيكل العظمي, تحرير الفواصل الزمنيه, تحليل تدفق وإنتاج خريطة المكانية.
  7. إذا لم تكن هذه الأوامر موجودة في القائمة وحدات الماكرو ، حدد الإضافات > وحدات الماكرو > تثبيت، افتح المجلد fiji\plugins\macros ، حدد الملف. ijm الفريق ، ثم انقر فوق OK زر. يجب ان تظهر الأوامر الآن في الإضافات > القائمة وحدات الماكرو .

6. قياس تدفق الاوعيه الدموية باستخدام الموظفين

  1. إنشاء مشروع جديد.
    1. حدد الإضافات > وحدات الماكرو ≫ فتح-إنشاء مشروع واتبع المطالبات لإنشاء أو تحديث ملف تكوين.
    2. من القائمة فتح-إنشاء المشروع ، انتقل إلى وحدد دليل المشروع ، مجلد ملف الإدخال وملفات الإدخال الفيلم. tif والهيكل العظمي. tif. تحرير أسماء ملفات الإخراج التي يتم ملؤها تلقائيا إذا لزم الأمر.
    3. قيم الإدخال لأقصر طول القطعة (20 μm) ، السرعة القصوى تقاس (2,000 μm/s) والسرعة القصوى المعينة (1,000 μm/s).
      ملاحظه: يعطي المنتج من أقصر طول القطعة والإطارات في الثانية سرعه التدفق القصوى التي يمكن نظريا ان تقاس. اعلي سرعات تدفق الشعرية المبلغ عنها في الأدب حوالي 2,000 μm/s15. في الكبد, لاحظنا ان سرعه تدفق الشعرية عموما متوسط حوالي 300 μm/ثانيه ونادرا ما تجاوز 1,000 μm/ثانيه.
    4. اكتب القيم الخاصة بحجم البكسل ومعدل الإطار لتسلسل الصور (من بيانات تعريف الصورة أو الملاحظات التجريبية). تتطلب هذه القيم إدخال المستخدم. تحقق من مربع تصحيح وميض إذا كانت الصور لديها وميض كثافة الخلفية الدورية.
    5. حدد المعلمات للحصول علي أفضل تصور للبيانات. حدد السرعة القصوى التي تم تعيينها لتضمين حوالي 95% من البيانات بحيث يتم تعيين البيانات عبر النطاق الكامل لمقياس اللون. الموظفين خرائط القيم المتطرفة عاليه السرعة إلى نهاية عاليه السرعة للجدول اللون.
  2. حلل الهيكل العظمي.
    1. حدد الإضافات > وحدات الماكرو > تحليل الهيكل العظمي. سيتم فتح الملف .tif الهيكل العظمي سيتم فتح وتشغيل أداره منطقه الاهتمام (ROI).
      ملاحظه: تحليل الهيكل العظمي يصنف كل بكسل من قبل عدد من الجيران اما في نقطه نهاية ، عند تقاطع ، أو داخل قطعه. لكل شريحة رقم تعريف (رقم المعرف) ، يتم تسجيل طول فرع معايره والإحداثيات المكانية للفرع ينتهي.
    2. انتظر حتى تظهر معرفات المقطع علي الهيكل العظمي ، وقائمه الشرائح التي ستظهر في أداره عائد الاستثمار ، والمنبثقة التي تشير إلى ان ملف أداره ROI للهيكل العظمي يتم حفظه. انقر فوق موافق.
    3. تحقق من انه بين حركات التنفس ، يبقي الهيكل العظمي فوق حيث تمر خلايا الدم الحمراء من خلال الشعرية (علي سبيل المثال ، وليس الحافة وليس خارج الشعرية). عرض المقاطع المسمية كتراكب علي الفيلم ، عن طريق فتح ملف الفيلم ، ثم سحب الملف المضغوط ROI إلى الفيلم المفتوح. تشغيل الفيلم مع الشرائح المضافة.
  3. حدد الفواصل الزمنيه.
    1. حدد الإضافات > وحدات الماكرو > تحديد فواصل زمنيه . انتظر بينما يقوم الماكرو بإنشاء كيموجراف من قطعه واحده خلال الوقت الإجمالي للفيلم. من هذا kymograph ، يحدد المستخدم الفواصل الزمنيه للتحليل. استخدام التحكم + + مفاتيح لزيادة حجم كيموجراف إذا لزم الأمر.
    2. يتم تنشيط أداه تحديد المستطيل تلقائيا. ارسم مستطيلا حول كل فاصل زمني. نقطه انطلاق جيده لطول الفاصل الزمني هو الفاصل الزمني 1 – 2 s بين التنفس ، والتي هي واضحة كما المناطق الافقيه غير واضحة في kymograph.
    3. انقر فوق المفتاح T أو الزر أضافه في أداره ROI لتسجيل تحديدات الفاصل الزمني. كرر العديد من الفواصل الزمنيه حسب الرغبة. قم باجراء التحديدات بشكل تسلسلي من اعلي (أو يسار) إلى أسفل (أو إلى اليمين) من kymograph.
    4. تقييم خيارات المعلمات (من فتح-إنشاء المشروع) عن طريق تحديد عدد قليل من الفواصل الزمنيه (3 إلى 4) واستكمال التحليل لتلك الفواصل فقط ، منذ تحليل تدفق (الخطوة التالية) يمكن ان يستغرق ساعات لمجموعات البيانات الكبيرة.
    5. انقر فوق موافق في جعل عائد الاستثمار لكل اطار الفاصل الزمني عند الانتهاء. تظهر نافذه منبثقة عند حفظ الفواصل الزمنيه المحددة في مجلد Project. انقر فوق موافق.
  4. تحليل التدفق.
    1. حدد الإضافات > وحدات الماكرو ≫ تحليل تدفق وتحليل المعلمات تدفق مربع الحوار فتح وعرض القيم التي تم إدخالها في المشروع فتح-إنشاء الخطوة. تحرير إذا لزم الأمر ثم انقر فوق موافق.
    2. فتح مربع الحوار " أسماء ملفات الإخراج " وعرض الأسماء التي تم إدخالها في الخطوة "إنشاء مشروع فتح". تحرير إذا لزم الأمر ثم انقر فوق موافق.
    3. يفتح مربع حوار يسالك عما إذا كان المستخدم مستعدا للبدء في التحليل. انقر فوق موافق سيبدا التحليل. الانتظار لمربع حوار الذي يفتح للاشاره عند اكتمال "تحليل التدفق".
      ملاحظه: يعتمد الوقت المطلوب علي سرعه المعالج وحجم مجموعه البيانات.
    4. تاكد من تخزين ملفات النتائج كملفات جدول تنسيق .csv في مجلد Project.
      ملاحظه: تتضمن ملفات الإخراج: segment_velocities يحتوي علي قيم السرعة التي تحتوي علي قيم موجبه وسالبه تشير إلى اتجاه التدفق. تحتوي الخلايا التي تمثل شرائح اقل من الحد الأدنى للطول علي النص SHORT. تحتوي الخلايا ذات قيم السرعة الأكبر من السرعة المقاسه القصوى علي النص OUT (لاعلي). kym_ang. csv يحتوي علي زوايا كيموجراف تقاس بواسطة المساعد الاتجاهي في فيجي. good_fit يحتوي علي الخير من تناسب منحني لتوزيع الزوايا تقاس من كل kymograph. الخير الفقراء من نوبة (< 0.8) يمكن ان تشير إلى نقاط فرع خفيه في قطعه ، والتغير في السرعة خلال الفترة الزمنيه ، مصباح أو غرفه ضوء وميض.
    5. تحقق للتحقق من ان الsegment_velocities .csv يحتوي علي بعض القيم OUT. إذا كان هناك عدد كبير من القيم OUT ، تحقق من ان الحد الأدنى لطول المقطع للتحليل لا يقل عن 15-20 μm ، ثم أعد تشغيل تحليل التدفق. إذا كانت الsegment_velocities الجديدة .csv لا تزال تحتوي علي نسبه كبيره من قيم OUT ، فتحقق من مربع تصحيح الوميض ، ثم أعد تشغيل تحليل التدفق.
  5. إنتاج الخرائط المكانية.
    1. حدد الإضافات > وحدات الماكرو > إنتاج الخريطة المكانية سيتم فتح نافذه معلمات الخريطة المكانية ، وعرض القيم التي تم إدخالها في خطوه المشروع المفتوحة الإنشاء. تحرير إذا لزم الأمر ، أو للمتابعة حدد موافق.
    2. ويتم إنشاء المشاهدة كتسلسل زمني للخرائط المكانية لسرعات التدفق باستخدام اللون الذي يشير إلى سرعات التدفق. الإخراج في شكل مكدس صوره .tif مع صوره واحده لكل فاصل زمني. مرر خلال المكدس .tif لتصور التباين المكاني والزماني في التدفق. حفظ المكدس كملف AVI (غير مضغوط لقابليه الحد الأقصى) للمشاركة كفيلم.

7-التحليل الكمي باستخدام ناتج الموظفين

  1. افتح الملف .csv الsegment_velocities في جدول بيانات أو برنامج تحليل إحصائي. تحتوي هذه القيم علي علامة ايجابيه أو سالبه تشير إلى اتجاه التدفق نسبه إلى نقاط بدء/إيقاف تلك الشريحة (المسجلة في ملف ROI المقطع).
  2. جعل صفحه جدول بيانات جديده تحتوي علي القيم المطلقة لجميع قيم السرعة. استخدم هذه القيم لحساب متوسط سرعه التدفق الإجمالي ، ومتوسط سرعه التدفق لجميع شرائح الاوعيه الدموية مع مرور الوقت ، وسرعه التدفق لكل شريحة وعائية مع مرور الوقت ، وجعل الرسوم البيانية لتوزيعات السرعة.
  3. احسب القيم حول المناطق المورفولوجية المحددة ، أو مناطق الاهتمام الأخرى من خلال البحث أولا عن الأجزاء المحددة ذات الصلة في الهيكل العظمي المسمي ثم اجراء التحليلات علي هذه الشرائح المحددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يقوم تحليل الموظفين باجراء تعداد كامل لسرعات الاوعيه المجهرية عبر حقول المجهر بأكملها عبر فترات زمنيه تمتد من ثوان إلى دقائق. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 1، والشكل 2، والشكل 3، والشكل 4. ويبين الشكل 1 مثالا لسلسله زمنيه من شبكه الاوعيه المجهرية في كبد الفار ، وتوليد الصورة البقاياه التي تستخدم لتحديد محور تدفق الاوعيه المجهرية ، والخريطة التي يولدها الموظفون لقطع الاوعي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك عده خطوات هامه في هذا البروتوكول. أولا ، تقليل الحركة اثناء التصوير الانترافيتال للكبد أمر ضروري لتوليد الأفلام التي يمكن استخدامها لتحليل تدفق الشعرية بواسطة الموظفين. بسبب قرب الحجاب الحاجز ، تحدث فترات قصيرة من الحركة المستحثة بالتنفس ، مع عوده الكبد المضمون إلى موضعه الاولي بعد كل نفس. تامين الكبد المكشوف جراحيا ضد طبق coverslip القاع باستخدام الشاش ، ثم التصوير من أدناه باستخدام المجهر المقلوب يخدم لشل الجهاز بين التنفس16،17،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد دعمت الدراسات المقدمة هنا بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد القومي للصحة U01 GM111243 و "نيدك" P30 DK079312). أجريت دراسات مجهريه انترافيتال في مركز إنديانا لمجهري البيولوجي. نشكر الدكتور مالجورزاتا كاموككا للحصول علي المساعدة التقنية بالمجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11251-20دومون # 5 ملقط إينوكس
C57BL / 6 فئرانمختبراتذكر 9-12 أسابيع
من العمر قنيةInstechBTPE-10أنابيب البولي إيثيلين 0.011 × 0.024 بوصة
كاميرا CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
طبق غطاء القاعالمجهري الإلكتروني SciencesWillCo Dish Dish Glass Bottom GWST5040
تشريح مقصالعلوم
Fiji ImageJ برنامجhttps://fiji.sc/ ؛ https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextrannThermo Fisher ، InvitrogenD1822Dexterran ، Fluorescein ، 70،000 ميجاوات ، أنيوني ، Lysine قابل
شاش الإسفنجفيشر22-415-5042x2 بوصة دوكال معقم شاش الإسفنج
وسادة التدفئةReptithermRH-4بين الماوس والمرحلة
وسادة التدفئةالشمس000732-500-000Uفوق الماوس
مجهر epifluorescence مقلوبنيكوننيكون TiE
مجهر مقلوب إيزيس القوارض ماكينة حلاقة كهربائيةبراون AesculapGT420
IsofluoraneAbbott GmbHPZN4831850
محول كعب لورفيشر14-826-19Eمحول قسطرة
مقص صغيركاسترو فيجو
مجهر الهدفنيكونخطة فلور 20x ، NA 0.75 غمر الماء
إبرةفيشر30 جم × 1 / 2 "
إبرة حاملOlsen-Hegar
سخان موضوعيالعلوم الحيويةMTC-HLS-025جهاز التحكم في درجة الحرارة مع سخان موضوعي
ميزان حرارة المستقيمBraintree Scientific ، INCTH-5Aماوس مراقبة درجة حرارة الجسم
وحدات ماكروhttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
خياطة سلسلةهارفارد بيوساينسخياطة سوداءحريرية 723288 ، 6-0 ، بكرة
جاكسون أدوات الدقيقة تحليل الصور للإصلاح شعاع أدوات

المراجع

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FIJI TrakEM2 Skeleton Eyes Kymograph

مقالات ذات صلة