مقالة منهجية

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

DOI:

10.3791/60616

⸱

مارس 8, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب لتحديد وقياس الدهون الخلوية الرئيسية في saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة للتقييم الكمي لفئات الدهون الرئيسية داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدهون هي جزيئات أمفيباثيك متنوعة هيكليا التي هي غير قابلة للذوبان في الماء. الدهون هي المساهمين الأساسيين في تنظيم وظيفة الأغشية البيولوجية، وتخزين الطاقة والإنتاج، والإشارات الخلوية، والنقل المركبات من البروتينات، والتكوين الحيوي organelle، والموت الخلايا المنظمة. لأن الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae هو eukaryote أحادي الخلية قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة، وساعد استخدامه ككائن حي نموذجي في الكشف عن آليات ربط استقلاب الدهون والنقل داخل الخلايا إلى العمليات البيولوجية المعقدة داخل الخلايا eukaryotic. إن توفر طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للفئات الرئيسية من الدهون داخل خلية الخميرة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى عميقة في هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا لاستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي المترادف (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae. طريقة LC-MS/MS الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وقياس كمية العديد من الأنواع (بما في ذلك أشكال مختلفة من الايزوباريك أو الايزوميري) داخل كل فئة من فئات الدهون العشرة. وهذه الطريقة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض أنواع الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.2 pmol/μL. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لتقييم الدهون من خلايا الخميرة الكاملة والعضيات المنقى. ويمكن أن يؤدي استخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي للرذاذ الكهربائي في هذه الطريقة إلى زيادة كفاءة التأيين بالنسبة لبعض أنواع الدهون، وبالتالي يمكن استخدامه لتحسين تحديدها وكميتها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير مجموعة من الأدلة إلى أن الدهون ، وهي واحدة من الفئات الرئيسية للجزيئات الحيوية ، تلعب أدوارًا أساسية في العديد من العمليات الحيوية داخل خلية eukaryotic. وتشمل هذه العمليات تجميع ثنائيات الدهون التي تشكل غشاء البلازما والأغشية المحيطة العضيات الخلوية، ونقل جزيئات صغيرة عبر أغشية الخلايا، والاستجابة للتغيرات في البيئة خارج الخلية ونقل إشارة داخل الخلايا، وتوليد وتخزين الطاقة، واستيراد وتصدير البروتينات تقتصر على العضيات المختلفة، والاتجار بالمركبات من البروتينات داخل نظام الغشاء الداخلي وإفراز البروتين، وعدة طرق من موت الخلية المنظمة1 ،2،3،4،5،6،7،8،9،10.

الخميرة الناشئة S. cerevisiae، كائن eukaryotic وحيدة الخلية ، وقد استخدمت بنجاح للكشف عن بعض الآليات الكامنة وراء الأدوار الأساسية للدهون في هذه العمليات الخلوية الحيوية4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ،16،17،18،19،20. S. cerevisiae هو كائن حي نموذجي قيم للكشف عن هذه الآليات لأنه قابل للتحليلات الشاملة الكيميائية الحيوية والوراثية والخلايا البيولوجية والبيولوجية الكيميائية والبيولوجية النظامية والدقيقة السوائل تشريحالتحاليل 21،22،23،24،25. مزيد من التقدم في آليات فهم الدهون التي من خلالها التمثيل الغذائي للدهون والنقل داخل الخلايا المساهمة في هذه العمليات الخلوية الحيوية يتطلب تقنيات قياس الطيف الكتلي الحساسة للتوصيف الكميللدهون الخلوية، وفهم التعقيد الجزيئي للدهون، ودمج الدهون الكمية في منصة متعددة التخصصات للأنظمة البيولوجيا1،2،3،26، 27،28،29،30.

الأساليب الحالية لقياس الطيف الكتلي بمساعدة الدهون الكمية من خلايا الخميرة وخلايا الكائنات الحية eukaryotic الأخرى ليست متعددة بما فيه الكفاية، قوية، أو حساسة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب المستخدمة حاليا غير قادرة على التمييز بين مختلف أنواع الدهون الأيزوباروية أو الأيزوميريك ية عن بعضها البعض. هنا نصف طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة تسمح باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام العقيمة لعبادة الخميرة

  1. إعداد 90 مل من وسط YP كاملة تحتوي على 1٪ (ث / v) استخراج الخميرة و 2٪ (ث / v) bactopeptone.
  2. إعداد 90 مل من متوسط YNB الاصطناعية الحد الأدنى التي تحتوي على 0.67٪ (ث / v) قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية، 20 ملغ / لتر-الهستيدين، 30 ملغ / لتر- ليسين، 30 ملغ / لتر- ليسين، و 20 ملغ / لتر uracil.
  3. تقسيم 90 مل من المتوسطة YP كاملة بالتساوي إلى اثنين من 250 مل إرلنماير قارورة (أي 45 مل لكل منهما).
  4. تقسيم 90 مل من المتوسط YNB الحد الأدنى الاصطناعية إلى اثنين من 250 mL Erlenmeyer قارورة (أي 45 مل لكل منهما).
  5. الأوتوكلاف القوارير مع وسائل الإعلام YP وYNB في 15 psi/121 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام.

2. سلالة الخميرة

  1. استخدام سلالة نوع البرية BY4742(MATα his3Ο1 leu2Ο0 lys2Ο0 ura3Ο0).

3. زراعة الخميرة في وسط YP كاملة مع الجلوكوز

  1. الأوتوكلاف 20٪ (ث / v) حل الأسهم من الجلوكوز في 15 psi/121 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. أضف 5 مل من محلول مخزون الجلوكوز المعقم بنسبة 20% (ث/v) إلى كل من قوارير Erlenmeyer المعقمة التي تحتوي على متوسط YP المعقم لتركيز نهائي بنسبة 2٪ من الجلوكوز (ث/v).
  3. استخدام حلقة الميكروبيولوجية لتلقيح الخلايا من سلالة نوع البرية BY4742 في كل من اثنين من قوارير Erlenmeyer التي تحتوي على وسط YP مع الجلوكوز.
  4. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز التناوب في 200 دورة في الدقيقة.
  5. اتخاذ aliquot من ثقافة الخميرة. استخدام مقياس الهيموكومتر لتحديد العدد الإجمالي لخلايا الخميرة لكل مل من الثقافة.

4. نقل الخميرة إلى وزراعة لهم في المتوسط YNB الحد الأدنى الاصطناعية مع الجلوكوز

  1. أضف 5 مل من محلول مخزون الجلوكوز المعقم بنسبة 20% (ث/v) إلى كل من قوارير Erlenmeyer المعقمة التي تحتوي على متوسط YNB المعقم إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪ من الجلوكوز (ث/v).
  2. استخدام ماصة معقمة لنقل حجم من ثقافة الخميرة بين عشية وضحاها التي تحتوي على العدد الإجمالي للخلايا 5.0 × 107 في كل من قوارير Erlenmeyer اثنين تحتوي على وسط YNB مع الجلوكوز.
  3. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل (أو أكثر، إذا كانت التجربة تتطلب) في 30 درجة مئوية مع اهتزاز الدوران في 200 دورة في الدقيقة.

5. إعداد الكواشف واللابوير والمعدات لاستخراج الدهون

  1. إعداد ما يلي: 1) درجة عالية (> 99.9%) الكلوروفورم؛ 2) درجة عالية (> 99.9٪ ) الميثانول؛ 3) 28٪ (v/ v) محلول هيدروكسيد الأمونيوم في المياه النقية النانوية؛ 4) الخرز الزجاجي (حمض غسلها، 425-600 ميكرومتر)؛ 5) دوامة مع محول المناسبة؛ 6) 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاجية عالية السرعة مع قبعات مبطنة البولي تترافلوروإيثيلين؛ 7) 17:1 و 2:1 خليط من الكلوروفورم والميثانول؛ 8) خليط كلوروفورم / ميثانول (2:1) مع 0.1٪ هيدروكسيد الأمونيوم (v /v)؛ 9) حل ABC (155 mm بيكربونات الأمونيوم، درجة الحموضة = 8.0)؛ 10) مزيج من معايير الدهون الداخلية أعدت في 2:1 خليط من الكلوروفورم والميثانول كما هو مبين في الجدول 1؛ و 11) 2 مل قنينات عينة الزجاج مع قبعات مبطنة البولي تترافلوروإيثيلين لاستخراج الدهون الخلوية.

6. إعداد الكواشف، labware، والمعدات لLC

  1. إعداد ما يلي: 1) أسيتونتريل/2-بروبانول/نانو-المياه النقية (65:35:5) خليط; 2) دوامة مع محول المناسبة؛ 3) سونيكاتور بالموجات فوق الصوتية؛ 4) قوارير زجاجية مع إدراج للوحة البئر؛ 5) نظام LC مجهزة مضخة ثنائية، degasser، وautosampler؛ 6) عمود C18 في المرحلة العكسية (2.1 مم؛ 75 مم؛ حجم المسام 130 Å؛ نطاق درجة الحموضة من 1-11) إلى جانب نظام ما قبل العمود؛ 7) خليط A: الأسيتونتريل / الماء (60:40)؛ و8) خليط B: ايزوبروبانول / أسيتونتريل (90:10).

7. استخراج الدهون من خلايا الخميرة

  1. اتخاذ aliquot من ثقافة الخميرة. استخدام مقياس الهيموكيتوم أو قياس OD600 لتحديد العدد الإجمالي لخلايا الخميرة لكل مل من الثقافة.
  2. خذ حجم ًا من ثقافة الخميرة يحتوي على عدد إجمالي من 5.0 × 107 خلايا (3.3 وحدة OD600). ضع هذا الحجم من الثقافة في أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل.
  3. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 °C. تجاهل السوبرناستانت.
  4. أضف 1.5 مل من الماء النقي البارد بالنانو ويغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 16000 × ز لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
  5. أضف 1.5 مل من محلول ABC البارد ويغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × ز لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت. يمكن تخزين بيليه الخلية في -80 درجة مئوية قبل استخراج الدهون.
  6. لبدء استخراج الدهون، وتذوب بيليه الخلية على الجليد.
  7. إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من الماء النقي نانو الباردة الجليد. نقل تعليق الخلية إلى 15 مل عالية القوة الزجاج المسمار أنبوب الطرد المركزي العلوي مع غطاء مبطن البولي تترافلوروإيثيلين. أضف ما يلي إلى هذا الأنبوب: 1) 25 ميكرولتر من خليط معايير الدهون الداخلية المعدة في خليط الكلوروفورم/الميثانول (2:1)؛ 2) 100 ميكرولتر من 425-600 ميكرومتر حبات الزجاج المغسولة بالحمض؛ و 3) 600 ميكرولتر من الكلوروفورم / الميثانول (17:1) خليط.
  8. دوامة الأنبوب بسرعة عالية لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتعطيل الخلايا.
  9. دوامة الأنبوب بسرعة منخفضة لمدة 1 ساعة في RT لتسهيل استخراج الدهون.
  10. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على الجليد لتعزيز هطول الأمطار البروتين وفصل المرحلتين المائية والعضوية عن بعضها البعض.
  11. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تسمح هذه الخطوة المركزية بفصل المرحلة المائية العليا عن المرحلة العضوية السفلية ، والتي تحتوي على جميع فئات الدهون.
  12. استخدام ماصة الزجاج borosilicate لنقل المرحلة العضوية السفلى (~ 400 ميكرولتر) إلى آخر 15 مل عالية القوة الزجاج المسمار أنبوب الطرد المركزي العلوي مع غطاء مبطن البولي تترافلوروإيثيلين. لا تعطل الخرز الزجاجي أو المرحلة المائية العليا أثناء هذا النقل. الحفاظ على المرحلة العضوية السفلى تحت تدفق غاز النيتروجين.
  13. أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم-الميثانول (2:1) خليط إلى المرحلة المائية العليا المتبقية للسماح باستخراج أبو الهولوبيدات والسلطة الفلسطينية، PS، PI، وCL. دوامة الأنبوب بقوة لمدة 5 دقائق في RT.
  14. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT.
  15. استخدام ماصة الزجاج borosilicate لنقل المرحلة العضوية السفلى (~ 200 ميكرولتر) التي تشكلت بعد الطرد المركزي إلى المرحلة العضوية التي تم جمعها في الخطوة 7.13.
  16. استخدام تدفق غاز النيتروجين لتبخر المذيبات في المراحل العضوية مجتمعة. إغلاق الأنابيب التي تحتوي على فيلم الدهون تحت تدفق غاز النيتروجين. تخزين هذه الأنابيب في -80 درجة مئوية.

8. فصل الدهون المستخرجة من قبل LC

  1. أضف 500 ميكرولتر من الأسيتونتريل/2-بروبانول/نانو-نقي الماء (65:35:5) خليط إلى أنبوب يحتوي على طبقة الدهون التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.16. دوامة أنبوب 3x لمدة 10 s في RT.
  2. تخضع محتوى أنبوب لسونيكيشن بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. دوامة أنبوب 3x لمدة 10 s في RT.
  3. خذ 100 ميكرولتر من عينة من الأنبوب وأضفها إلى قارورة زجاجية مع إدراج يستخدم لصفيحة البئر. القضاء على فقاعات الهواء في إدراج قبل سرعة في لوحة البئر.
  4. استخدام نظام LC لفصل أنواع الدهون المختلفة على عمود C18 CSH في المرحلة العكسية إلى نظام ما قبل العمود (انظر جدول المواد). أثناء الفصل، حافظ على العمود عند درجة حرارة 55 درجة مئوية وبمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة.
  5. استخدم المراحل المتنقلة التي تتكون من الخليط A (الأسيتونتريل/الماء [60:40 (v/v)]) والخليط B (إيزوبروبانول/أسيتونتريل [90:10 (v/v)]). وبالنسبة لوضع إيجابي للكشف عن الأيونات الأم التي تم إنشاؤها باستخدام مصدر الأيون بالرش الكهربائي (ESI) ، وضع ESI (+) ، تحتوي المرحلتان المتنقلان A و B على خلاف الأمونيوم عند التركيز النهائي 10 م. م. م. وبالنسبة للوضع السلبي لكشف الإيونات الأم، وضع ESI (-) والمرحلتين المتنقلتين A و B تحتويان على خلات الأمونيوم عند التركيز النهائي البالغ 10 م. م.
  6. استخدم حجم عينة قدره 10 ميكرولتر للحقن في كل من وضع ESI (+) وESI (-).
  7. فصل أنواع الدهون المختلفة بواسطة LC باستخدام تدرج LC التالي: 0-1 دقيقة 10٪ (المرحلة B)؛ 1-4 دقيقة 60٪ (المرحلة باء)؛ 4-10 دقيقة 68٪ (المرحلة باء)؛ 10-21 97 في المائة (المرحلة باء)؛ 21-24 دقيقة 97 في المائة (المرحلة باء)؛ 24-33 دقيقة 10٪ (المرحلة ب).
  8. تشغيل الفراغات استخراج كعينة الأولى، بين كل أربع عينات، وكعينة الأخيرة. طرح الخلفية لتطبيع البيانات.
  9. يظهر في الشكل 1إجمالي كروماتوغرام أيوني تمثيلي من بيانات LC/MS للدهون المستخرجة من خلايا سلالة النوع البري BY4742 .

9. تحليل الطيف الكتلي للدهون مفصولة بـ LC

  1. استخدم مطياف كتلة مجهزة HESI (الأيون ية الكهربائية ساخنة) مصدر أيون لتحليل الدهون التي تم فصلها بواسطة LC. استخدم الإعدادات المتوفرة في الجدول 2.
  2. استخدم محلل تحويل Fourier للكشف عن الأيونات الأصلية (MS1) بدقة 60,000 وضمن نطاق الكتلة من 150-2,000 Da.
  3. استخدم الإعدادات المتوفرة في الجدول 3 للكشف عن الأيون الثانوي (MS2).

10 - تحديد وكمية مختلف فئات الدهون وأنواعها عن طريق معالجة البيانات الخام من LC-MS/MS

  1. انظر جدول المواد للحصول على برامج لتنفيذ تحديد وكمية الدهون المختلفة من ملفات LC-MS/MS الخام. يستخدم هذا البرنامج أكبر قاعدة بيانات للدهون، تحتوي على أكثر من 1.5 مليون سلائف أيون اتّهام ة (MS1) وأقمارها المنقّبة (MS2). يستخدم البرنامج أيضًا قمم MS1 لكمية الدهون وMS2 لتحديد الدهون. يتم عرض صورة لونية تمثيلية لشكلين فوسفاتيديل سيرين (34:0) لهما نفس قيمة m/z ولكن أوقات الاحتفاظ المختلفة، بالإضافة إلى أطياف MS1 وMS2 الخاصة بهم، في الشكل 2والشكل 3والشكل 4على التوالي.
  2. بحث ملفات LC-MS الخام التي تحتوي على بيانات MS1 كاملة المسح الضوئي وبيانات MS2 المعتمدة على البيانات للأحماض الدهنية الحرة (غير الستيرية) (FFA) ، cardiolipin (CL) ، phytoceramide (PHC) ، phytosphingosine (PHS) ، فوسفاتيديل كولين (PC) ، فوسفاتيديلول aamine (PE), فوسفاتيديلليسرول (PG), فوسفاتيديلينوسيتول (PI), فوسفاتيديلسيرين (PS), وtriacylglycerol (TAG) فئات الدهون باستخدام التسامح م / س من 5 جزء في المليون للأيونات السلائف و 10 جزء في المليون لإيونات المنتج. يتم عرض معلمات البحث الأخرى في الجدول 4. اتبع الإرشادات الواردة في دليل مستخدم البرنامج. هويات معايير الدهون الداخلية وأنواع الدهون مع تكوين الأحماض الدهنية غير عادية تحتاج إلى التحقق يدويا.
  3. لتحديد وكمية مختلف فئات الدهون والأنواع مع مساعدة من بدائل مفتوحة المصدر متاحة بحرية لبرنامج البحث عن الدهون، واستخدام محلل بيانات الدهون(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml)،MZmine 2(http://mzmine.github.io/)،أو XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)البرمجيات لمعالجة البيانات الخام من LC-MS/MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت طريقتنا للتقييم الكمي للدهون الخلوية الرئيسية داخل خلية الخميرة بمساعدة LC-MS/MS متعددة الاستخدامات وقوية. سمح لنا لتحديد وتحديد كمية 10 فئات الدهون المختلفة في S. cerevisiae الخلايا المستزرعة في المتوسط الاصطناعية الحد الأدنى YNB التي تحتوي في البداية 2٪ الجلوكوز. وتشمل هذه الطبقات الدهون الأحماض الدهنية الحرة (غير الستيرية) (FFA)، CL، phytoceramide (PHC)، phytosphingosine (PHS)، PC، PE، PG، PI، PS، وTAG(الجدول التكميلي 1). تم تحديد العديد من الأنواع الجزيئ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاحتياطات التالية مهمة للتنفيذ الناجح للبروتوكول الموصوف هنا:

1. الكلوروفورم والميثانول سامة. أنها استخراج بكفاءة مواد مختلفة من الأسطح، بما في ذلك البلاستيك المختبري ة وبشرتك. لذلك ، تعامل مع هذه المذيبات العضوية بحذر عن طريق تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي على ملامسة الكلوروفورم و / أو الميثانول ، باستخدام ماصة الزجاج البوروسيليكات لهذه الخطوات ، ومعالجة هذه الماصة بالكلوروفورم والميثانول قبل الاستخدام.

2. أثناء استخراج الدهون بواسطة الميثانول / الكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو لإجراء المناقشات. ونحن نقدر مركز التطبيقات البيولوجية للقياس الطيفي الكتلي ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي (وكلاهما في جامعة كونكورديا) على الخدمات المتميزة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية (NSERC) في كندا (RGPIN 2014-04482) وصندوق كرسي جامعة كونكورديا (CC0113). وحاز ك. م. على دعم من جائزة الجدارة في جامعة كونكورديا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنابيب طرد مركزي زجاجية عالية السرعة مع أغطية مبطنة بالتفلونPYREX05-550
2 مل قوارير عينة زجاجية مع أغطية مبطنة بالتفلونفيشر Scientific60180A-SV9-1P
2-PropanolFisher ScientificA461-500
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Agilent 1100 series LC SystemAgilent التقنياتG1312A
Agilent1100 WellplateAgilent TechnologiesG1367A
أسيتات الأمونيومفيشر ScientificA11450
بيكربونات الأمونيومسيجما9830
فورمات الأمونيومفيشر ScientificA11550
هيدروكسيد الأمونيومفيشر ScientificA470-250
باكتوبتونفيشر ScientificBP1420-2
كارديوليبينأفانتي القطبية للدهون750332
Centra CL2 أجهزة الطرد المركزي السريريةThermo Scientific004260F
سيراميدأفانتي القطبيةالدهون 860517
الكلوروفورمفيشر العلميC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944نظام ما قبل العمود
الأحماض الدهنية الحرة (19: 0)Matreya1028
حبات زجاجية (مغسولة بالأحماض ، 425-600 مو ؛ م)سيجما ألدريتشG8772
الجلوكوزفيشر العلميD16-10
مقياس الدمفيشر العلمي267110
< م > لتر < م > هيستيدينسيجماH8125
برنامج البحث عن الدهون (V4.1) برنامجتحليل فيشر العلميV4.1LC-MS /
MS < م > L < / em > -leucineسيجماL8912
< م > لتر < م > ليسينسيجماL5501
ميثانولفيشر العلميA4564
فوسفاتيديل كولينأفانتي الدهون القطبية850340
فوسفاتيديل إيثانولامينأفانتي القطبية850704
فوسفاتيديل الجلسرينأفانتي الدهون القطبية840446
فوسفاتيديلينوسيتولأفانتي الدهون القطبيةLM1502
فوسفاتيديلسيرينأفانتي الدهون القطبية840028
عمود الطور العكسي CSH C18Waters186006102
SphingosineAvanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricylglycerolLarodan ، MalmoTAG مختلط FA
الموجات فوق الصوتية الموجاتفيشر 15337416
UracilSigmaU0750
دوامةفيشر 2215365
مستخلص الخميرةفيشر ScientificBP1422-2
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينيةفيشر ScientificDF0919-15-3
سلالة الخميرة BY4742DharmaconYSC1049
الدهون فوق الصوتية العلميالعلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  3. Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
  6. Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
  7. Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
  8. Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
  9. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  10. Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).
  11. Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
  12. Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
  13. Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
  14. Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
  15. Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
  16. Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
  17. Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
  18. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
  19. Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
  20. Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
  21. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  22. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  23. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  24. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  25. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
  26. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  27. Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
  28. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  29. Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
  30. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  31. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
  32. Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C18

مقالات ذات صلة