استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

Hirofumi Nishizono; Mohamed Darwish; Hideki Uosaki; Nanami Masuyama; Motoaki Seki; Hiroyuki Abe; Nozomu Yachie; Ryohei Yasuda

doi:10.3791/60808

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

9.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60808

⸱

أبريل 2, 2020

Hirofumi Nishizono^*¹^,²^,³ , Mohamed Darwish^*⁴^,⁵ , Hideki Uosaki⁶^,⁷ , Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰ , Motoaki Seki⁸^,¹¹ , Hiroyuki Abe³ , Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³ , Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم طريقة معدلة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة، فضلا عن بروتوكول يُشبه استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهربية من أجل الجيل الفعال من الفئران المعدلة وراثيا.

الملخص

أصبح استخدام الفئران المعدلة وراثياً أمراً حاسماً لفهم وظيفة الجينات وفك رموز الآليات الأساسية للأمراض البشرية. يسمح نظام CRISPR/Cas9 للباحثين بتعديل الجينوم بكفاءة وإخلاص وبساطة لم يسبق لها مثيل. تسخير هذه التكنولوجيا ، والباحثين يبحثون عن بروتوكول سريع وفعال وسهل لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. هنا نقدم طريقة محسنة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة التي تؤدي إلى معدل نمو أعلى للأجنة المذابة بالتجميد. من خلال الجمع بين ذلك مع ظروف الكهربة الأمثل ، يسمح هذا البروتوكول بتوليد فئران بالضربة القاضية وتدق بكفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة في غضون وقت قصير. وعلاوة على ذلك، نعرض شرحا خطوة بخطوة لبروتوكولنا الأمثل، الذي يغطي إعداد كاشف CRISPR، وفي الإخصاب في المختبر، والحفاظ على التبريد وذوبان الأجنة من خلية واحدة، والكهرباء من الكواشف CRISPR، وتوليد الماوس، والنماذج الجينية للمؤسسين. باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون الباحثون قادرين على إعداد فئران جنرال موتورز بسهولة وسرعة وكفاءة لا مثيل لها.

المقدمة

المجمعة بانتظام متباعدة قصيرة palindromic يكرر (CRISPR) / CRISPR المرتبطة بروتين 9 (Cas9) النظام هو اختراق العلمية التي توفر التعديل المستهدف لم يسبق له مثيل في الجينوم¹. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من بروتين Cas9 ودليل RNA (gRNA) مع اثنين من المكونات الجزيئية: الحمض النووي الريبي CRISPR المحدد (crRNA) وCRISPR RNA عبر التنشيط (tracrRNA)² . وgRNA يوجه بروتين Cas9 إلى مكان محدد في الجينوم، 20 النيوكليوتيدات المكملة لcrRNA، والمتاخمة للعزر البروتوساتير المجاورة (PAM). يرتبط بروتين Cas9 بالتسلسل المستهدف ويحفز فواصل حبلا مزدوجة (DSBs) التي يتم إصلاحها إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة المعرضة للخطأ (NHEJ) أو إصلاح تو....