مقالة منهجية

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

DOI:

10.3791/60808

⸱

أبريل 2, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم طريقة معدلة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة، فضلا عن بروتوكول يُشبه استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهربية من أجل الجيل الفعال من الفئران المعدلة وراثيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح استخدام الفئران المعدلة وراثياً أمراً حاسماً لفهم وظيفة الجينات وفك رموز الآليات الأساسية للأمراض البشرية. يسمح نظام CRISPR/Cas9 للباحثين بتعديل الجينوم بكفاءة وإخلاص وبساطة لم يسبق لها مثيل. تسخير هذه التكنولوجيا ، والباحثين يبحثون عن بروتوكول سريع وفعال وسهل لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. هنا نقدم طريقة محسنة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة التي تؤدي إلى معدل نمو أعلى للأجنة المذابة بالتجميد. من خلال الجمع بين ذلك مع ظروف الكهربة الأمثل ، يسمح هذا البروتوكول بتوليد فئران بالضربة القاضية وتدق بكفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة في غضون وقت قصير. وعلاوة على ذلك، نعرض شرحا خطوة بخطوة لبروتوكولنا الأمثل، الذي يغطي إعداد كاشف CRISPR، وفي الإخصاب في المختبر، والحفاظ على التبريد وذوبان الأجنة من خلية واحدة، والكهرباء من الكواشف CRISPR، وتوليد الماوس، والنماذج الجينية للمؤسسين. باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون الباحثون قادرين على إعداد فئران جنرال موتورز بسهولة وسرعة وكفاءة لا مثيل لها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجمعة بانتظام متباعدة قصيرة palindromic يكرر (CRISPR) / CRISPR المرتبطة بروتين 9 (Cas9) النظام هو اختراق العلمية التي توفر التعديل المستهدف لم يسبق له مثيل في الجينوم1. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من بروتين Cas9 ودليل RNA (gRNA) مع اثنين من المكونات الجزيئية: الحمض النووي الريبي CRISPR المحدد (crRNA) وCRISPR RNA عبر التنشيط (tracrRNA)2 . وgRNA يوجه بروتين Cas9 إلى مكان محدد في الجينوم، 20 النيوكليوتيدات المكملة لcrRNA، والمتاخمة للعزر البروتوساتير المجاورة (PAM). يرتبط بروتين Cas9 بالتسلسل المستهدف ويحفز فواصل حبلا مزدوجة (DSBs) التي يتم إصلاحها إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة المعرضة للخطأ (NHEJ) أو إصلاح تو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم إجراء جميع الرعاية والإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة وفقا لقواعد ولوائح دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة رعاية الحيوانات من الحيوانات المختبرية من جامعة توياما، جامعة طوكيو، جامعة جيتشي، ومعهد ماكس بلانك فلوريدا لعلم الأعصاب. يتم عرض معلومات حول جميع الكواشف في جدول المواد.

1. تصميم الكواشف CRISPR

  1. تصميم crRNA
    1. قم بزيارة CRISPR Direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) لتصميم crRNAs محددة مع مواقع مخفضة خارج الهدف.
      ملاحظة: هناك العديد من الأدوات المفيدة الأخرى لتصميم crRNA20 (https://bioi....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدينا طريقة معدلة للحفظ بالتبريد من الأجنة خلية واحدة، بما في ذلك الحضانة في HTF تحتوي على 20٪ FBS لمدة 10 دقيقة تليها الحفظ بالتبريد في 1 M DMSO وDAP213 حل، وتحسين معدل النمو للأجنة المذابة بالتجميد في مرحلة الخليةين(الشكل 1،p = 0.009، اختبار T للطالب). تم استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج فئران جنرال موتورز وتم تحسين ظروف الكهربة: خمسة تكرارات من 25 فولت مع 3 مللي ثانية من البقول و97 مللي ثانية باستخدام الكهربورات كما هو موضح في قسم البروتوكول. تم التحقق من انطباق البروتوكول من قبل جي.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول الموصوف بتوليد فئران جنرال موتورز ذات كفاءة عالية ومعدلات فسيفساء منخفضة(الجدول 1). فهو يمكّن الباحثين الذين لا يتمتعون بمهارات متقدمة في التلاعب بالأجنة من إنشاء فئران متحولة بسهولة لأنها تستفيد من أحدث التطورات وأكثرها فائدة في كل من الهندسة الإنجابية وتقنيات تحرير الجينوم: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) والكهربية في أجنة مذابة بالتجميد. وقد سهلت هذه التطورات وعجلت بتوليد فئران جنرال موتورز. كما هو موضح في الشكل 3، يستغرق الأمر حوالي 4 أسابيع لتوليد ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي إقرارات مالية ذات صلة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر هيتومي ساوادا وإليزابيث غارسيا على رعاية الحيوانات. تم دعم هذا العمل من قبل KAKENHI (15K20134 ، 17K11222 ، 16H06276 و 16K01946) ومنحة هوكينجين للأبحاث (إلى H.N) ، وجائزة الباحث الشاب بجامعة جيتشي الطبية (إلى H.U. ). دعمت مؤسسة أوتسوكا توشيمي للمنح الدراسية ماجستير في التعليم.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25 م السكروزARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان)Vetorphale 5mg
Cas9 البروتين: Alt-R & reg ؛ S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies، Inc. (كورالفيل ، IA)1081060
C57BL / 6J الفئراناليابان SLC (هاماماتسو ، اليابان)N / A
DAP213ARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)DAP213
FBSSigma-Aldrich، Inc. (سانت لويس ، ميزوري)ES-009-C
HCGMOCHIDA الصيدلانية المحدودة (طوكيو ، اليابان)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)HTF
ICR الفئراناليابان SLC (هاماماتسو ، اليابان)N / A
IsofluranePetterson Vet Supply، Inc. (Greeley ، CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground ، GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co.، Ltd. (كوماموتو ، اليابان)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co.، Ltd. (كورياما ، اليابان)1124401A1060
مجهرنيكون Co. (طوكيو ، اليابان)SMZ745T
MidazolamSandoz KK (طوكيو ، اليابان)1124401A1060
Nuclease Free BufferIntegrated DNA Technologies، Inc. (كورالفيل ، IA)1072570
طقم استخراج الحمض النووي NucleospinTakara Bio Inc (كوساتسو ، اليابان)740952 .5
زجاج منزلق أحادي الفتحةMatsunami Glass Ind.، Ltd. (كيشيوادا ، اليابان)S339929
واحد من النوع الكهربائيBEX Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان)CUY21EDIT II
Paraffin LiquidNACALAI TESQUE Inc. (كيوتو ، اليابان) SP26137-85
قطب كهربائي بلاتينيBEX Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان)LF501PT1-10 ، GE-101
PMSGASKA Animal Health Co. ، Ltd (طوكيو ، اليابان)SEROTROPIN 1000
Povidone يوديدProfessional Disposables International، Inc. (Orangeburg ، NY)C12400
مصل منخفض الحد الأدنى من الوسط الأساسي: OptiMEM ISigma-Aldrich، Inc. (سانت لويس ، ميزوري)22600134
ElectroporatorNepa Gene Co.، Ltd. ( إيتشيكاوا ، اليابان)NEPA21
نوع نوع الخطوتين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9

مقالات ذات صلة