مقالة منهجية

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

6.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61027

⸱

مايو 9, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

الربط المتقاطع الحركي وتحليل cDNA هو طريقة تسمح بالتحقيق في ديناميكيات تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي في الخلايا الحية بدقة زمنية عالية. هنا يتم وصف البروتوكول بالتفصيل ، بما في ذلك نمو خلايا الخميرة ، والربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية ، والحصاد ، وتنقية البروتين ، وخطوات إعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي.

الملخص

التفاعل بين البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) وركائز الحمض النووي الريبي الخاصة بهم يظهر سيولة وتعقيد. خلال فترة حياته ، يمكن ربط الحمض النووي الريبي الواحد بالعديد من RBPs المختلفة التي ستنظم إنتاجه واستقراره ونشاطه وتدهوره. على هذا النحو ، تم عمل الكثير لفهم الديناميكيات الموجودة بين هذين النوعين من الجزيئات. جاء اختراق مهم بشكل خاص مع ظهور "cross-l intombation و immunoprecipitation" (CLIP). سمحت هذه التقنية بإجراء تحقيق صارم في أي الحمض النووي الريبي مرتبط ب RBP معين. باختصار ، البروتين محل الاهتمام هو الأشعة فوق البنفسجية المرتبطة بركائز الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، ويتم تنقيتها في ظل ظروف صارمة للغاية ، ثم يتم تحويل الحمض النووي الريبي المرتبط تساهميا بالبروتين إلى مكتبات cDNA وتسلسلها. منذ إنشائها ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من أجل جعل CLIP قابلة لمجالات معينة من الدراسة. ومع ذلك ، فإن الربط المتقاطع باستخدام الأشعة فوق البنفسجية غير فعال بشكل معروف. ينتج عن هذا أوقات تعرض ممتدة تجعل الدراسة الزمنية لتفاعلات RBP-RNA مستحيلة. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا مؤخرا بتصميم وبناء أجهزة محسنة للأشعة فوق البنفسجية وحصاد الخلايا. باستخدام هذه الأدوات الجديدة ، قمنا بتطوير بروتوكول للتحليلات التي تم حلها زمنيا لتفاعلات RBP-RNA في الخلايا الحية بدقة زمنية عالية: ربط CRoss الحركي والتحليل Aللحمض النووي c(χCRAC). استخدمنا هذه التقنية مؤخرا لدراسة دور الخميرة RBPs في التكيف مع الإجهاد الغذائي. تقدم هذه المخطوطة نظرة عامة مفصلة على طريقة χCRAC وتعرض النتائج الحديثة التي تم الحصول عليها باستخدام Nrd1 RBP.

المقدمة

غالبا ما تعتمد الحمض النووي الريبي على كرات الدم الحمراء لممارسة وظيفتها ، مما أدى إلى اهتمام كبير بفهم الديناميات بين هذه الجزيئات. تم تحديد العديد من الممارسات التجارية التقييدية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. ومع ذلك ، كان من الصعب دائما دراسة تفاعلات RBP-RNA في الجسم الحي. جاء اختراق كبير في دراسة مثل هذه التفاعلات مع ظهور CLIP1. تستخدم هذه الطريقة الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية ، 254 نانومتر) للحث على الروابط التساهمية بين كرات الدم الحمراء والحمض النووي الريبي المرتبط بها مباشرة (أي الربط المتقاطع بدون مسافة). بعد ذلك ، يتم تنقية RBP ذات الأهمية في ظل ظروف صارمة لضمان تحديد الحمض النووي الريبي فقط المرتبط تساهميا بالبروتينات. ثم يتم هضم الحمض النووي الريبي المرتبط جزئيا باستخدام RNases ثم تحويله لاحقا إلى مكتبات cDNA للتسلسل. تعد صرامة التنقية العالية مهمة لأنها تزيد بشكل كبير من خصوصية استعادة البروتين والحمض النووي الريبي ، والتي يتم تعزيزها أيضا من خلال تنقية SDS-PAGE لمركب البروتين النووي الريبي المتصالب (RNP). يوفر CLIP والطرق ذات الصلة أيضا نظرة ثاقبة لدقة النوكليوتيدات في موقع ارتباط البروتين ، لأنه أثناء إعداد مكتبة التسلسل ، فإن الأحماض الأمينية المرتبطة بالحمض النووي الريبي تنهي بشكل متكرر النسخ العكسي أو تتسبب في قيام الإنزيم بإدخال طفرات في هذا الموقع1،2،3.

منذ تقديمه ، أنتج بروتوكول CLIP الأصلي مجموعة متنوعة رائعة من المنهجيات المشتقة. جاء اختراق مهم بشكل خاص مع تطوير HITS-CLIP (أو CLIP-seq) ، والذي يدمج التسلسل عالي الإنتاجية مع نهج CLIP3. وقد تم اعتماد هذا منذ ذلك الحين من قبل جميع المنهجيات القائمة على CLIP. أدخلت iCLIP تحسينات في تقنيات التشذيب وربط المحول بوساطة RNase التي تسهل رسم خرائط أكثر دقة لمواقع ربط RBP4. يجمع PAR-CLIP بين وضع العلامات 4thio-uridine / uracil مع الربط المتقاطع عند 365 نانومتر ، مما يجعل من الممكن تعيين مواقع الربط المتقاطع من خلال تحليل بدائل T-C5. قدم CRAC و urea-iCLIP و dCLIP و uvCLAP ظروف تغيير طبيعة وخطوات تنقية مزدوجة التقارب تقلل من ارتباط الخلفية براتنج التقارب وتزيد من خصوصية التقاط البروتين2،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، قدم CRAC و uvCLAP و dCLIP وضع علامات على RBP محل الاهتمام بعلامة تقارب ، وبالتالي التغلب على الحاجة إلى توليد أجسام مضادة محددة.

كما تم إجراء العديد من التحسينات لتسريع منهجية CLIP. استخدم بروتوكول CLIP الأصلي وضع العلامات الإشعاعية على الحمض النووي الريبي الملتقط من أجل تصور معقدات RBP-RNA بعد SDS-PAGE. ومع ذلك ، يمكن أن يكون استخدام النشاط الإشعاعي مشكلة بالنسبة للمختبرات التي لم يتم إنشاؤها لمثل هذا العمل. يشتمل irCLIP على محول مقترن بالفلوروفور يسهل التصور من خلال التصوير بالأشعة تحت الحمراء10 ويستخدم sCLIP البيوتينيل للحمض النووي الريبي الملتقط من أجل تصورها من خلال HRP11 المترافق بالستربتافيدين . علاوة على ذلك ، يتخلى eCLIP تماما عن وضع العلامات على الحمض النووي الريبي ؛ بدلا من ذلك ، يتم استئصال البروتين بناء على حجمه المعروف12 فقط. كما تم استخدام التنقية القائمة على الستربتافيدين لتسريع عملية إعداد المكتبة في FAST-iCLIP ، حيث يتم ربط محول 3 'بيوتينيل على الحمض النووي الريبي ويستخدم لتمكين التنقية بعد النسخ العكسي والتعميم13. كما أدت التحسينات الإضافية لبروتوكول iCLIP إلى زيادة تعقيد المكتباتبشكل كبير 4.

أخيرا ، تم تعديل CLIP لتمكين التقاط كرات الدم الحمراء من مقصورات فرعية خلوية مختلفة 14,15 ، لتصور الحمض النووي الريبي المنسوخ حديثا باستخدام الحث النبضي للريبونوكليوسيدات القابلة للتنشيط الضوئي5،16،17 ، لالتقاط الحمض النووي الريبي الميثيلي18،19،20 ، لفحص تفاعلات الحمض النووي الريبي - الحمض النووي الريبي 21,22 ، ولتعيين 3' ينتهي 23,24.

على الرغم من المساهمات الكبيرة للتقنيات القائمة على CLIP في مساعدتنا على فهم التفاعلات بين RBPs و RNAs ، فقد تم تقييدها بسبب عدم كفاءة الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة المزروعة في طبقة أحادية يسهل ربطها نسبيا بشكل عام ، إلا أن هذا يمثل تحديا أكبر بكثير في الأنسجة أو الخلايا الموجودة في المحلول. يمكن أن تتطلب الأنسجة جولات متعددة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل اختراق طبقات الخلايا المطلوبة ، بينما غالبا ما تزرع الخلايا الميكروبية في وسائط غنية تحتوي على مركبات عطرية تمتص الأشعة فوق البنفسجية25. في الواقع ، تم استخدام أوقات تشعيع الأشعة فوق البنفسجية التي تصل إلى 30 دقيقة لتوليد ربط متقاطع كاف بين RBPs والحمض النووي الريبي المرتبط بها لمثلهذه العينات 26،27،28. يؤدي هذا التعرض الممتد للأشعة فوق البنفسجية إلى استجابات الإجهاد داخل الخلية ، مثل تلف الحمض النووي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ، والذي يمكن أن يلوث البيانات النهائية في بعض التطبيقات.

ركزت غالبية دراسات CLIP على توليد "لقطات" مفردة لتفاعلات معينة بين البروتين والحمض النووي الريبي في الخلية. ومع ذلك ، فإن تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي ديناميكية بطبيعتها ، خاصة عندما تكون الخلايا عرضة للتغيرات في بيئتها. يمكن أن يشمل ذلك انخفاضا مفاجئا في توافر العناصر الغذائية الأساسية أو التغيرات السريعة في درجة الحرارة. على هذا النحو ، لفهم دور RBP حقا أثناء الإجهاد ، من الأفضل إجراء تحليلات تم حلها بمرور الوقت لأنها يمكن أن تلتقط مجموعة كاملة من أهداف RBP أثناء الإجهاد وتحديد في أي مرحلة من الاستجابة للإجهاد يكون RBP المختار نشطا. على وجه الخصوص ، أظهرت الدراسات التي أجريت على الخميرة أن الدقائق القليلة الأولى من التكيف حاسمة للغاية للبقاء على قيد الحياة ويمكن أن يختلف نصف عمر الحمض النووي الريبي في البكتيريا من دقائق إلى ثوان29،30،31،32،33. ولذلك، ينبغي أن تجرى هذه التحليلات التي تم حلها زمنيا بدقة زمنية عالية. ومع ذلك ، فإن أوقات الترابط الطويلة تجعل دراسة الاستجابات التكيفية في المرحلة المبكرة صعبة بشكل خاص.

من أجل التغلب على هذه المشكلات ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة محسنة قادرة على ربط الخلايا وحصادها على نطاقات زمنية مدتها دقائق. تسمح طريقة χCRAC الخاصة بنا بالقياس الكمي للتغيرات الديناميكية في تفاعلات RBP-RNA بدقة لم يسبق لها مثيل. كان من الأهمية بمكان في هذه الطريقة تطوير جهاز تشعيع جديد للأشعة فوق البنفسجية32 يقلل من وقت الربط المتقاطع المطلوب في الخميرة والبكتيريا في المحلول حوالي 10 أضعاف ، مما يؤدي إلى تجميد تفاعلات RBP-RNA بشكل فعال على الفور. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل حصاد الخلايا بسرعة بعد الأشعة فوق البنفسجية ، قمنا بتطوير جهاز ترشيح فراغي يمكنه حصاد الخميرة المتنامية بشكل كبير في مزرعة 0.5 لتر في حوالي 30 ثانية32. تسمح هذه الابتكارات التكنولوجية بدراسة ديناميكيات RBP-RNA بدقة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، قدمنا أيضا العديد من التحسينات على بروتوكول CRAC2 الأصلي من أجل زيادة عمليته.

باستخدام χCRAC ، درسنا مؤخرا الهدف من الخميرة النووية RBP ، Nab3 ، استجابة للحرمان من الجلوكوز. في Saccharomyces cerevisiae ، يمكن أن يشكل Nab3 معقدا مع Nrd1 ، و RBP ، و RNA helicase Sen1 لتشكيل مجمع NNS. يمكن أن يؤدي ارتباط NNS ببوليميراز الحمض النووي الريبي والنسخة الوليدة إلى إنهاء النسخ34. يشارك هذا المركب في الغالب في إزالة نسخ الحمض النووي الريبي المشفرة غير المشفرة ولكن ثبت أيضا أنه ينظم التعبير عن الجينات المشفرة للبروتين. أظهرت الدراسة الاستهداف التفاضلي ل Nab3 إلى النصوص غير المشفرة والترميز بعد دقيقة واحدة فقط من الإجهاد32. لقد أثبتنا أن الإنهاء المشترك للنسخ بواسطة Nab3 ينتج عنه تعبير عابر للغاية يشبه النبض لجينات retrotransposon ، والتي كان من الصعب اكتشافها باستخدام الأساليب التقليدية القائمة على CLIP. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أوقات تشعيع الأشعة فوق البنفسجية القصيرة في الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية لدينا زادت أيضا بشكل كبير من استعادة الحمض النووي الريبي غير المشفر قصير العمر32. من المحتمل أن تكون CRAC أداة حاسمة في توضيح ليس فقط كيف تشكل الممارسات التجارية التقييدية الاستجابة للإجهاد على الجداول الزمنية الفورية ولكن أيضا أدوارها المتغيرة خلال دورة حياة الاستجابة بأكملها. تقدم هذه المخطوطة نظرة عامة مفصلة على جميع الخطوات في بروتوكول χCRAC. لأغراض توضيحية ، تم استخدام الطريقة لدراسة بروتين الخميرة Nrd1 ، الذي يشارك في إنهاء النسخ وتحلل الحمض النووي الريبي35,36 ، وهدف الحمض النووي الريبي الخاص به استجابة للحرمان من الجلوكوز عبر العديد من النقاط الزمنية. أخيرا ، نوضح أيضا أن وحدة الأشعة فوق البنفسجية الخاصة بنا يمكنها ربط كرات الدم الحمراء بسرعة بالحمض النووي الريبي في خلايا هيلا ، مما يجعل من الممكن أيضا إجراء تحليلات عالية الدقة لحل الوقت في الخلايا الملتصقة.

البروتوكول

تي ان 150
50 مللي متر تريس درجة الحموضة 7.8
150 مللي متر كلوريد الصوديوم
0.1٪ NP-40
1X مثبطات الأنزيم البروتيني
تي ان 1000
50 مللي متر تريس درجة الحموضة 7.8
1 متر كلوريد الصوديوم
0.1٪ NP-40
NP-PNK
50 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 7.8
10 مللي متر مغسل2
0.1٪ NP-40
5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول
5 × PNK
250 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 7.8
50 مللي متر MgCl2
50 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول
البنك الدولي الأول
50 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 7.8
300 مللي متر كلوريد الصوديوم
10 مللي متر إيميدازول
6M جوانيدين-حمض الهيدروكلوريك
0.1٪ NP-40
5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول
البنك الدولي الثاني
50 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 7.8
50 مللي متر كلوريد الصوديوم
10 مللي متر إيميدازول
0.1٪ NP-40
5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول
العازلة للشطف
50 مللي متر تريس درجة الحموضة 7.8
50 مللي متر كلوريد الصوديوم
250 مللي متر إيميدازول
0.1٪ NP-40
5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول
البروتياز K العازلة
50 مللي متر تريس
0.1٪ NP-40
5 مللي متر β-ميركابتوإيثانول
1٪ SDS
5 مللي متر EDTA
50 مللي متر كلوريد الصوديوم2
العازلة تحلل الثدييات
50 مللي متر Tris-HCl درجة الحموضة 8
100 مللي متر كلوريد الصوديوم
0.5٪ v / v تريتون X-100
0.25٪ ث / يوم نا-ديوكسي كولات
0.1٪ ث / v SDS
5 مللي متر EDTA
1 مللي متر DTT (مضاف طازجا)
1X مثبطات الأنزيم البروتيني

الجدول 1: المخازن المؤقتة المطلوبة ل χCRAC وتركيباتها.

1. ربط الأشعة فوق البنفسجية وإنتاج المحللة

  1. الكائنات الحية الدقيقة في الحل
    1. تلقيح 3.5 لتر من الوسط المطلوب مع الخميرة من ثقافة بين عشية وضحاها إلى OD600 بدءا من 0.05. تنمو عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 180 دورة في الدقيقة.
    2. أثناء النمو ، قم بإعداد المواد الضرورية الأخرى.
      1. تحضير وعاء من النيتروجين السائل.
      2. تحضير 3 لتر من الوسط المسبب للإجهاد ودافئ إلى 30 درجة مئوية في حمام مائي.
      3. قم بإعداد جهاز المرشح ، وقم بتشغيل الرابط المتقاطع (الشكل 2 أ) وقم بتسمية الأنابيب المخروطية سعة 50 مل ، واحد لكل نقطة زمنية.
    3. بمجرد أن تصل الخلايا إلى OD 600 المطلوب ، صب500 مل من الخلايا مباشرة في الرابط المتقاطع وتشعع الأشعة فوق البنفسجية ب 250 مللي جول من الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. انظر الشكل 2A والشكل 3A للحصول على تفاصيل حول استخدام الرابط المتشابك.
      ملاحظة: يجب تحسين طاقة الأشعة فوق البنفسجية بعناية لكل بروتين مهم. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
    4. بعد الربط المتقاطع ، قم بتصفية الخلايا باستخدام أحد أجهزة الترشيح الفراغي (الشكل 2B ، C). نشمر الغشاء مع الخلايا المفلترة ، ووضعها في t = 0 (الوقت صفر) 50 مل أنبوب مخروطي ، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل.
    5. قم بتصفية الخلايا المتبقية عبر ستة عوامل تصفية مختلفة. أعد تعليق الخلايا المجمعة في 3 لتر من الوسط الذي يسبب الإجهاد الذي تم تسخينه مسبقا عن طريق إسقاط الأغشية في الوسط والخلط بقوة مع شريط لمدة 50 ثانية. بعد 50 ثانية ، استعد لأخذ عينة t = 1.
    6. بعد دقيقة واحدة ، قم بربط 500 مل من الخلايا والحصاد من خلال الترشيح كما في الخطوات 1.1.3-1.1.4. كرر بعد 2 و 4 و 8 و 14 و 20 دقيقة ، أو نقاط زمنية مختلفة حسب الحاجة.
    7. قم بتخزين الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الخلايا عند -80 درجة مئوية. اضبط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على 4 درجات مئوية طوال الليل.
    8. في اليوم التالي ، خذ كل أنبوب مخروطي يحتوي على عينة متشابكة وأعد تعليق الخلايا في 25 مل من برنامج تلفزيوني بارد عن طريق الهز بقوة.
    9. انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب مخروطية جديدة وقم بتدويرها عند 4600 × جم ، 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. اسكب برنامج تلفزيوني ، ثم قم بتدويره بسرعة مرة أخرى لجمع PBS المتبقي ثم صب السائل المتبقي باستخدام ماصة.
    11. احسب وزن الحبيبات في الأنبوب بمقارنتها بأنبوب فارغ.
    12. أضف حجمين من حبيبات TN150 الباردة ، و 60 ميكرولتر من DNase 1 ، و 10 ميكرولتر من مثبطات RNase. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      1. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 400 ملغ من الخلايا ، أضف 800 ميكرولتر من TN150 المثلج البارد.
      2. إضافة DNase ليست ضرورية لمعظم البروتينات القابلة للذوبان ولكنها مهمة جدا عند دراسة البروتينات المرتبطة بالكروماتين مثل بوليميراز الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من لزوجة المحللة البكتيرية. من المهم جدا استخدام حجمين من الحبيبات بالضبط من المخزن المؤقت للتحلل ، أو يمكن أن تنخفض كفاءة التحلل.
    13. أضف ثلاثة أحجام حبيبات (بالمل) من حبات الزركونيا إلى تعليق الخلية. بالنسبة للخميرة ، استخدم حبات قطرها 0.5 مم وللبكتيريا استخدم 0.1 مم.
      1. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 400 مجم من الخلايا ، قم بقياس 1.2 مل من حبات الزركونيا في أنبوب سعة 1.5 مل وأضفها إلى الخلايا المعاد تعليقها في محلول التحلل.
    14. دوامة تعليق الخلية لمدة 1 دقيقة ، ثم وضعها على الجليد لمدة 1 دقيقة. كرر ليصبح المجموع 5x.
    15. أضف حجمين من الحبيبات من المخزن المؤقت TN150 والدوامة بقوة للخلط.
    16. جهاز طرد مركزي التعليق في الأنبوب المخروطي عند 4600 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
      1. بعد الطرد المركزي ، خذ عينة 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليل اللطخة الغربية المستقبلية لفحص تعبير بروتين الخلية بالكامل.
    17. انقل المواد الطافية إلى أنابيب سعة 1.5 مل وقم بتدوير المحللة لمدة 20 دقيقة عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية ، في وحدة ميكروبلوج.
      1. بدلا من ذلك ، في حالة استخدام أنابيب 5 مل ، استخدم جهاز طرد مركزي عند 13000 × جم لمدة 20 دقيقة.
      2. بعد الطرد المركزي ، خذ عينة 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليل اللطخة الغربية المستقبلية لفحص التعبير القابل للذوبان للبروتين.
    18. انتقل إلى التقاط RBP (القسم 2).
  2. الخلايا الملتصقة المزروعة
    1. قم بزرع ما يكفي من الخلايا الملتصقة في طبق بتري قبل 24 ساعة من الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية بحيث يمكن أن تصل إلى التقاء 80٪ في اليوم التالي. تنمو بين عشية وضحاها في الوسط المطلوب في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: في حالة استخدام أطباق الكوارتز بتري ، من المفيد تعزيز التصاق الخلايا من خلال معالجة أدوات الثقافة باستخدام بولي-د-ليسين (70000-140000 وزن) ومصل عجل الجنين (FCS) 2.5 ساعة قبل البذر. أضف ما يكفي من poly-D-lysine لتغطية سطح النمو بالكامل واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، يجب شطف طبق الكوارتز بتري جيدا بالماء وتجفيفه في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 ساعة أو حتى يجف تماما. بعد ذلك ، أضف ما يكفي من FCS لتغطية سطح النمو بالكامل ووضعه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل. يجب إزالة FCS بالكامل قبل بذر الخلايا.
    2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، قم بإزالة الوسائط واغسلها ب 15 مل من برنامج تلفزيوني بارد. بعد ذلك ، قم بإزالة كل السوائل المتبقية تماما وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.
    3. انقل طبق بتري إلى الدرج للخلايا الملتصقة (الشكل 3 ب) وتشعيع الأشعة فوق البنفسجية ب 300 مللي جول من الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. انظر الشكل 2 أ والشكل 3 ب للحصول على تفاصيل حول استخدام الرابط المتشابك.
      ملاحظة: يجب تحسين طاقة الأشعة فوق البنفسجية بعناية لكل بروتين مهم. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.
    4. مباشرة بعد الربط المتقاطع ، ضع طبق بتري على الثلج وأضف 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد. اجمع الخلايا عن طريق الكشط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بيليه من خلال الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة PBS وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد مثلج ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. خلايا الحبيبات مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة PBS وقم بتجميد كريات الخلية على الثلج الجاف. قم بتخزين كريات الخلايا في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    7. كرر الخطوات من 1.2.3 إلى 1.2.6 لكل نقطة زمنية.
    8. أعد تعليق كريات الخلية في 1 مل من محلول التحلل وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك ، أضف 1 مل من محلول التحلل ليصبح المجموع 2 مل.
    9. أضف 5 ميكرولتر من مثبطات RNase في الثدييات.
    10. Sonicate 5x لمدة 10 ثوان على الجليد عند 10 أمبير. انتظر 30 ثانية بين جولات الصوتنة.
    11. احسب تركيز البروتين لكل عينة وقم بتطبيعه إلى أدنى تركيز.
    12. نقل 1.98 mL من المحللة إلى أنبوب 2 mL.
    13. أضف 10 ميكرولتر من DNase I واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع الهز عند 1200 دورة في الدقيقة.
    14. أجهزة الطرد المركزي المحللة عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      1. بعد الطرد المركزي ، خذ عينة 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليل اللطخة الغربية المستقبلية لفحص التعبير القابل للذوبان للبروتين.
    15. انتقل إلى التقاط RBP (القسم 2).

2. التقاط RBP

  1. اغسل الخرز المغناطيسي المضاد ل FLAG (75 ميكرولتر من الملاط لكل عينة) أو IgG agarose (500 ميكرولتر من الملاط لكل عينة) 3x مع 5 مل من TN150. أعد التعليق في حجم نهائي يبلغ 700 ميكرولتر من TN150 وأضف 100 ميكرولتر من الخرز المغسول إلى سبعة أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
    1. يحفظ على الثلج لحين الحاجة.
  2. بمجرد توضيح المحللات ، أضف المادة الطافية إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبات مضادة ل FLAG / IgG.
  3. البندق عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: تصف بعض البروتوكولات الحضانة الليلية بالخرز ، لكن هذا غير مستحسن ، لأن أوقات الحضانة الطويلة يمكن أن تقلل بشكل كبير من استعادة الحمض النووي الريبي المتصالب.

3. غسل الخرز وانقسام TEV للعلامات

  1. حصاد الخرز وإزالة المحللة.
    1. خذ 50 ميكرولتر من عينة من المادة الطافية لتحليل اللطخة الغربية المستقبلية لفحص البروتين غير الملتقط.
  2. أعد تعليق الخرزات في TN1000 المثلج البارد وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل. يغسل لمدة 10 دقائق ، 4 درجة مئوية ، مع التقطيع. كرر لما مجموعه ثلاث غسلات.
    1. في حالة استخدام حبات الأغاروز IgG ، اغسلها ب 5 مل من TN1000. في حالة استخدام حبات مضادة ل FLAG ، استخدم 2 مل.
  3. بعد ذلك ، اغسل الخرز 3x باستخدام TN150 ، بنفس الحجم الوارد أعلاه.
  4. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخرز في 600 ميكرولتر من TN150.
  5. أضف 30 وحدة من البروتياز GST-TEV محلي الصنع إلى تعليق الخرزة وقم بالتدوير لمدة 2 ساعة في RT.
    ملاحظة: البروتياز المؤتلف GST-TEV متاح الآن تجاريا أيضا ، ولكن لم يتم اختباره باستخدام هذا البروتوكول.
    1. أثناء عملية الهضم ، استعد للخطوات التالية عن طريق إعداد أعمدة من ثلاثة أنابيب سعة 1.5 مل لكل عينة (أي لسبع عينات ، تحتوي على ثلاثة صفوف من سبعة أعمدة).
    2. إلى الصف الأخير من الأنابيب ، أضف 0.4 غرام من هيدروكلوريد الغوانيديوم ، 27 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5M و 3 ميكرولتر من 2.5 M إيميدازول (الرقم الهيدروجيني = 8). لاحظ أن الرقم الهيدروجيني للإيميدازول يجب أن يكون 8. هذا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
    3. بالإضافة إلى ذلك ، اغسل الحجم المطلوب من حبات النيكل في WB I 3x. استخدم 100 ميكرولتر من الملاط لكل عينة. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخرز بنفس الحجم الأصلي من WB I وقم بتخزينه على الثلج.
  6. بمجرد اكتمال عملية الهضم TEV ، اجمع المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي للخرز المضاد ل FLAG أو الطرد المركزي لخرز IgG ، وانقله إلى الصف الأول من الأنابيب التي تم إعدادها مسبقا.
    1. خذ 50 ميكرولتر من عينة TEV eluate لتحليل اللطخة الغربية.
  7. اضبط حاضنة الكتلة الحرارية على 37 درجة مئوية. إلى الصف الثاني من الأنابيب ، أضف 1 ميكرولتر من كوكتيل RNase (تخفيف 1:50).
  8. خذ 550 ميكرولتر من TEV من الصف الأول من الأنابيب وأضفها إلى الصف الثاني (يحتوي على كوكتيل RNase). ماصة بقوة لضمان الخلط.
  9. بعد الانتهاء من ذلك للعينة الأولى ، ضع الأنبوب على الفور في الكتلة الحرارية وابدأ مؤقتا. انتقل إلى العينات اللاحقة ، بحيث يكون كل منها متداخلا.
  10. احتضان لمدة 5 دقائق بالضبط. بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة العينة الأولى من الكتلة الحرارية ونقل المحلول إلى الصف الثالث من الأنابيب (الذي يحتوي على مسحوق هيدروكلوريد الغوانيديوم).
    ملاحظة: عادة ما تكون الحضانة لمدة 5 دقائق مع تخفيف 1:50 من كوكتيل RNase مناسبة لمعظم البروتينات ، ولكن يجب تحسين هذه الخطوة بعناية مع أوقات حضانة أو تركيزات مختلفة لكل بروتين للتأكد من أن الحمض النووي الريبي المتصالب بالحجم الصحيح (30-100 nt).
  11. دوامة على الفور لبضع ثوان بأقصى سرعة لإذابة مسحوق guanidium ثم الانتقال إلى العينة التالية.
  12. بعد نقل جميع العينات إلى مسحوق guanidium ، دوامة مرة أخرى لضمان إذابة كل مسحوق تماما.
  13. أضف 100 ميكرولتر من حبات النيكل المغسولة وقم بتدويرها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يمكن تقصير هذه الحضانة إلى 2 ساعة.

4. علاج الفوسفاتيز القلوي على حبة

  1. اضبط الكتلة الحرارية على 37 درجة مئوية.
  2. ضع عمود دوران التنقية في أنبوب سعة 2 مل ، واحد لكل عينة. انقل حبات النيكل إلى الأعمدة واسمح للطاف بالتصريف. بعد ذلك ، تأكد من إزالة جميع حبات النيكل من أنبوب 1.5 مل عن طريق الشطف باستخدام WB I وتطبيقه على العمود.
  3. قم بإعداد أنابيب 2 مل ، ستة لكل عينة (واحد لجمع كل غسلة). حافظ على جفاف الجزء الخارجي من الأعمدة للحفاظ على التدفق. اغسل الخرزات 3x مع 500 ميكرولتر من WB I ثم 3x مع 500 ميكرولتر من NP-PNK.
  4. أغلق غطاء عمود الدوران وقم بتدوير الخرز لفترة وجيزة لإزالة المخزن المؤقت الزائد.
  5. ضع السدادة على العمود، وضع الأعمدة في أنابيب سعة 1.5 mL، وأضف 60 ميكرولتر من خليط التفاعل الموضح في الجدول 2.
مكون1x7.5 أضعاف
5 × PNK العازلة1290
الفوسفاتيز القلوي430
مثبطات RNase215
H2O42315
الحجم النهائي60 ميكرولتر450 ميكرولتر

الجدول 2: خليط تفاعل الفوسفاتيز القلوي.

  1. احتضان الخرز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. اغسل الخرزات 1x ب 500 ميكرولتر من WB I لتعطيل الفوسفاتيز القلوي ثم 3x مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت NP-PNK. تأكد من شطف الجزء الداخلي من العمود جيدا باستخدام المخزن المؤقت NP-PNK لإزالة أي آثار للجوانيديوم.

5. ربط حبة رابط App-PE بنهاية 3 'من الحمض النووي الريبي

  1. قم بتدوير المخزن المؤقت المتبقي وإضافة 60 ميكرولتر من الخليط المحدد في الجدول 3 (انظر الجدول 4 لتسلسل App-PE) إلى الأعمدة. احتضان التفاعل لمدة 6 ساعات عند 25 درجة مئوية.
مكون1x7.5 أضعاف
5 × PNK العازلة1290
محول App-PE (100 ميكرومتر)0.64.5
T4 RNA ligase 2 مقطوع K227Q322.5
مثبطات RNase1.511.25
50٪ PEG 80001290
H2O30.9231.75
الحجم النهائي60 ميكرولتر450 ميكرولتر

الجدول 3: خليط تفاعل ربط رابط App-PE.

اسم قليل النوكليوتيدالتسلسل (5'-3')
L5AainvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrNrNrNrUrArGrCrN-OH
L5AbinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrArUrUrNrNrNrArUrUrGrCrN-OH
L5AcinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrUrNrNrNrGrCrCrCrN-OH
L5AdinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrUrUrNrNrNrCrCrUrUrUrGrCrN-OH
L5BAinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrArUrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5BbinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrUrUrUrNrNrNrGrUrGrGrCrN-OH
L5BcinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrUrUrNrNrNrCrArUrUrGrCrN-OH
L5BdinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrNrNrNrUrUrGrCrCrN-OH
L5CainvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrArUrUrUrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5CbinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrNrNrNrUrGrArGrCrN-OH
L5CcinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrUrNrNrNrArCrUrCrCrN-OH
L5CdinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrNrNrNrGrArUrUrGrCrCrN-OH
L5DainvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrUrUrNrNrNrCrUrUrN-OH
L5DbinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrArUrUrNrNrNrGrCrCrUrArN-OH
L5DcinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrUrNrNrNrUrGrUrUrCrN-OH
L5DdinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrGrArUrUrNrNrArArUrCrCrGrN-OH
L5 إي إيهinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrUrNrNrNrCrCrUrUrUrN-OH
L5EbinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrUrNrNrNrGrUrGrArArN-OH
L5EcinvddT-ACACrGrArCrCrUrCrCrGrUrUrNrNrNrUrUrUrCrCrN-OH
L5EdinvddT-ACACrGrArCrGrUrCrCrGrUrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PEApp-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

الجدول 4: تسلسل محولات الحمض النووي والحمض النووي الريبي اللازمة للربط على نهايات 5 و 3 من الحمض النووي الريبي الملتقط. تم تنقيتها من خلال HPLC الخالي من RNase.

  1. غسل الخرز 1x مع 500 ميكرولتر من WB I و 3x مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت NP-PNK. ضع العمود في أنبوب جديد وقم بتدوير المخزن المؤقت المتبقي.

6. الفسفرة على حبة من نهايات 5 'من الحمض النووي الريبي

  1. أضف 80 ميكرولتر من الخليط المحدد في الجدول 5 إلى الأعمدة. احتضان التفاعل لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ستكون العينات الآن مشعة للغاية. وبالتالي ، يجب تنفيذ جميع الأعمال اللاحقة خلف شاشة واقية ويجب التخلص من النفايات وفقا لقواعد الصحة والسلامة المحلية.
مكون1x7.5 أضعاف
5 × PNK العازلة16120
32P-ɣATP (10 μCi / μL)322.5
T4 PNK322.5
H2O58435
الحجم النهائي80 ميكرولتر600 ميكرولتر

الجدول 5: خليط تفاعل الفسفرة.

  1. أضف 1 ميكرولتر من 100 mM ATP واترك التفاعل يستمر لمدة 20 دقيقة أخرى. سيضمن ذلك أن جميع نهايات 5 بوصات تقريبا تحتوي على فوسفات لتسهيل ربط الرابط 5 بوصات.
  2. قم بإعداد أنابيب 2 مل ، خمسة لكل عينة.
  3. غسل الخرز 1x مع 500 ميكرولتر من WB I و 3x مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت NP-PNK. لاحظ أن هذه الاستخلاص ستكون مشعة للغاية وبالتالي يجب التخلص منها بشكل مناسب.
  4. انقل العمود إلى الأنبوب النهائي وقم بتدوير المخزن المؤقت المتبقي.

7. ربط حبة من رابط 5 '

ملاحظة: تحتوي الروابط مقاس 5 بوصات على رمز شريطي للحمض النووي الريبي يستخدم لتحديد كل عينة بعد التسلسل. وبالتالي ، من الأهمية بمكان ملاحظة الرابط المستخدم لأي عينة.

  1. أضف 78 ميكرولتر من الخليط الموصوف في الجدول 6 إلى الأعمدة. أضف 2 ميكرولتر من محول 5 بوصات (100 ميكرومتر ؛ انظر الجدول 4) إلى كل أنبوب واحتضانه طوال الليل عند 18 درجة مئوية.
مكون1x7.5 أضعاف
5 × PNK العازلة16120
ATP (10 مللي مول)860
مثبطات RNase215
T4 RNA ligase430
H2O48360
الحجم النهائي78 ميكرولتر585 ميكرولتر

الجدول 6: خليط تفاعل ربط الرابط 5 '.

  1. في اليوم التالي ، اغسل الخرز 1x مع 500 ميكرولتر من WB I و 3x مع 500 ميكرولتر من WB II وانقل الأعمدة إلى أنبوب جديد سعة 2 مل.

8. الشطف ، SDS-PAGE ، واستخراج الحمض النووي الريبي

  1. اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية. تحضير صفين من أنابيب 1.5 مل لكل عينة للشطف.
  2. قم بتدوير حجم الفراغ للأعمدة باستخدام حبات النيكل مع دوران سريع. ضع الأعمدة في الصف الأول من أنابيب الشطف وأضف 200 ميكرولتر من محلول الشطف. انتظر 2 دقيقة ، ثم فرض المخزن المؤقت من خلال العمود مع دوران سريع.
  3. انقل الأعمدة إلى الصف الثاني من الأنابيب وكرر الخطوة 8.2. ستحتوي كل عينة الآن على 400 ميكرولتر من الشطف في المجموع ، مقسمة على أنبوبين سعة 1.5 مل.
    1. خذ كل الشطف وانقله معا إلى أنبوب سعة 5 مل. أضف 2 ميكرولتر من 20 مجم / مل من الجليكوجين. وبالتالي ، إذا استخدمت سبع عينات ، فسيكون هناك الآن 2.8 مل من الشطف المجمع في الأنبوب سعة 5 مل.
  4. أضف 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) لكل عينة [على سبيل المثال 700 ميكرولتر من TCA ل 7 عينات (2.8 مل من الشطف المجمع)] إلى أنبوب 5 مل ، وبئر دوامة لمدة 30 ثانية.
  5. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية ، في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الأنبوب المخروطي ، وتحقق من الماصة باستخدام عداد جيجر للتأكد من عدم إزالة الحبيبات عن طريق الخطأ. إذا كان الأمر كذلك ، فأعد المادة الطافية إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق أخرى.
    ملاحظة: قد لا يزال العنصر الطافي شديد الإشعاع. تأكد من استخدام التدريع المناسب.
  8. أعد تعليق الحبيبات بالكامل في 2 مل من الأسيتون المثلج.
  9. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية.
  10. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأسيتون باستخدام ماصة P1000. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع قطرات صغيرة من الأسيتون ، ثم قم بإزالته باستخدام ماصة P10. يجف لمدة 2 دقيقة في غطاء الدخان.
    ملاحظة: يمكن أن يظل طاف الأسيتون مشعا. تأكد من استخدام التدريع المناسب.
  11. أعد تعليق العينة في 30 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت لتحميل البروتين. لضمان إعادة استخدام الحبيبات بشكل صحيح ، تحقق من أن الغالبية العظمى من النشاط الإشعاعي موجودة الآن في المخزن المؤقت للتحميل ولا تترك في أنبوب 1.5 مل عن طريق إزالة المحلول في ماصة P200 وقياس النشاط المتبقي في أنبوب 1.5 مل باستخدام عداد جيجر.
  12. سخني العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. قم بالتحميل على جل Bis-Tris مسبق الصب مقاس 1 مم ، 4-12٪ وقم بتشغيله لمدة 1.5 ساعة عند 125 فولت في مخزن MOPS المؤقت.
  13. بعد انتهاء تشغيل الجل ، افتح شريط الهلام. يجب الاحتفاظ بالهلام على اللوحة السفلية. تخلص من الجزء العلوي.
  14. لف الجل في فيلم التشبث ثم ثبته باستخدام شريط لاصق داخل شريط كاسيت محكم الغلق. تأكد من أن الدرج يحتوي على شاشة تضخيم لتحسين الإشارة.
  15. قم بتعريض فيلم التصوير الشعاعي الذاتي للهلام وتخزين الكاسيت في درجة حرارة -80 درجة مئوية أثناء التعرض. سيختلف وقت التعرض بين البروتينات ذات الكفاءات المتشابكة المختلفة.
    1. عند وضع الفيلم ، يجب أن تكون هناك طريقة لإعادة تنظيمه إلى الكاسيت من أجل قطع نطاق الاهتمام في الخطوة التالية. لضمان ذلك ، استخدم مسطرة الفلورسنت وتأكد أيضا من أن الجل موجود في زاوية الكاسيت ، والذي يتم تغطيته بعد ذلك بالفيلم الموجود أيضا في الزاوية القصوى.
      ملاحظة: كقاعدة عامة ، فإن التفريغ في المخزن المؤقت للتحميل الذي يعطي قراءة لا تقل عن ~ 250 cps عند عرضه على عداد Geiger يعطي إشارة كافية للتعرض لمدة 3 ساعات. خلاف ذلك ، يتم تنفيذ التعرض بين عشية وضحاها.
  16. تطوير الفيلم. اقطع طبقة التشبث التي تغطي الجل ولكن لا تحرك الجل. خلاف ذلك ، سيتم إزاحة الصورة من الجل.
    ملاحظة: من المحتمل أن يكون الجل مشعا للغاية. تأكد من استخدام التدريع المناسب عند قطع شريحة الجل.
  17. ضع الفيلم فوق الجل واستبعد شريط الاهتمام. ضع شريحة الجل في أنبوب سعة 2 مل.
  18. سحق شريحة الجل باستخدام طرف ماصة P1000 وأضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبروتين K بالإضافة إلى 200 ميكروغرام من البروتيناز K (يستخدم هذا البروتوكول 10 ميكرولتر من محلول 20 مجم / مل بروتيناز K). احتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية مع اهتزاز قوي.
  19. بعد ذلك ، قم بقطع نهاية طرف P1000 بمشرط نظيف وانقل قطع المادة الطافية والهلام إلى عمود دوران يوضع في أنبوب سعة 2 مل.
  20. أدر العمود لمدة 1 دقيقة عند 17000 × جم في RT. اجمع التدفق ، الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي المشع والمعزول.
  21. أداء الفينول: استخراج الكلوروفورم.
    1. أضف 50 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة = 5.2 ، و 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم والدوامة جيدا. تدور لمدة 5 دقائق عند 17000 × جم. أزل الطبقة العلوية المائية وضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    2. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة بقوة لمدة 10-15 ثانية. قم بالدوران لمدة 5 دقائق عند 17000 × جم في RT. قم بإزالة الطبقة المائية وضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    3. أضف 1 ميكرولتر من 20 مجم / مل من الجليكوجين و 1 مل من الثلج البارد ، 96٪ إيثانول. يترسب لمدة 30 دقيقة عند -80 درجة مئوية أو طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
    4. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، 17000 × جرام. قم بإزالة المادة الطافية ، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية عند 17000 × جم. قم بإزالة كل الإيثانول ، وقم بإجراء دوران سريع لجمع البقايا وإزالة الفائض باستخدام ماصة P10.
    5. جفف الحبيبات لمدة ~ 3 دقائق في غطاء الدخان. إعادة التعليق في 20 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.
  22. قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية طوال الليل أو انتقل فورا إلى خطوة النسخ العكسي.

9. النسخ العكسي

  1. أضف 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر RT oligo (PE_reverse ؛ انظر الجدول 7) و 4 ميكرولتر من 5 mM dNTPs إلى 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.
اسم قليل النوكليوتيدالتسلسل (5'-3')
P5 إلى الأمامAATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTCTCTCCCTACACGACGCTTCCGATCT
ه1CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCT
ه3CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه4CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه5CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATCACTGTGACTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه7CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه8CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATTAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه9CAAGCAGAAGAGGGCATACGAGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ه10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PE_reverseCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

الجدول 7: بادئات PCR (بما في ذلك تسلسل الباركود) والتمهيدي للنسخ العكسي.

  1. انقله إلى كتلة حرارية مسخنة مسبقا على حرارة 85 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم ابرد على الثلج لمدة 5 دقائق. اجمع محتويات الأنبوب عن طريق الطرد المركزي القصير ثم أضف 8 ميكرولتر من 5x مخزن النسخ العكسي المؤقت ، و 2 ميكرولتر من 100 مللي متر DTT ، و 2 ميكرولتر من مثبط RNase.
  2. احتضان الخليط على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم أضف 2 ميكرولتر من النسخ العكسي واحتضانه لمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية.
  3. قم بتعطيل النسخ العكسي عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. انقل الأنابيب إلى كتلة حرارية مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية واتركها لمدة 3 دقائق لتتأقلم.
  5. أضف 2 ميكرولتر من RNase H واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. عزل cDNA باستخدام حبات SPRI.
    1. أضف مجلدين من 84 ميكرولتر من الخرز. احتضان لمدة 15 دقيقة. ضع الخرزات على رف مغناطيسي واتركها لمدة 1 دقيقة لحصاد الخرز.
    2. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها وإضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. لا تقم بإزالة الخرز من الرف المغناطيسي. احتضان الخرز مع الإيثانول لمدة 30 ثانية.
    3. قم بإزالة الإيثانول وكرر خطوة الغسيل. قم بإزالة كل الإيثانول المتبقي باستخدام طرف P10.
    4. ضع الخرزات في غطاء دخان لمدة 2 دقيقة لتجفيفها. قم بإزالة الخرزات من الرف ، وأعد تعليقها في 12 ميكرولتر من الماء ، ثم أعد الخرزات إلى الرف. إزالة 11 ميكرولتر من طاف.
  7. قم بتجميد cDNA عند -20 درجة مئوية أو انتقل فورا إلى خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

10. رد فعل qPCR

  1. قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي لتضخيم cDNAs ، يتم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) لتحديد العدد الأمثل للدورات لتضخيم cDNAs لمنع الإفراط في تضخيم المكتبة.
  2. قم بإعداد تفاعل qPCR على الجليد وفقا للجدول 8. انظر الجدول 7 لجميع الاشعال.
مكون1x
2x qPCR تفاعل ماستر ميكس5
0.1 ميكرومتر P5 التمهيدي (إلى الأمام)0.8
0.1 ميكرومتر BC التمهيدي (عكسي)0.8
cDNA (أو الماء كعنصر تحكم سلبي)1
H2O2.4
الحجم النهائي10 ميكرولتر

الجدول 8: خليط تفاعل qPCR.

  1. من أجل التحديد الكمي المناسب للدورات اللازمة للتضخيم ، استخدم ثلاث نسخ تقنية ل cDNA وثلاثة ضوابط سلبية (أي الماء).
  2. أغلق الألواح بغشاء شفاف بصريا وقم بتشغيل qPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة.
  3. قم بتحليل العينات من خلال طريقة القياس الكمي المطلق لتحديد عدد الدورات (n) التي يتم فيها الوصول إلى ركبة النمو الأسي (انظر الشكل 4C للحصول على مثال). ثم يستخدم هذا العدد من الدورات للتضخيم النهائي لبقية الحمض النووي الكيميائي.

11. تفاعل PCR واستخراج هلام

  1. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد وفقا للجدول 9. انظر الجدول 7 لجميع الاشعال.
    ملاحظة: يتم استخدام 5 ميكرولتر فقط من مكتبة cDNA.
مكون1x
10 × تدقيق قراءة البوليميراز العازلة5
10 ميكرومتر P5 التمهيدي (إلى الأمام)1
10 ميكرومتر BC التمهيدي (عكسي)1
5 مللي متر dNTPs2.5
دليل على قراءة إنزيم البلمرة1
cDNA5
H2O34.5
الحجم النهائي50 ميكرولتر

الجدول 9: خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

  1. قم بتشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ n دورات من 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم تحديد عدد (n) من الدورات لتضخيم مكتبة χCRAC بواسطة qPCR الموضح في القسم 10.
  2. يضاف 1 ميكرولتر من إكسونوكلياز I ويحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  3. قم بتنظيف cDNA المضخم باستخدام حبات SPRI كما هو موضح أعلاه باستخدام مجلدين من الخرز (أي 100 ميكرولتر). Elute في 11 ميكرولتر.
  4. أضف 3 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x وقم بتشغيلها على جل TBE 6٪ مسبق الصب عند 100 فولت لمدة 1 ساعة في 1x TBE buffer. استخدم سلما مناسبا لتحديد شظايا الحمض النووي القصيرة.
  5. بمجرد الانتهاء ، أخرج الجل من الكاسيت وضعه في وعاء مناسب محكم الغلق مع ما يكفي من 1x TBE لتغطية الجل (على سبيل المثال ~ 50 مل). أضف كمية مناسبة من صبغة SYBR الآمنة (على سبيل المثال ، ل 50 مل ، استخدم 5 ميكرولتر من صبغة 10000x)
  6. اترك الجل ملطخا من خلال الخلط اللطيف لمدة 15 دقيقة في RT. صفي 1x TBE المحتوي على SYBR واستبدله ب 1x TBE نظيف. اغسل الجل لمدة 10 دقائق مع هز لطيف في RT.
  7. صفي 1x TBE وضع الجل في مجلد شفاف. قص المجلد إلى الحجم المناسب.
  8. تخيل الجل من خلال وسيلة مناسبة مثل جهاز تصوير الفوسفور. شظايا الحمض النووي المكوس بين ~ 175 bp و ~ 400 bp. ضع شريحة الهلام في أنبوب سعة 1.5 مل.
  9. حطم شريحة الجل جيدا باستخدام طرف P1000 وأضف 400 ميكرولتر من H2O. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 1 ساعة في كتلة حرارية.
  10. قم بتجميد العينة على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق ، ثم ضعها مرة أخرى في الكتلة الحرارية عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 1 ساعة.
  11. قم بإنشاء وحدة مرشح عن طريق أخذ عمود مرشح وإدخال مرشحين من الألياف الدقيقة الزجاجية بالداخل. ضع الوحدة في أنبوب سعة 1.5 مل.
  12. اقطع طرف طرف P1000 بمشرط نظيف وتناول تعليق جل TBE المهروس ، ثم وزعه في وحدة المرشح التي تم إنشاؤها في الخطوة 11.12. تدور عند 17000 × جم لمدة 30 ثانية.
  13. أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين إلى المادة الطافية ، إلى جانب 40 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة = 5.2 ، و 1 مل من الإيثانول بنسبة 96٪. احتضان في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  14. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 17000 × جم ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
  15. أدر لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة الإيثانول تماما ثم جفف الحبيبات في غطاء دخان لمدة 3 دقائق.
  16. أعد التعليق في 10 ميكرولتر من H2O وقم بقياس تركيز الحمض النووي.

النتائج

لإثبات فعالية طريقة χCRAC ، تم إجراء تجربة دورة زمنية مع سلالات الخميرة التي تعبر عن بروتين Nrd1 الموسوم ب HTP. يتم توفير تمثيل تخطيطي مفصل يصف كيفية عمل الطريقة في الشكل 1. مثل Nab3 ، يشارك Nrd1 في اضمحلال الحمض النووي الريبي لمجموعة متنوعة من نسخ الحمض النوويالريبي 37. اقترح العمل السابق من مختبر كوردن أن ارتباط Nrd1 بأهداف الحمض النووي الريبي يتغير بشكل كبير عندما تتعرض الخلايا لتجويع الجلوكوز28,38. على هذا النحو ، تم تحويل الخلايا التي تنمو بشكل كبير في وسط يحتوي على الجلوكوز (SD-TRP) إلى نفس الوسط بدون الجلوكوز (S-TRP) على مدار فترة زمنية لمراقبة التغيرات الديناميكية في تفاعلات Nrd1-RNA. تم أخذ العينات وربطها في غرفة Vari-X-linker (الشكل 3A) قبل التحول ثم بعد 1 و 2 و 4 و 8 و 14 و 20 دقيقة. كان الوسط المستخدم لنمو الخلايا ناقصا عمدا في التربتوفان لتقليل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بواسطة هذا الحمض الأميني العطري. لاحظ أنه من الأفضل استخدام وسيط اصطناعي معقم بالفلتر لأن تعقيم الوسط يمكن أن يؤدي إلى كراميل السكريات. هذا يقلل من كفاءة الربط المتقاطع.

يوضح الشكل 4 أ صورة إشعاعية ذاتية تمثيلية من تجربة χCRAC. لاحظ أنه في هذا المثال، لم يتم تجميع العينات معا. بدلا من ذلك ، تم تشغيل كل منها على حدة على الجل. يوصى بهذا للاختبارات التجريبية الأولية لإظهار أن البروتين يرتبط بشكل فعال بالحمض النووي الريبي في جميع النقاط الزمنية التي تم اختبارها. لوحظت إشارة مكثفة بشكل خاص عند الوزن الجزيئي المتوقع ل RBP ، مما يمثل البروتين المرتبط ب RNAs قصيرة جدا وموسومة إشعاعيا غير قابلة للتسلسل. لذلك ، تم عزل الإشارة المشوهة فوق هذا النطاق ، وهي البروتين المتشابك بشظايا الحمض النووي الريبي الأطول. تم قطع الجزء من أعلى شريط البروتين مباشرة بالإضافة إلى حوالي 30 كيلو دالتون. يوضح الشكل 4B صورة إشعاعية ذاتية بعد الاستئصال ، مع ربط البروتين بالحمض النووي الريبي القصير المتبقي في الجل والإشارة المشوهة السابقة التي تم استئصالها الآن.

بعد النسخ العكسي ، يجب تضخيم مكتبة cDNA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، يجب تجنب الإفراط في تضخيم المكتبة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى التحيز نحو التسلسلات التي يتم تضخيمها بشكل تفضيلي بواسطة البلمرة وتوليد مصنوعات PCR. تحتوي المكتبات المضخمة أيضا على عدد كبير من التسلسلات المكررة التي تهدر القراءات على جهاز التسلسل. من أجل حساب العدد المثالي لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم المكتبة النهائية ، تم تضخيم حصة من cDNA من خلال qPCR باستخدام قليل النوكليوتيدات P5 و BC. تم اختيار الدورة الأولى التي وصلت فيها المكتبة إلى ذروة التألق كعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يعطي الشكل 4C مثالا على qPCR من مكتبة cDNA نموذجية ، والتي أسفرت عن عدد دورات الذروة 16. ثم تم استخدام هذه القيمة ل χCRAC PCR النهائي. من أجل معالجة البيانات المتسلسلة ، استخدمنا برنامجا تم تطويره مسبقا في مختبرنا (pyCRAC) وخط الأنابيب المقابل لتحليل بيانات CRAC الحركية (Nues et al. ، 2017 ؛ https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac ، https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). تتيح أدوات البرامج مفتوحة المصدر هذه إزالة تعدد إرسال البيانات وتشذيبها ، وإزالة تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحديد القمم ذات الدلالة الإحصائية ، وقراءات الكتلة في تسلسلات متجاورة ، وتحديد الزخارف الملزمة39. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية عمل هذه الأدوات على صفحات الويب الخاصة بها.

بدأنا أيضا في تطوير بروتوكول χCRAC لخلايا الثدييات. تزرع غالبية خطوط خلايا الثدييات كطبقة أحادية والصينية الموجودة في الرابط المتشابك مع الكيس القابل للنفاذ للأشعة فوق البنفسجية غير مناسب للتجارب مع الخلايا الملتصقة. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير مرحلة حيث يمكن للمستخدمين تشعيع 1-2 أطباق بتري بالأشعة فوق البنفسجية (قطر 150 مم وعمق 25 مم) بخلايا ملتصقة (الشكل 3 ب). كاختبار أول ، تم قياس كفاءة الرابط المتقاطع لخلايا الثدييات من خلال الربط المتقاطع والتقاط GFP-RBM7 الموسوم بثبات باستخدام الأجسام المضادة ل GFP والتنقية التقليدية القائمة على CLIP. كما هو موضح في الشكل 5 أ ، كان الرابط المتقاطع قادرا على استعادة معقدات البروتين والحمض النووي الريبي من خلايا الثدييات المزروعة كطبقة أحادية باستخدام تشعيع الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر بكفاءة مماثلة لجهاز تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن الأواني البلاستيكية القياسية لزراعة الخلايا المستخدمة عادة في تجارب الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية لا يمكن اختراقها إلى 254 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، في الرابط المتقاطع الخاص بنا ، ستتلقى الخلايا فقط الإشعاع من الضفة العلوية لمصابيح الأشعة فوق البنفسجية. للتغلب على هذا ، قمنا بتطوير طبق بتري كوارتز نافذ للأشعة فوق البنفسجية لنمو الخلايا والربط المتقاطع. أظهر استخدام أدوات زراعة الكوارتز انتعاشا قويا لمجمعات البروتين والحمض النووي الريبي مع أقل من 2 ثانية من الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 5 ب). عند دمجها مع طرق التقاط كرات الدم الحمراء لخلايا الثدييات مثل تقنيات CLIP ، فإن أوقات الربط المتقاطع القصيرة هذه قابلة للتعديل مع دورات زمنية لاستعادة ملامح ربط الحمض النووي الريبي الزماني المكاني ل RBPs استجابة للإجهادات السمية الجينية أو الاستنفاد السريع لعوامل البروتين ، أو بالتوازي مع تزامن دورة النسخ أو الخلية.

يوضح الشكل 6 عدة أمثلة على بيانات Nrd1 التي تمت معالجتها بواسطة خط أنابيب χCRAC. تم إعداد هذا الرقم باستخدام ملفات bedgraph التي تم إنشاؤها بواسطة خط الأنابيب وحزمة python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) ، والتي صممناها لتبسيط إنشاء صور متصفح الجينوم بجودة النشر للبيانات. تمثل المستطيلات الرمادية المناطق الجينومية التي عبرت عن الحمض النووي الريبي غير المشفر ، مثل النسخة غير المستقرة المشفرة (CUTs) ، والنصوص المستقرة غير المميزة (SUTs) 40 ، والنصوص غير المستقرة الحساسة ل Xrn1 (XUTs) 41. تظهر البيانات الواردة في الشكل 6 أن Nrd1 يرتبط بالعديد من نسخ الحمض النووي الريبي غير المشفرة هذه ، بما يتفق مع فكرة أن هذا البروتين متورط في تدهور هذه الفئة من النسخ42. يوضح الشكل 6 أ منطقة ~ 15 كيلو بايت على الكروموسوم الرابع. هنا كانت هناك زيادة كبيرة في ربط Nrd1 بالنصوص التي تشفر ناقلات الجلوكوز عالية التقارب HXT6 و HXT7 ، وكلاهما يتم تنظيمه أثناء تجويع الجلوكوز. من المحتمل أن يؤثر إنهاء النسخ بواسطة مجمع NNS على حركية الحث لهذه الجينات أثناء تجويع الجلوكوز. يوضح الشكل 6B مثالا على الارتباط المتقاطع Nrd1 بنسخة Imd3 ، والتي من المعروف أنها منظمة بواسطة Nab343. في هذه الحالة ، أظهرت البيانات انخفاضا كبيرا في الارتباط بتجويع الجلوكوز. أظهر العمل السابق انخفاضا في ارتباط Nab3 بنسخة Tye7 أثناء تجويع الجلوكوز44. تمشيا مع هذه الملاحظة ، تشير بيانات χCRAC إلى أن ارتباط Nrd1 انخفض أثناء تجويع الجلوكوز وأن الارتباط المتقاطع Nrd1 ب Tye7 كان في أدنى مستوياته بعد 8 دقائق من الإجهاد (الشكل 4C). ومع ذلك ، يبدو أن هذا التأثير كان عابرا فقط ، لأنه بعد 14 دقيقة من تجويع الجلوكوز ، عاد ربط Nrd1 إلى مستويات البداية.

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكول χCRAC. نمت سلالات الموسومة حتى الكثافة المطلوبة. يشير RBP إلى بروتين ملزم للحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، تم أخذ عينة مرجعية وربطها بضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. تم حصاد الخلايا المتبقية عن طريق الترشيح ثم تحولت بسرعة إلى الوسط الذي يسبب الإجهاد. بالنسبة لتجربة χCRAC الموصوفة هنا ، تم أخذ العينات وربطها ب 1 و 2 و 4 و 8 و 14 و 20 دقيقة بعد التحول (1). ثم تم تنقية RBP من الفائدة باستخدام تنقية تقارب صارمة للغاية من خطوتين (2). بعد ذلك ، تم هضم الحمض النووي الريبي المتصالب الذي تم التقاطه جزئيا باستخدام RNases ، وتم وضع علامة إشعاعية في نهاية 5 'وتم ربط المحولات عليها (3). احتوت المحولات مقاس 5 بوصات على تسلسلات باركود فريدة "قيد القراءة" بحيث يمكن فصل العينات الفردية معلوماتيا حيويا بعد التسلسل. ثم تم تفكيك معقدات RBP-RNA وتجميعها وترسيبها معا (4) ، وتم حلها بواسطة SDS-PAGE وتصورها من خلال التصوير الشعاعي الذاتي (5). بعد ذلك ، تم قطع شريحة هلام واحدة تحتوي على الإشارة المشعة فوق الشريط الرئيسي مباشرة ، موضحة بمربع أحمر متقطع في صورة التصوير الشعاعي الذاتي ، من الجل (5). تمت معالجة شرائح الهلام بالبروتياز K وتم استخراج الحمض النووي الريبي لاحقا (6) ، وتحويله إلى cDNAs ، وتضخيمه من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (7). أدخلت خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل رموزا شريطية إضافية (كتلة صفراء أدخلتها P7 oligo) بحيث يمكن مضاعفة العديد من المكتبات في ممر واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الربط المتقاطع والترشيح بالفراغ. (أ) الرابط المتقاطع. يسكب تعليق الخلية في قمع موجود في أعلى يمين الجهاز (انظر أيضا الشكل 3 أ للحصول على صورة مقربة) ويتم الاحتفاظ به في كيس شفاف للأشعة فوق البنفسجية موجود في الدرج الأوسط. هذه الحقيبة محاطة بمصارعين يظلان مغلقين حتى يوجه المستخدم الجهاز لبدء خطوة التشعيع. يتم تشعيع الخلايا بضوء الأشعة فوق البنفسجية من الصواني أعلى وأسفل. تأتي الماكينة مزودة بمصابيح UV 254 و 365 نانومتر ، مع تطبيق الأخير على تجارب PAR-CLIP. يتم تشغيل الجهاز من خلال لوحة تعمل باللمس تقع في أعلى اليمين والتي تسمح للشخص بالتحكم في جرعة الأشعة فوق البنفسجية أو وقت التعرض. (ب) بعد الربط المتبادل، يتم تصريف الخلايا من الجانب الأيسر من الجهاز. يتم استرداد معلقات الخلايا من خلال الفراغ وتصريفها في قارورة زجاجية حيث يمكن سكبها لاحقا في جهاز ترشيح الفراغ للحصاد. (ج) أجهزة الترشيح بالفراغ. يتم فتحها وإغلاقها عبر مشبك ويتم إدخال مرشح بينها. تم استخدام أربعة أجهزة ترشيح بالتوازي لسلاسل زمنية قصيرة جدا لعدم ضياع أي وقت نتيجة لتغيير المرشحات. (د) بعد الترشيح، تم تصريف طاف الوسائط في قوارير للتخلص منها لاحقا. تم تركيب صمامات أسفل أجهزة ترشيح الفراغ للحفاظ على الفراغ في النظام عند إزالة الفلتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الربط المتقاطع للخلايا العالقة مقابل الخلايا الملتصقة. (أ) الوصلة المتقاطعة مع غرفة Vari-X-linker لخلايا التعليق. يتم سكب ثقافة الخلية في مدخل العينة (القمع) الموجود في أعلى يمين الدرج. (ب) صينية يمكن أن تحتوي على أطباق بتري من البلاستيك أو الكوارتز لربط الخلايا المتصالقة أو أحجام صغيرة من الخلايا المعلقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: إعداد المكتبة. (أ) مثال على مخطط إشعاعي ذاتي من تجربة Nrd1-HTP χCRAC. تمثل الإشارة القوية والمركزة البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي القصير جدا ، بينما تمثل اللطاخة أعلاه البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي ذي الطول الكافي للتسلسل. (ب) تم استئصال اللطاخة كما هو موضح في صورة إشعاعية ذاتية مأخوذة بعد استئصال الهلام. (ج) qPCR تمثيلي من مكتبة cDNA χCRAC. في هذا المثال ، تم الوصول إلى أقصى تضخيم للحمض النووي cDNA عند 16 دورة. وهكذا ، تم استخدام 16 دورة للتضخيم النهائي. يمثل شريط الخطأ الانحراف المعياري لثلاث نسخ طبق الأصل qPCR الفنية. د: مثال على فسفرة من مكتبة cDNA على 6٪ من هلام TBE . ه: تحليل طول الحمض النووي (cDNA) وجودته من الرحلان الكهربي الشعري القائم على الرقاقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: اختبار RNase العالي تجربة iCLIP لاختبار التشابك في خلايا الثدييات. تظهر الصور الشعاعية الذاتية من تجارب GFP-RBM7 iCLIP التي اختبرت كفاءة استرداد RNP عبر مختلف طاقات الربط المتقاطع. تم إجراء الترسبات المناعية باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل GFP مقترنة بالخرز المغناطيسي على الخلايا المتشابكة التي عبرت بثبات عن GFP-RBM7. تم تحضين الرواسب المناعية بتركيزات عالية من RNase I من أجل تقليم الحمض النووي الريبي المرتبط بأطوال قصيرة وموحدة. تم تصور RNPs بواسطة وضع العلامات 32P و SDS-PAGE والهجرة كنطاق محدد ، بالقرب من هجرة البروتين غير المتصالب. يشير القياس الكمي إلى نتائج تحليلات قياس الكثافة لإشارة RBM7-RNA الموسومة إشعاعيا والتي تم تطبيعها إلى إشارة اللطخة الغربية المضادة ل GFP. (أ) المسار الزمني للربط المتقاطع للوصلة المتقاطعة UVP شائعة الاستخدام مقابل الرابط المتقاطع الخاص بنا (Vari-X-linker ؛ VxL). (ب) المسار الزمني المتقاطع للرابط المتقاطع الخاص بنا على أدوات ثقافة الكوارتز (يسار) والبلاستيك (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مثال على مخططات متصفح الجينوم التي توضح قوة χCRAC لإظهار الارتباط التفاضلي والزمني ل Nrd1 بأهدافه. يعرض كل مربع مخططات لمناطق جينومية فردية. تشير الأسهم إلى الشريط الذي يتم ترميز الجينات عليه (سهم التأشير الأيسر = ناقص حبلا ؛ سهم التأشير الأيمن = زائد حبلا). تتم الإشارة إلى النقاط الزمنية (دقيقة) بواسطة t0 و t1 و t2 وما إلى ذلك على المحاور y لكل مؤامرة فرعية. يتم عرض الأرقام الرومانية التي تشير إلى الكروموسومات والإحداثيات. (أ) عند الحرمان من الجلوكوز ، يربط Nrd1 ناقلين للجلوكوز عالي التقارب ، HXT6 و HXT7 ، وكلاهما غير منظم في هذه الحالة. (B) لوحظ أن Nrd1 يرتبط ب IMD3 ، وهو هدف تم التحقق من صحته بالفعل ل Nab344 ، مع تقليل الكثافة بعد تجويع الجلوكوز. (C) يظهر ارتباط Nrd1 ل Tye7 طبيعة ديناميكية وعابرة ، حيث يتناقص بعد تجويع الجلوكوز إلى الحد الأدنى بعد 8 دقائق من الإجهاد. ومع ذلك ، يعود الربط لاحقا إلى المستويات القاعدية بعد 14 دقيقة. تم تطبيع القراءات إلى "قراءات لكل مليون" (RPM ؛ المحور ص). تشير المربعات الرمادية إلى المناطق التي تشفر الحمض النووي الريبي غير المشفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تتمتع طريقة χCRAC ، جنبا إلى جنب مع أجهزة الربط المتقاطع وحصاد الخلايا الجديدة ، بإمكانات كبيرة لأنها قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من الكائنات النموذجية ، وبالتالي يجب أن تكون ذات أهمية عامة لمجال الحمض النووي الريبي. هناك العديد من المجالات التي يمكن فيها استخدام χCRAC. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الطريقة لقياس التجمع الهرمي للبروتينات في معقدات جزيئية كبيرة ، مثل spliceosome والريبوسوم ، والتي غالبا ما تتضمن تفاعلات ديناميكية بين البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي. كما نستخدمه الآن بشكل روتيني لمراقبة التفاعلات بين عوامل اضمحلال الحمض النووي الريبي وركائزها عندما تتعرض الخلايا لأنواع متنوعة من الضغوط. وهذا يمكننا من تحديد مرحلة الاستجابة التكيفية الأكثر نشاطا لهذه العوامل، والركائز التي ترتبط بها، ومدى ديناميكية هذه التفاعلات. وينبغي أن تمكن هذه البيانات الباحثين من تحديد المساهمة النسبية لكل عامل في التكيف مع التغيرات البيئية.

يستخدم χCRAC علامات تنقية التقارب المزدوج (HTF أو HTP) لتنقية البروتين في ظل ظروف صارمة للغاية وتغيير طبيعة المرض. هذا يضمن أن الحمض النووي الريبي المنقى عالي التخصيب للحمض النووي الريبي الذي كان مرتبطا تساهميا بالبروتين محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن الاعتماد على علامات التقارب له عيوب. على سبيل المثال ، يمكن أن تتداخل العلامة مع وظيفة البروتين ، مما قد يعطي قراءة مشوهة لتفاعل ربط الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لبعض الكائنات الحية النموذجية ، قد لا يكون من الممكن دائما استخدام العلامات لأن الأدوات الجينية لدمج شظايا الحمض النووي في الجينوم أو لتحويل بلازميدات التعبير ليست متاحة بعد. ومع ذلك ، من السهل تغيير بعض أجزاء بروتوكول χCRAC لجعله متوافقا مع البروتوكولات المستندة إلى CLIP التي تعتمد على الأجسام المضادة لتنقية RBP. في الواقع ، أظهرت هذه الدراسة أنه من الممكن الجمع بين عمليات التنقية المستندة إلى iCLIP مع الرابط المتشابك الخاص بنا. نحن الآن بصدد تطوير بروتوكولات CLIP لدراسة الارتباط الزمني للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي البشري مع نسخ الحمض النووي الريبي الوليدة.

عند إجراء χCRAC على بروتين جديد ، يجب تحسين التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل إحداث أقصى قدر من الربط المتقاطع. هذا مهم لأن التعرض العالي للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يقلل من استعادة الحمض النووي الريبي أثناء خطوة التنقية. تعرضت الخلايا التي تعبر عن RBP المؤتلف لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية ، 100 مللي جول / سم 2 ، 250 مللي جول / سم 2 ، 500 مللي جول / سم 2 ، و 1 جول / سم 2. ثم تم التقاط RNPs وتم تجزئة الحمض النووي الريبي وتمييزه إشعاعيا. بعد ذلك ، تم حل RNPs بواسطة SDS-PAGE وتم أخذ مخطط إشعاعي ذاتي من أجل استنتاج التعرض الذي أعطى الإشارة الأكثر كثافة (أي الارتباط المتقاطع الأقصى).

بمجرد تحسين الظروف التجريبية ، يوصى بإجراء العديد من تجارب التحكم عند إجراء χCRAC. أولا ، يمكن استخدام عينة مشعة بالأشعة فوق البنفسجية وغير موسومة لمراقبة ارتباط الخلفية بخرز التنقية. ثانيا ، عند تطبيق χCRAC أثناء تجربة التحول ، فإن سلسلة زمنية ثانية حيث يتم نقل الخلايا مرة أخرى إلى الوسط الأصلي تمكن من التحقيق فيما إذا كان ترشيح الخلايا نفسها يؤدي إلى تغييرات في مستويات الحمض النووي الريبي أو تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي.

كما هو مذكور في المقدمة ، تقترح العديد من الأوراق المنشورة مؤخرا عددا من التحسينات على بروتوكول CLIP. يتضمن ذلك استخدام محولات ذات علامات فلورية للكشف عن مركب البروتين والحمض النووي الريبي من خلال المسح بالأشعة تحت الحمراء10 بالإضافة إلى التحسينات على مختلف خطوات تنقية الحمض النووي واختيار الحجم التي تظهر لزيادة تعقيد المكتبات الناتجة12,45. نقوم حاليا بتنفيذ بعض هذه التحسينات لزيادة تحسين بروتوكول χCRAC. يحتوي البروتوكول المقدم هنا بالفعل على عدد من التحسينات على بروتوكولات CRAC و χCRAC الأصلية التي تزيد من تعقيد البيانات. على سبيل المثال ، في السابق ، بعد حل مجمعات الحمض النووي الريبي للبروتين المشع المتشابكة على المواد الهلامية SDS-PAGE ، تم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز وتم عزل الحمض النووي الريبي المتقاطع من اللطخة. ومع ذلك ، فإن نقل RNP واستخراج الحمض النووي الريبي اللاحق يمكن أن يكون غير فعال للغاية ، لا سيما عند التعامل مع كرات الدم الحمراء الكبيرة مثل الوحدات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كبير في استعادة الحمض النووي الريبي عبر الارتباط. في البروتوكول الحالي ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي المتقاطع مباشرة من شرائح هلام SDS-PAGE كما هو موضح في الشكل 1. هذا زاد من استعادة الحمض النووي الريبي عبر الارتباط. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل cDNAs ، تم حل المنتج في الأصل على 3٪ ، وهلام الأغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة ، ثم تم استخراج منتجات PCR 175-300 bp من الجل. ومع ذلك ، يمكن تحميل هذه المواد الهلامية بسهولة ، مما يؤدي إلى فصل ضعيف للغاية للحمض النووي. أدى استبدال جل الأغاروز بجل TBE مسبق الصب إلى فصل حجم أكثر اتساقا واستعادة أفضل لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الإفصاحات

ينتمي A. Langford و W. Worboys إلى UVO3 ، وهي شركة تجارية. لم يكن لهم أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسيرها أو قرار تقديم العمل للنشر.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من Wellcome Trust (091549 إلى SG و 109093 / Z / 15 / A إلى SM) ، ومركز Wellcome Trust للمنحة الأساسية لبيولوجيا الخلية (092076) وزمالة البحوث العليا غير السريرية لمجلس البحوث الطبية (MR / R008205 / 1 إلى SG) ، المنظمة الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية في إطار زمالة ما بعد الدكتوراه طويلة الأجل (ALTF 1070-2017 إلى R.A.C) ، وصندوق البحوث المستقل في الدانمرك (T.H.J).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،4-dithioreitolMerck10708984001مكون عازل في تحلل خلايا
أنابيب 1.5 ملEppendorf0030 120.086أنبوب التفاعل العام
2 مل أنابيبEppendorf0030 123.344لعقد الأعمدة وجمع النفايات
32P-yATPPerkin ElmerNEG502Z-250لوضع العلامات الراديوية على نهاية 5 'من الحمض النووي الريبي
4-12٪ هلام Bis-TrisInvitrogenNP0321BOXSDS-PAGE
جل 4X تحميل عازلةNovexNP0008صبغة تحميل البروتين
سلم 50 نقطة أساسنيو إنجلاند بيولابسN3236سلم مرجعي لاستئصال منطقة الاهتمام من مكتبة (كدنا) المضخمة
50٪ PEGNEBB100045لربط رابط L5
6٪ جل TBEInvitrogenEC6265BOXلفصل وتنقية مكتبة (كدنا
AcetoneACROS Organics423245000غسل البروتينات المترسبة TCA
المضادة للحباتSigma AldrichM8823-1MLلتنقية RBPs التي تحمل علامة FLAG
ATP (100 مللي متر)Thermo Fisher ScientificR0441لربط رابط L5 على نهاية 5 'من الحمض
النووي الريبي الملتقطبيتا ميركابتو إيثانولسيجما ألدريتشM3148-100MLمكون العازلة
Biomax MS شاشة تكثيفSigma AldrichZ363162-1EAلتكثيف إشارة الرسم الإشعاعي
الذاتي ChloroformThermo FisherScientific 1010219لاستخراج الفينول الكلوروفورم بعد تنقية الحمض النووي الريبي
cكوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche11873580001لتثبيط البروتياز الخلوي بعد التحلل
خليط الملحق الكامل -TRPFormediumDCS0149لتحضير الوسط الاصطناعي المحدد
Costar Spin-X 0.22 & micro; مرشحات mSigma AldrichCLS8160لعزل الحمض النووي (cDNAs) المستأصل بعد استخراج الهلام
DNase RQ1PromegaM6101لهضم الحمض النووي بعد تحلل الخلية
dNTPs (10 ملم)سيجما ألدريتش4638956001للنسخ العكسي و PCR
الإيثانولالحراري فيشر10041814العلمي لاستخراج الفينول كلوروفورم بعد تنقية الحمض النووي الريبي والحمض النووي ترسيب
الأمطار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكInvitrogenAM9261للبروتياز K العازلة
Exonuclease INew England BiolabsM0293لتحلل الاشعال بعد
مرشحات الألياف الدقيقة الزجاجيةPCR Whatman1823-010لعزل الحمض النووي (cDNAs) المستأصل بعد استخراج الجلوكوز
FormediumGLU03لتحضير الجليكوجين المتوسط المحتوي على الجلوكوز ، وتحديد الوسط
(20 مجم / مل)10901393001 Rocheالبروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي
GST-TEVبروتوكول البناء والتنقية محلي الصنع
Guanidium hydrochloroideThermo FisherScientific 10071503مطلوب لظروف تغيير الطبيعة المنسدلة ومخزن الغسيل
حبات IgGGE Healthcare17-0969-01لتنقية البروتين الموسومة بعلامة A RBPs
ImidazoleSigma AldrichI2399-100Gلشطف البروتينات الملتقطة من حبات النيكل
كحول الأيزواميلثيرمو فيشر العلميA393-500لاستخراج الفينول الكلوروفورم بعد تنقية الحمض النووي الريبي
Luna Universal One-Step RT-qPCRNEBE3005Sبالنسبة ل qPCR من (كدنا) من أجل حساب العدد المطلوب من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل
كلوريد المغنيسيومفلوكا التحليلي63020-1Lللمرشحات الغشائية العازلة PNK
ميليبورAAWP09000 للخميرة أو HAWP09000 للبكتيرياللترشيح الفراغي للخلايا
أعمدة الدوران الحيوي الصغير Biorad732-6204لجمع التصفية بعد استخراج هلام
حبات Ni-NTAQiagen30210لالتقاط البروتين الثانوي
NP-40Sigma AldrichI8896-100MLمكون العازلة
Pfu polymerasePromegaM7741لتضخيم مكتبة (كدنا
PhenolSigma AldrichP4682-400MLلاستخراج الفينول كلوروفورم بعد تنقية الحمض النووي الريبي
أعمدة الدورانبيرس ثيرمو فيشر العلمي69725للتفاعلات الأنزيمية على العمود
Protease KRoche3115887001لتحلل RBP بعد استخراج الهلام
طبق كوارتز بتريUVO3N / Aللربط المتقاطع للخلايا الملتصقة. متاح من https://www.vari-x-link.com لأفلام التصوير الشعاعي بقيمة 400 جنيه إسترليني
Amersham28906843لتصور التصوير الشعاعي
الذاتي RNAحبات BeckmannA63987SPRI لتنظيف الحمض النووي الريبي و cDNA
RNase HNew England BiolabsM0297لتدهور الحمض النووي الريبي بعد النسخ العكسي
RNase-ItAgilent400720لهضم الحمض النووي الريبي
rRNasinPromegaN2511لتثبيط أي RNases ملوثة أثناء التفاعل الأنزيمي
أسيتات الصوديومSigma AldrichS2889-1KGلاستخراج الفينول كلوروفورم بعد تنقية الحمض النووي الريبي وترسيب الحمض النووي
كلوريد الصوديومThermo Fisher Scientific7647-14-5مكون عازل
ديوكسي كولات الصوديومSigma AldrichD6750-100Gمكون عازلة في تحلل خلايا الثدييات
دوديسيل سلفات الصوديومسيجما ألدريتشL3771-1KGللبروتياز K العازلة
SUPERase-InInvitrogenAM2694لتثبيط RNases الخلوية بعد التحلل
SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010للنسخ العكسي
T4 PNKNew England BiolabsM0201لوضع العلامات الراديوية على نهاية 5 'من RNA
T4 RNA ligase 1New England BiolabsM0204لربط محول L5 على نهاية RNA 5
'T4 RNase ligase 2 ، مقطوعة K222QNEBM0351Sلربط الرابط App_PE على نهاية 3 'من الحمض النووي الريبي الملتقط
TBE المخزن المؤقت TBE (10X)Invitrogen15581-028لتشغيل المواد الهلامية TBE
TEVبروتياز محلي الصنعلتخفيف البروتينات الملتقطة بعد التقاط FLAG
الفوسفاتيز القلوي الحساس للحرارةPromegaM9910لإزالة الفسفرة من الحمض النووي الريبي 5 و 3
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (100٪)سيجما ألدريتشT0699-100MLلترسيب مجمعات RBP-RNA
Tris هيدروكلوريدInvitrogen15504-020مكون عازلة
Triton X-100مكون العازلة Sigma AldrichT8787-100MLفي تحلل خلايا الثدييات
جهاز Vari FilterUVO3N / Aلخلايا الحصاد الفراغية. متوفر من https://www.vari-x-link.com ل 100 GBP
Vari-X-LinkerUVO3N / ACross-linker للخلايا المتقاطعة. متوفر من https://www.vari-x-link.com مقابل 16,000 جنيه إسترليني
نيتروجين الخميرةلمتوسطCYN0410لتحضير حبات
الزركونياالمحددة الشوك11079105Z للخميرة أو 11079101Z للبكتيريالتحلل الخلايا عن طريق ضرب الخرزة
الثدييات تركيز ) الاصطناعي ترسيب يتوفر عند الطلب) ، من قاعدة المتوسطة الاصطناعية

المراجع

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369(2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632(2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49(2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12(2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité? Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8(2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 2/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

الوسوم

Nrd1

مقالات ذات صلة