Method Article

استقرار وهيكل من الخفافيش الهيستوكومباينية الرئيسية مجمع الفئة الأولى مع heterologous β2-Microglobulin

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الطرق التجريبية للحصول على مستقر مجمع الهيستوتكية الرئيسية (MHC) الفئة الأولى من خلال β المحتملة2-ميكروغلوبولين (β2م) استبدالات من أنواع مختلفة. دراسة المقارنة الهيكلية من MHC I استقرت بواسطة homologous و heterologousβ 2م تم التحقيق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب مجمع التحلل الرئيسي (MHC) دورًا محوريًا في عرض ببتيد المستضد والاستجابات المناعية للخلايا التائية ضد الأمراض المعدية وتطور الورم. الهجين MHC I معقدة مع β2-ميكروغلوبولين (β2م) يمكن أن تستقر في المختبر. هذا هو وسيلة مجدية لدراسة MHC I من الثدييات، عندما β homologous2متر غير متوفر. وفي الوقت نفسه، يشار إلى أن الثدييات βاستبدال 2م لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. ومع ذلك، هناك ملخص محدود فيما يتعلق بالمنهجية والتكنولوجيا ل MHC الهجين I معقدة مع β2-microglobulin (β2م). هنا، يتم عرض طرق لتقييم جدوى استبدال β2م في دراسة MHC الأول. وتشمل هذه الأساليب إعداد بنيات التعبير؛ (أ) تنقية هيئات الإدماج وإعادة تجمّع مجمع MHC؛ تحديد حرارة البروتين. الكريستال الفحص وتحديد الهيكل. تقدم هذه الدراسة توصية لفهم وظيفة وهيكل MHC I ، وهي مهمة أيضًا لتقييم استجابة الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوجد مجمع التحلل (MHC) الرئيسي في جميع الفقاريات وهو مجموعة من الجينات التي تحدد المناعة التي تتوسطها الخلايا لمسببات الأمراض المعدية. MHC الفئة الأول يعرض الببتيدات الذاتية، مثل المكونات الفيروسية المنتجة على عدوى الفيروس، لمستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح CD8+ الخلايا T للتوسط مناعة الخلوية والمشاركة في تنظيم المناعة1. توفر دراسة هيكلية من MHC I ملزمة الببتيدات معلومات حول الزخارف ملزمة الببتيد وميزات العرض من قبل جزيئات MHC الأول، الذي يلعب أدوارا حيوية في تقييم الاستجابات المناعية CD8+ T الخلية وتطوير اللقاحات.

منذ التبلور الأول والتصميم الهيكلي للجزيئية MHC I بواسطة Bjorkman et al.2، عزز تحليل البنية البلورية لجزيئات MHC I بشكل كبير فهم كيفية ربط الببتيدات بجزيئات MHC I ، ويساعد على فهم تفاعل السلاسل الخفيفة مع السلاسل الثقيلة والببتيدات. وأشارت سلسلة من الدراسات المتابعة أنه على الرغم من أن الجينات ترميز سلسلة الضوء لا يرتبط مع MHC، سلسلة الضوء هو بروتين رئيسي لتجميع جزيئات MHC الأول3،4. يتفاعل مع المجالات الثلاثة من جزيئات الفئة MHC I على أسطح متعددة. عندما تكون سلسلة الضوء غائبة، لا يمكن التعبير عن جزيئات MHC من الفئة I بشكل صحيح على سطح الخلايا التي تقدم المستضد ولا يمكن أن تتفاعل مع TCR لممارسة وظائفها المناعية.

MHC الأول يتكون من سلسلة ثقيلة (سلسلة H) وسلسلة خفيفة (أي β2-ميكروغلوبولين (β2م))، ويتم تجميعها من خلال ربط لببتيد مناسب5. يتكون الجزء خارج الخلية من سلسلة H من مجالات α1 وα2 وα36. تشكل مجالات α1 وα2 الأخدود ملزم الببتيد (PBG). سلسلة β2متر بمثابة وحدة فرعية هيكلية من مجمع التجميع في MHC I، استقرار التشكل من المجمع، وهو مرافق الجزيئية ل MHC I H سلسلة قابلة للطي7،8،9. وقد أظهرت سلسلة من الدراسات أن سلاسل MHC I H من الثدييات المختلفة مثل الخفافيش (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10، ريسوس المكاك (الرئيسيات) (مامو - ب * 17)11 (مامو - A * 01)12 (مامو - A * 02)13، فأر (القوارض) (H - 2Kد)14،1 15, (Carnivora) (DLA-88*50801)16, ماشية (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 وequine (بيريس 25- يمكن الجمع بين18 و 18 مع β2م(الجدول 1)(Eqca-N*00602) (Eqca-N*00601). وغالبا ما تستخدم هذه الجزيئات الهجينة في الدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تلخيص منهجية الدراسة الوظيفية والهيكلية للمهجن الهجين MHC I مع β2م. وفي الوقت نفسه، لا يزال الأساس الهيكلي للتبادل β2متر بين مختلف أنواع الـ 2 من نوع "تاكسا" غير واضح.

هنا ، ويرد ملخصا للإجراءات للتعبير MHC الأول ، والمجلدات ، والتبلور ، وجمع البيانات الكريستال وتحديد الهيكل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل بدائل محتملة β2متر من الأنواع المختلفة من خلال مقارنة التشكل الهيكلي لل MHC I استقرت من قبل β2م المتجانية المتجانسة. هذه الأساليب سوف تكون مفيدة لمزيد من MHC I الدراسة الهيكلية وC8+ T تقييم الاستجابة المناعية خلية في السرطان والأمراض المعدية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد التعبير يبني

  1. استرداد تسلسل الجينات MHC الفئة الأولى (بما في ذلك الجينات المتوقعة) من الخفافيش من قاعدة بيانات NCBI.
  2. استرجاع أعلى الثدييات MHC الأول تسلسل سلسلة الثقيلة من قاعدة بيانات متعددة الأشكال المناعية (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) وقاعدة بيانات UniProt (www.uniprot.org).
  3. للحصول على مجمعات MHC القابلة للذوبان، قم بتكديس التسلسلات لإزالة المناطق السيتوسولية والعابرة.
  4. استنساخ الجينات ترميز ectodomains من الخفافيش Ptal - N * 01:01 (GenBank لا. KT98792919) (بقايا 1-277) والخفافيش β2م (جينبانك لا. XP_006920478.1) (المخلفات من 1 إلى 98) إلى ناقلات pET-28a (نوفاغن، بيجين، الصين)، على التوالي.
  5. إدراج الأمثل (لEscherichia القولونية)تم إدراج تسلسل بين مواقع NcoI و EcoR1 من ناقلات pET-28a المعدلة.
  6. بناء الإنسان β2متر التعبير plasmids كما سبق وصفها20.

2. تركيب الببتيد

  1. التنبؤ الببتيدات
    1. كما هو موضح سابقا10، لفحص الببتيدات التي قد تربط Ptal-N * 01:01، التنبؤ الببتيدات المرشح باستخدام أجسام البروتين من الفيروسات المتصلة بالخفافيش hendra فيروس (HeV). للحصول على الببتيدات تقارب عالية على أساس نموذج الهيكلية من الخادم على الانترنت، NetMHCpan 4.0 خادم (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 وSys flexPepDock22 تنبأ الربط المحتملة في جزء الببتيد المحدد. وبالإضافة إلى ذلك، البرامج الأخرى وقواعد البيانات بما في ذلك BIMAS، قاعدة بيانات Epitope المناعي (IEDB)، NetCTL 1.2، وSYFPEITHI يمكن أيضا أن تستخدم، وكلها تكامل التنبؤ من فئة الببتيد-MHC أنا ربط التقارب، الناقل المرتبطة معالجة المستضد (TAP) كفاءة النقل، proteasomal C-المحطة الطرفية الانقسام ونصف الوقت من تفكك الببتيد-HLA فئة الجزيئات I في قراءاتهم.
    2. للتنبؤ بالببتيدات عالية الربط، استخدم كل من خادم NetMHCpan و Rosetta FlexPepDock.
      ملاحظة: لسوء الحظ، لم تتطابق أي تنبؤات مُنتجة مع البيانات التجريبية. وقد يشير هذا إلى أن التنبؤات الحالية لبيبتيد MHC الملزم لم تكن مناسبة للثدييات غير البشرية وغير الماوس مثل الخفافيش، والتي قد يكون لها طريقة مختلفة لربط الببتيد. لذلك، نحن بحاجة إلى الجمع بين مختلف برامج التنبؤ والنتائج التجريبية لتحليل شامل للحصول على الببتيدات تقارب عالية.
  2. الببتيدات إعداد وحفظ
    1. بدلا من توليد الببتيدات المخصصة، واستخدام مقدمي الخدمات المتخصصة. شراء جميع الببتيدات تجاريا بعد أدوات التنبؤ الببتيد، والتي لديها درجة أعلى ملزمة. تم تحديد نقاء الببتيد ليكون > 95٪ من قبل HPLC وقياس الطيف الشامل.
    2. تخزين جميع الببتيدات المشتراة كمسحوق مجفف بالتجميد عند −80 درجة مئوية واذاب في ثنائيثيل السلفوكسيد (DMSO) قبل الاستخدام.

3- تنقية هيئات الإدماج

  1. تحويل الإشريكية القولونية
    1. تحويل 10 نانوغرام من plasmid تحتوي على الخفافيش MHC I Ptal-N * 01:01 H سلسلة، أو الإنسان β2متر أو الخفافيش β2متر في 100 ميكرولتر من BL21 (DE3) الإشريكية القولونية. يستحم في الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 90 s، تليها الاستحمام في الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 800 ميكرولتر من مرق lysogeny (LB: استخراج الخميرة، tryptone و NaCl؛ انظر جدول المواد)إلى الخطوة 3.1.2 ويهز في 200 دوران في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على منصة هزاز في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. تطبيق 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري على لوحة تحتوي على مقاومة المضادات الحيوية المقابلة (أمبيسيلين: 100 نانوغرام / مل) ، والتي هي نفس الانشاءات السابقة.
  2. الثقافات تلقيح
    1. اختيار استنساخ واحد البكتيرية التي تحولت مؤخرا إلى 3 مل من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسلين: 100 نانوغرام / مل) والثقافة في 37 درجة مئوية، في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة على منصة هزاز لتنشيط البكتيريا. يمكن تلقيح الثقافات في وقت متأخر من الليل ، لتكون جاهزة للحث في صباح اليوم التالي.
    2. ليلة واحدة مقدما، ونقل 500 ميكرولتر من المخزون البكتيري المنشط إلى 50 مل من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسلين: 100 نانوغرام / مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تهتز عند 200 دورة في الدقيقة. للراحة عند إعداد تلقيح المقبل، تجميد المخزون البكتيري المنشط المتبقي في 1 مل aliquots (500 μL من الثقافة مع 500 μL من 40٪ الجلسرين) في -80 درجة مئوية حتى مطلوب التحضير المقبل.
    3. لتوليد كميات كبيرة من البروتين المؤتلف، نقل إعداد البكتيريا إلى 2 لتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسيلين: 100 نانوغرام / مل) بنسبة 1:100، احتضان في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة. ثقافة حتّى امتصاص من 0.6 في 600 [نم]. أضف 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (تختلف تركيز IPTG ل MHCs مختلفة، ومعظمها بين 0.1 mM-1 mM) إلى قارورة لاستقرار التعبير البروتين.
  3. حصاد البكتيريا
    1. نقل البكتيريا إلى قوارير الطرد المركزي والطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات من الآن فصاعداً عند 4 درجة مئوية.
    2. Resuspend البكتيريا في 60 مل من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) وتحرير البروتين المؤتلف أعرب عن طريق تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية.
      ملاحظة: بشكل عام، فإن البرنامج الذي وضعناه على هذا الجهاز هو الموجات فوق الصوتية 6S، الفاصل 12S، 300 W، 99 مرات).
  4. تنقية هيئات الإدماج
    1. الطرد المركزي تعليق البكتيرية سونيكاتيد في 12،000 س ز لمدة 30 دقيقة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في حجم مناسب من العازلة الغسيل (0.5٪ تريتون-100، 50 mM تريس pH 8.0، 300 M NaCl، 10 mM EDTA، 10 M DTT). كرر هذه العملية مرة أخرى.
    2. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x ز لمدة 10-20 دقيقة. تجاهل تراكب و resuspend الهيئات إدراج في العازلة resuspension (50 mM تريس pH 8.0، 100 mM NaCl، 10 mM EDTA، 10 mM DTT). إزالة عينة 20 ميكرولتر (إدراج الهيئات في العازلة resuspension) لSDS-PAGE لاختبار نقاء الهيئات إدراج.
    3. جهاز طرد مركزي التحضير المتبقي في 12،000 س ز لمدة 10-20 دقيقة. تجاهل المُندفع. وزن بيليه التي تحتوي على الهيئات إدراج وإضافة العازلة حل (6 M غواتيمالا-HCl، 10٪ الجلسرين، 50 mM تريس درجة ح h 8.0، 100 mM NaCl، 10 mM EDTA) إلى تركيز نهائي من 30 ملغم / مل. اثارة ببطء باستخدام مُحرك مغناطيسي عند 4 درجة مئوية حتى يتم حل الأجساد المُدرجة في عازلة الحل.
    4. الطرد المركزي 12000 س ز لمدة 10-20 دقيقة. تخلص من الرواسب. تخزين الهيئات إدراج في -20 درجة مئوية أو −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: قبل الشروع في تنقية أجسام التضمين، تأكد من نجاح تحريض تعبير البروتين المؤتلف. تشغيل عينات من كل ثقافة (التي اتخذت قبل وبعد التعريفي IPTG) على هلام البروتين؛ 15٪ SDS-PAGE (SDS-PAGE اللثة المركزة: H2O، 30٪ أكريلاميد، 1 M تريس-HCL pH 6.8، 10٪ SDS، 10٪ APS وTEMED؛ SDS-PAGE هلام الفصل: H2O, 30٪ أكريلاميد, 1.5 M تريس-HCl pH 8.8, 10٪ SDS, 10٪ APS وTEMED; انظر جدول المواد) β2م، 10٪ SDS-PAGE لسلسلة H.

4. إعادة اِلَتْع مجمع MHC

ملاحظة: إن كفاءة هيئات الإدراج التي أعيد اُعاد اُعادها سوف تؤثر على عائد البروتين الذي تم الحصول عليه. الطي ينافس البلمرة، لذلك فمن المقبول عموما أن إعادة التطوّر بتركيزات البروتين المنخفضة هي الطريقة الأكثر نجاحا. في هذه الورقة، تركيز أجسام التضمين هو 30 ملغ/مل.

  1. تحضير المخزن المؤقت لإعادة التكتكت.
    1. تختلف تكوين المخزن المؤقت إعادة التراكب اعتمادا على البروتين. على سبيل المثال، فإن درجة الـ (PH)، والقوة الأيونية،ظروف الأكسدة الحمراء ووجود اليغاندات تؤثر على نتائج إعادة الأحرف. الأكثر شيوعا هو استخدام تريس أو هيبس المستندة إلى مخازن حاجز في درجة هيدروكلوري مع تركيز NaCl من 50-500 mM، ولكن هذا يعتمد أيضا على البروتين المستهدف. فيما يلي صيغة المخزن المؤقت refolding المستخدمة في هذه المقالة.
    2. إعداد العازلة للطي مع 100 mM تريس HCl pH 8.0, 400 M L-أرجينين, 2 mM EDTA-2Na.
    3. تبريد العازلة إلى 4 درجة مئوية في قارورة 250-300 مل، ثم إضافة 5 mM خفض الجلوتاثيون (GSH) و 0.5 mM الجلوتاثيون المؤكد (GSSG). اثارة ببطء باستخدام مُحرك مغناطيسي عند 4 درجات مئوية لمدة 10-20 دقيقة أخرى قبل إضافة الأجسام المضمّنة والببتيدات.
  2. حقن وتمييع سلسلة MHC H وβ 2م
    ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة التي يتم فيها إعادة التكفّل، على الرغم من أنّه من أجل تقليل التجميع إلى أدنى حدّ، تكون 4 درجة مئوية أفضل. نحن نستخدم التخفيف لإعادة مضاعفة البروتينات.
    1. باستخدام إبرة من حقنة 1 مل، حقن 1 مل من hβ2م إدراج الهيئات أو bβ2م إدراج الهيئات في اثنين من مخازن refolding (1 لتر لكل منهما)، على التوالي. حقن بالقرب من قضيب التحريك الدورية بقوة للحصول على تخفيف سريع وفعال. β2م refolds سهلة نسبيا وتبقى مستقرة حتى في غياب سلسلة H.
    2. بعد β2م قد تم حلها في حل إعادة التكديس، حل الببتيدات (5 ملغ / مل) في DMSO وحقن بسرعة 200 ميكرولتر في حل إعادة التكديس. يُحرّك المزيج ببطء لمدة 10-20 دقيقة قبل إضافة سلسلة H.
    3. حقن سلسلة H مع نفس الإجراء الموصوف أعلاه ل2m β. سلسلة H غير مستقرة جداً; ولذلك، فإن ترتيب الحقن مهم جدا. حقن 3 مل من H سلسلة الهيئات إدراج في اثنين من المخازن المؤقتة إعادة تفول مختلفة (1 لتر لكل منهما) مع hβ2م أو bβ2م، على التوالي. الحقن المتتالية من aliquots الصغيرة بدلا من تطبيق واحد من كامل كمية البروتين يزيد من العائد من MHC مُعاد مُكَدَّد. السماح لإعادة التكفّل بالمضي قدماً عند 4 درجات مئوية لـ 8-10 ساعات.
  3. تركيز البروتين المُعاد تجمُّه
    1. استخدم الترشيح الفائق في غرفة مضغوطة مع غشاء MMCO 10 كيلو Da لتركيز البروتينات التي تُطَوّر. هذا الأسلوب هو مريحة ويمكن الجمع بين تبادل المخزن المؤقت. إضافة مخزن الصرف (20 mM تريس-HCl، 50 mM NaCl 8.0 pH) إلى الغرفة والتركيز على حجم النهائي من 30-50 مل.
    2. نقل حل إعادة التكديس إلى أنبوب الطرد المركزي، تدور في 12،000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الترسبات.
    3. نقل بعناية فائقة والتركيز إلى مزيد من حجم النهائي من ~ 1 مل.
    4. جهاز طرد مركزي عند 12,000 xز لمدة 10-20 دقيقة. نقل المابير إلى أنبوب معقمة وتنقية البروتينات باستخدام 10/300 GL حجم استبعاد العمود.
    5. جمع العينات في الذروة وتحليلها باستخدام SDS -PAGE (15٪ هلام بولياكريلاميد).
    6. جمع قمة مجمع MHC والتركيز على تركيز نهائي من 15 ملغ / مل.
    7. تخفيف المجمع إلى 7.5 ملغم / مل و 15 ملغ / مل للتبلور.

5. التبلور، وجمع البيانات، والمعالجة

  1. أداء تبلور MHC المعقدة والببتيد باستخدام تقنية نشر بخار قطرة الجلوس.
  2. شاشة مجمعات Ptal-N*01:01/ببتيد مع مجموعات الكريستال التجارية (على سبيل المثال، مجموعة الشاشة الكريستال I/II، مجموعة شاشة مؤشر، مجموعة PEGION I/II، ومجموعة PEGRx).
  3. ختم الحل الناتج وتككيل ضد 100 ميكرولتر من محلول الخزان عند 4 أو 18 درجة مئوية.
  4. مراقبة النمو البلورية في الثقافة لمدة 3 أيام، 1 أسبوع، 2 أسابيع، 1 شهر، 3 أشهر و 6 أشهر. استخدام المجهر لمعرفة ما إذا كان كل قطرة في لوحة الكريستال لديه بلورات.
    ملاحظة: ملاحظة: لوحظت بلورات Ptal-N*01:01/HeV1 (bβ2m) في 0.2 M NaCl، و0.1 M Bis-Tris (pH 5.5)، و25٪ (ث/الخامس) بولي إيثيلين جلايكول 3350 بتركيز 7.5 ملغ/مل. Ptal-N*01:01/HeV1 (hβ2م) لوحظت بلورات في 0.1 M HEPES، درجة حَسَر 7.0، 2٪ ث/ v بولي إيثيلين جلايكول 3350 بتركيز 7.5 ملغ/مل.
  5. لحماية المبردات، نقل البلورات إلى محلول تخزين يحتوي على 20٪ الجلسرين ثم يبرد بسرعة في تيار النيتروجين الغازي 100 ك.
  6. جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية من خط شعاع BL19U لمرفق إشعاع سينكروترون شنغهاي (شنغهاي، الصين).

6 - تحديد الهيكل وتحليله

  1. مع البيانات الهيكلية عالية الدقة، معالجة وحجم قوة جمع باستخدام برنامج دنزو وحزمة البرامج HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. بعد اختيار نموذج أولي أفضل في بنك بيانات البروتين (PDB) ، حدد الهياكل باستخدام الاستبدال الجزيئي مع برنامج Phaser MR في CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). النموذج المستخدم هو الإحداثيات الهيكلية مع رمز بنك بيانات البروتين (PDB) 5F1I.
  3. استخدم نموذج الأشعة السينية المكررة لصقل المفصل الأولي. استخدم فينيكس الصقل وحده ووضع المفاصل للأشعة السينية وحدها والصقل المشترك النيوترونية والأشعة السينية، على التوالي.
  4. بعد كل جولة من الصقل، تحقق يدويًا من النموذج ضد Fo - Fc و 2Fo − خرائط الكثافة النووية الإيجابية في Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). وهذا يسهل الموضع السليم للمياه وبعض الذرات D. تم إنشاء جميع الأرقام من الهياكل من قبل PyMOL (http://www.pymol.org/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وذكرت الأعمال السابقة أن HeV-المستمدة من HeV1 (DFANTFLP) الببتيد قدمتها Ptal-N * 01:0110,19. هنا، القدرة ملزمة من هذا الببتيد إلى Ptal-N *01:01 مع الخفافيش المتجانسة β2متر (bβ2م) وغير β

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بناء مجمع البروتين الهجين من خلال استبدال heterologous من مختلف التاشيا هي استراتيجية مشتركة للتحقيقات الوظيفية والهيكلية عندما لا تتوفر مجمع متماثل، كما هو الحال في MHC الأول ويغاندس. غير أن الملخصات المتعلقة بالمنهجية والتكنولوجيا محدودة. هنا، تم تحليل هيكل الخفافيش MHC الأول، Ptal-N * 01:01، استقرت من قبل bβ2م أو hβ2متر. تم العثور على الأحماض الأمينية الرئيسية β2متر ملزمة لبتال N * 01:01 أن تكون محفوظة بين الخفافيش والإنسان. وعند إجراء مزيد من التحليل، تبين أن البقايا الرئيسية التي ينط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذه الدراسة من قبل الصندوق المفتوح من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نان جينغ، الصين (منحة لا. KF-GN-201905)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 81971501). وليام J. ليو هو مدعوم من قبل برنامج العلماء الشباب ممتازة من NSFC (81822040) وبكين خطة نجمة جديدة للعلوم والتكنولوجيا (Z181100006218080).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 كيلو دالتون MMCO غشاءميرك ملي بورPLGC07610
30٪ أكريلاميدLABLEADA3291-500ml * 5
5 & مرات ؛ بروتين SDS تحميلنوفوبروتينPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa قطعMerck milliporeUFC901096
AmpicillinInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21 (DE3) سلالةTIANGENCB105-02
DMSOMP219605580ارتد قفازات مناسبة وحماية للعين / الوجه. في حالة ملامسة العينين ، اشطفها على الفور بكمية كبيرة من الماء واطلب المشورة الطبية.
DTTSolarbioD1070وتشغيلها في مطبخ جيد التهوية. في حالة ملامسة العينين ، اشطفها على الفور بكمية كبيرة من الماء واطلب المشورة الطبية.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
الجلسرينHUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Guanidine hydrochlorideAmrescoE424-5KG
h & beta ؛ 2mمختبرناZhang، S. et al. الأساس الهيكلي لعرض الأليل المتقاطع بواسطة HLA-A * 0301 و HLA-A * 1101 الذي تم الكشف عنه بواسطة اثنين من مجمعات الببتيد المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية. مول إيمونول. 49 (1-2) ، 395-401 ، (2011).
IPTGInalco1758-1400
L-Arginine HydrochlorideAmresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
Protein MarkerFermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex زيادة 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
ارتداء القفازات والنظارات الواقية TEMED Thermo 17919 وتشغيلها في مطبخ جيد التهوية.
تريس هيدروكلوريكأمريسكو0497-5 كجم
تريتون X-100بيورولرRH30056-100 مل
تريبتونأكسويدLP0042
مستخلص الخميرةأوكسويدLP0021
يجب ارتداء قفازات ونظارات يجب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934(2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250(2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC Class IBeta 2 MicroglobulinProtein RefoldingInclusion Body PurificationCrystallization TechniqueX ray DiffractionPeptide BindingThermostability AssessmentExpression ConstructsSize Exclusion Chromatography

Related Articles