اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

ملخص

تقدم هذه المقالة طريقة لتوليد بلورات البروتين مشتقة مع I3C (5-أمينو-2،4،6-ثلاثي يودويسوفسثاليك) باستخدام microseeding لتوليد ظروف تبلور جديدة في شاشات مصفوفة متفرقة. يمكن إعداد الصواني باستخدام الروبوتات الاستغناء السائل أو باليد.

الملخص

ويتطلب توضيح بنية البروتين باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية بلورات diffracting عالية الجودة وحل حسابي لمشكلة مرحلة الحيود. وغالبا ما تستمد الهياكل الجديدة التي تفتقر إلى نموذج علم الهموم المناسب مع ذرات ثقيلة لتوفير معلومات المرحلة التجريبية. البروتوكول المقدمة يولد بكفاءة بلورات البروتين المشتقة من خلال الجمع بين فحص مصفوفة microseeding عشوائية مع اشتقاق مع جزيء ذرة ثقيلة I3C (5-amino-2،4،6-triiodoisophthalic acid). من خلال دمج I3C في شعرية الكريستال، يمكن حل مشكلة مرحلة الانعراج بكفاءة باستخدام تشتت أحادي الطول الموجي الشاذ (SAD) على مراحل. ترتيب المثلث متساوي الأضلاع من ذرات اليود في I3C يسمح للتحقق السريع من بنية فرعية شاذة الصحيح. وسيكون هذا البروتوكول مفيدا لعلماء الأحياء الهيكلية الذين يحلون الهياكل الجزيئية الكلية باستخدام تقنيات تستند إلى البلورات مع الاهتمام بالتداوي التجريبية.

المقدمة

في مجال البيولوجيا الهيكلية، ويعتبر التصوير البلوري بالأشعة السينية على أنها تقنية معيار الذهب لتحديد هياكل التحليل الذري للجزيئات الكبيرة. وقد استخدمت على نطاق واسع لفهم الأساس الجزيئي للأمراض، وتوجيه مشاريع تصميم المخدرات الرشيد وتوضيح الآلية الحفازة للإنزيمات^1،2. على الرغم من أن البيانات الهيكلية توفر ثروة من المعرفة، فإن عملية التعبير عن البروتين وتنقيته، والتبلور وتحديد الهيكل يمكن أن تكون شاقة للغاية. وتواجه هذه المشاريع عادة عدة اختناقات تعوق تقدم هذه المشاريع، ويجب معالجة هذه العقبات لتبسيط عملية تحديد الهيكل البلوري بكفاءة.

بعد التعبير المتلفز والتنقية، يجب تحديد الظروف الأولية التي تؤدي إلى التبلور والتي غالباً ما تكون جانباً شاقاً ويستغرق وقتاً طويلاً في التصوير البلوري بالأشعة السينية. شاشات مصفوفة متفرقة تجارية تقوم بتوحيد الشروط المعروفة والمنشرة وقد تم تطويرها لتخفيف هذا عنق الزجاجة^3,4. ومع ذلك، فمن الشائع لتوليد عدد قليل من الزيارات من هذه الشاشات الأولية على الرغم من استخدام عينات البروتين نقية للغاية ومركزة. يشير ملاحظة قطرات واضحة إلى أن البروتين قد لا يكون الوصول إلى مستويات التشبع الفائق المطلوبة لnuclecleate الكريستال. لتشجيع نوات الكريستال والنمو، يمكن إضافة البذور المنتجة من بلورات موجودة من قبل إلى الظروف وهذا يسمح لزيادة أخذ العينات من مساحة التبلور. قدم إيرتون وStoddard لأول مرة طريقة فحص مصفوفة microseed⁵. سحقت بلورات رديئة الجودة لجعل مخزون البذور ومن ثم تضاف بشكل منهجي إلى ظروف بلورة تحتوي على أملاح مختلفة لتوليد بلورات جديدة ذات جودة الحيود التي لم تكن قد شكلت خلاف ذلك. وقد تم تحسين هذه التقنية من قبل D'Arcy وآخرون الذين طوروا فحص مصفوفة البذور الدقيقة العشوائية (rMMS) التي تم إدخال البذور في شاشة تبلور المصفوفة الاحتياطية^6،7. هذا يحسن النوعية من بلورة ويزيد الرقم من بلورة يضرب على معدل بعامل من 7.

بعد أن يتم إنتاج البلورات بنجاح ويتم الحصول على نمط الحيود بالأشعة السينية ، هناك اختناق آخر في شكل حل "مشكلة المرحلة". أثناء عملية الحصول على البيانات، يتم تسجيل شدة الحيود (متناسب مع مربع السعة) ولكن يتم فقدان معلومات المرحلة، مما يؤدي إلى مشكلة المرحلة التي توقف تحديد الهيكل الفوري⁸. إذا كان البروتين الهدف أسهم هوية عالية تسلسل لبروتين مع بنية محددة سابقا، يمكن استخدام استبدال الجزيئية لتقدير معلومات المرحلة^{9،10،11،12}. على الرغم من أن هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة، قد لا تكون هياكل النموذج متوفرة أو مناسبة. نجاح طريقة الاستبدال الجزيئي المستندة إلى نموذج homology ينخفض بشكل ملحوظ كما تسلسل الهوية تنخفض إلى أقل من 35٪¹³. في حالة عدم وجود نموذج homology مناسبة، ab initio الأساليب، مثل ARCIMBOLDO^14،15 و¹⁶AMPLE، يمكن اختبارها. وتستخدم هذه الطرق نماذج أو أجزاء متنبأ بها حسابياً كنقاط انطلاق للاستبدال الجزيئي. وينتظّر "AMPLE" الذي يستخدم نماذج خادعة متوقّفاً كنقاط انطلاق، من أجل حلّ هياكل من البروتينات الكبيرة (>100 بقايا) والبروتينات التي تحتوي في الغالب على β. ARCIMBOLDO، الذي يحاول احتواء أجزاء صغيرة لتمتد إلى هيكل أكبر، يقتصر على البيانات عالية الدقة (≤2 Å) وقدرة الخوارزميات على توسيع الأجزاء إلى هيكل كامل.

إذا فشلت طرق الاستبدال الجزيئية، يجب استخدام طرق مباشرة مثل الاستبدال الأيزومورفي^17و18 والتشتت الشاذ عند طول موجة واحد (SAD¹⁹⁾أو أطوال موجية متعددة (MAD^20). هذا هو الحال في كثير من الأحيان لهياكل جديدة حقا، حيث يجب أن تكون البلورة أو اشتقاق مع ذرة ثقيلة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق نقع أو البلورة المشتركة مع مركب ذرة ثقيلة، تعديل الكيميائية (مثل 5-bromouracil دمج في الجيش الملكي النيبالي) أو تعبير البروتين المسمى (مثل دمج الأحماض الأمينية سيلينوميثيونين أو selenocysteine في الهيكل الأساسي)^21،22. وهذا يزيد من تعقيد عملية التبلور ويتطلب المزيد من الفرز والتحسين.

وهناك فئة جديدة من مركبات المراحل، بما في ذلك I3C (5-أمينو-2،4،6-triiodoisophthalic حامض) وB3C (5-أمينو-2،4،6-tribromoisophthalic حامض)، تقدم مزايا مثيرة على المركبات المراحلية الموجودة مسبقا^23،24،25. يتميز كل من I3C و B3C سقالة حلقة عطرية مع ترتيب بالتناوب من التشتت الشاذ المطلوب لطرق المراحل المباشرة والمجموعات الوظيفية الأمينية أو الكربوكسيلات التي تتفاعل على وجه التحديد مع البروتين وتوفير خصوصية موقع ملزم. ويسمح الترتيب الثلاثي متساوي الأضلاع اللاحق لمجموعات المعادن الثقيلة بتبسيط التحقق من البنية الفرعية لتدرجها. في وقت كتابة هذا التقرير، هناك 26 I3C الهياكل ملزمة في بنك بيانات البروتين (PDB)، منها 20 تم حلها باستخدام SAD phasing²⁶.

هذا البروتوكول يحسن فعالية خط أنابيب تحديد الهيكل من خلال الجمع بين أساليب اشتقاق المعادن الثقيلة وفحص rMMS لزيادة عدد ضربات التبلور في وقت واحد وتبسيط عملية اشتقاق الكريستال. لقد أثبتنا أن هذه الطريقة كانت فعالة للغاية مع بيض البيض lysozyme و المجال من رواية بروتين lysin من bacteriophage P68²⁷. يتم وصف حل الهيكل باستخدام خط أنابيب تحديد هيكل Auto-Rickshaw الآلي للغاية ، والمصمم خصيصًا لمجمع I3C التدريجي. هناك خطوط أنابيب الآلي الأخرى التي يمكن استخدامها مثل AutoSol²⁸، اللجان²⁹ و CRANK2^30. يمكن أيضاً استخدام الحزم غير الكاملة الآلية مثل SHELXC/D/E^31،32،33. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون البروتينات التي تفتقر إلى نماذج متجانسة في PDB ، من خلال تقليل عدد خطوات الفحص والتحسين بشكل كبير. شرط مسبق لهذه الطريقة هو بلورات البروتين أو الترسبات البلورية من البروتين المستهدف، التي تم الحصول عليها من تجارب التبلور السابقة.

البروتوكول

1- التخطيط والاعتبارات التجريبية

1. استخدام بلورات موجودة مسبقا من البروتين من الفائدة، ويفضل أن تولد من خلال تبلور نشر البخار. للحصول على بروتوكول تعميم تبلور انتشار البخار، انظر Benvenuti و Mangani³⁴. وسوف تتطلب أساليب أخرى من التبلور مثل microbatch تحت النفط ونشر واجهة الحرة حصاد البلورات قبل سحق لتوليد microseeds.
2. في إعداد مخزون البذور، واستخدام بلورات أعلى مستوى من الجودة التي يمكن التضحية بها. ويمكن الحكم على أعلى مستوى من الجودة الكريستال بصريا على أساس مورفولوجيا أو أفضل الكريستال diffracting يمكن اختيارها، إذا كانت هذه البيانات متاحة. فمن المرجح جدا أن يتم الحصول على بلورات ذات جودة أفضل بعد التحسين من خلال البذر. في حالة عدم توفر بلورات ، يمكن استخدام الترسبات البلورية مثل الزفيرة والإبر.
3. تحديد بلورات الملح. بلورات الملح يمكن أن تنمو في شاشات التبلور ويمكن أن تبدو مثل بلورات البروتين. استخدام بلورات الملح في rMMS لن توفر أي فائدة وسوف تضيع عينة ثمينة، لذلك من المهم القضاء على إيجابيات كاذبة الملح.
   1. بلورات الملح عالية عندما يتم سحقها. يجب سحق البلورات لتوليد مخزون البذور، لذلك هذه الاستراتيجية ذات الصلة بشكل خاص. إذا سمع صوت الكراك مسموعة عند سحق بلورات، الكريستال من المرجح أن يكون الملح.
   2. إذا كان البروتين يحتوي على التربتوفان ومخلفات التيروسين, استخدام المجهر الفلورية فوق البنفسجية لتحديد بلورات البروتين التي الفلورس في ظل هذه الظروف الإضاءة.
   3. استخدام صبغة Izit (الميثيلين الأزرق) لوثة بلورات البروتين لتمييزها إلى بلورات الملح التي لا تزال غير ملوثة نسبيا. ومع ذلك، هذا الإجراء هو أكثر تدميراً ويوصى فقط إذا كان أحد بلورات لتجنيب من replicates من نفس قطرة.
      ملاحظة: على الرغم من أن الاختبارات المذكورة أعلاه قد تعطي نتائج واعدة، بلورات الملح قد لا يزال مخطئا لبلورات البروتين. في هذه الحالة، يمكن استخدام تجارب الحيود للتمييز بشكل قاطع بين البروتين والبلورة الملحية.

2- إعداد مخزون الليثيوم I3C

1. قياس من أصل 120 ملغ من I3C (5-أمينو-2,4,6-triiodoisophthalic حمض) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
2. قم بحل I3C في 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الليثيوم 2 M. يمكن تسخين المحلّل برفق باستخدام كتلة حرارية عند 40-60 درجة مئوية لتشجيع الحل. يجب أن يكون محلول الليثيوم I3C الناتج بنيًا وله تركيز 1 M.
   تنبيه: هيدروكسيد الليثيوم متآكل. يجب ارتداء نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر.
3. قياس رقم الH للحل. وإذا لزم الأمر، أضف كميات صغيرة من حمض هيدروكلوريك 1 M أو هيدروكسيد الليثيوم 2 M لضبط الأس هيدروكلوريك إلى ما بين 7 و8. إضافة ماء ميليك لجعل حجم الحل النهائي إلى 400 ميكرولتر. تركيز حل الأسهم I3C هو 0.5 M.
   ملاحظة: الخطوة 2.3 اختيارية. وينبغي أن يكون عدد الـ pH من الحل بين 7-8 من الـ pH قبل أي تعديل للرُحَم. وينبغي أن يتم تنفيذ هذه الخطوة إذا تأثر البروتين من الفائدة بقوة من قبل السيدا. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. يمكن أن تبقى ليثيوم I3C في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين على الأقل³⁵.

3. إضافة I3C إلى مخزون البروتين

1. الطريقة الأولى
   1. إضافة المخزون ليثيوم I3C إلى 150 ميكروغرام من البروتين المستهدف. يجب أن يكون التركيز النهائي بين 5-40 mM الليثيوم I3C.
2. الطريقة الثانية (أسلوب ألطف)
   1. إعداد عازلة تخفيف البروتين الذي يطابق العازلة من البروتين الهدف. إلى هذا العازلة التخفيف، إضافة المخزون الليثيوم I3C لإعطاء تركيز من الليثيوم I3C بين 10-80 mM.
   2. تخفيف البروتين 1:1 مع العازلة تخفيف البروتين لإعطاء تركيز النهائي من الليثيوم I3C بين 5-40 mM.
      ملاحظة: بعض البروتينات سوف تترسب عند ملامستها لتركيزات عالية من الليثيوم I3C في الطريقة 1، في حين أن البروتينات الأخرى يمكن أن تتسامح معها. والطريقة 2 تقلل من احتمالية هطول الأمطار. ومع ذلك، هذه الطريقة إلى النصف تركيز البروتين. بالنسبة للبروتينات التي ليس لديها بروتوكول تبلور راسخ، يوصى بشكل عام بتركيز البروتين 10 ملغ/مل لفحص التبلور الأولي. ويوصى نسبة أولية من المولى I3C إلى البروتين من 8. يمكن تحسين تركيز البروتين ونسبة المول من I3C إلى البروتين بعد الشاشة الأولية.

4. صنع مخزون البذور

1. جعل مسبار مدورة لسحق البلورات.
   1. مع موقد بونسن على اللهب الأزرق، سخني ماصة باستور نحو وسطها. باستخدام ملاقط، سحب نهاية ماصة باستور لسحبها إلى قطر رقيقة أقل من 0.3 ملم.
   2. مرة واحدة في القسم الأوسط رقيقة بما فيه الكفاية، عقد هذا الجزء في اللهب لفصل ماصة في هذه المرحلة وجولة نهاية الماصات لإنهاء مسبار الزجاج.
      ملاحظة: يتم بيع الكسارات الكريستال التحقيق مدورة من قبل البائعين طرف ثالث. هذه هي بديل لصنع تحقيقات مدورة.
2. ضع خمسة أنابيب 1.5 مل ميكروسنتريفوغ على الجليد.
3. تحت مجهر الضوء، فحص علبة التبلور لحالة مناسبة لتوليد microcrystals. من الناحية المثالية ، يتم اختيار بلورات مورفولوجيا كبيرة جيدة. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تعمل أيضًا مع بلورات المورفولوجيا الفقيرة والإبر واللوحات والبلورات الدقيقة والبلورات.
4. فتح علبة التبلور جيدا. ل96 تبلور جيدا الصواني مختومة مع البلاستيك، واستخدام مشرط لقطع البلاستيك ختم البئر. لتعليق الصواني قطرة مختومة مع الشحوم، يمكن إزالة غطاء باستخدام ملاقط ومقلوب على سطح حتى.
5. نقل 70 ميكرولتر من محلول الخزان إلى أنبوب microcentrifuge وتهدئته على الجليد. إلى أنابيب microcentrifuge الأخرى، إضافة 90 ميكرولتر من محلول الخزان والعودة إلى الجليد للبرد.
   ملاحظة: إذا لم يكن لدى الخزان حجم كاف أو غير موجود (في حالة التقطير الصغير تحت النفط)، قم بإنشاء خزان تبلور عن طريق خلط الكواشف المناسبة.
6. تهيج الكريستال في قطرة باستخدام مسبار الكريستال لسحق بدقة عنه. يجب أن تسحق البلورة تماما والتي يمكن رصدها تحت المجهر.
7. إزالة كل السائل من قطرة ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge مع الحل الخزان. تخلط ثم تأخذ بعد ذلك 2 ميكرولتر من خليط من أنبوب microcentrifuge و إضافته مرة أخرى إلى البئر. شطف البئر مع الحل ونقله إلى أنبوب microcentrifuge. كرر هذه الخطوة شطف مرة أخرى. من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على أنبوب microcentrifuge الباردة لتجنب ذوبان الذرات الدقيقة في الخليط.
8. دوامة الأنبوب في السرعة القصوى في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ووقف بانتظام لتهدئة أنبوب على الجليد لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
   ملاحظة: بعض بروتوكولات microseeding إضافة حبة بذور البوليتيترافلورو الإيثيلين إلى أنبوب microcentrifuge للمساعدة في سحق الكريستال^7،36. لقد استخدمنا هذه التقنية دون استخدام حبة البذور مع النجاح ، ولكن لا نرى أي مشاكل مع استخدام حبة البذور لسحق البلورات.
9. جعل 1 في 10 تخفيف المسلسل من مخزون البذور عن طريق نقل تسلسلي 10 ميكرولتر بين حلول الخزان المبردة.
10. تخزين مخزون البذور التي لن تستخدم على الفور في -80 درجة مئوية.

5. إعداد شاشة rMMS

1. إعداد لوحة فحص 96 جيدا باستخدام الروبوت الاستغناء السائل. في حالة عدم وجود الروبوت، يمكن أيضا أن تستخدم ماصة متعددة القنوات.
   1. نقل 75 ميكرولتر من كتلة بئر عميقة إلى علبة 96 تبلور جيدا. إضافة 1 μL إلى قطرة التبلور و 74 ميكرولتر إلى الخزان.
   2. نقل 1 ميكرولتر من البروتين المكمل مع الليثيوم I3C، المحرز في الخطوة 2، إلى انخفاض التبلور.
   3. نقل 0.1 μL من مخزون البذور إلى انخفاض التبلور.
   4. ختم لوحة مع شريط ختم واضح واحتضان لوحة في درجة حرارة ثابتة للسماح للنمو الكريستال.
2. إعداد شاشات إسقاط معلقة
   1. الشحوم حواف الآبار قطرة معلقة (شنقا قطرة تبلور الصواني يمكن العثور عليها في 24 و 48 شكل جيدا).
   2. نقل 500 μL تبلور الحل في الخزان.
   3. بالقرب من مركز شريحة غلاف زجاجي، ضع قطرة 1 ميكرولتر من البروتين المكملة بالليثيوم I3C، الذي تم في الخطوة 2.
   4. إضافة 1 μL من حل التبلور إلى قطرة.
   5. نقل 0.1 μL من مخزون البذور إلى انخفاض التبلور.
   6. عكس الشريحة الغطاء وختم التبلور جيدا عن طريق دفع الشريحة الغطاء في الشحوم.
   7. احتضان لوحة في درجة حرارة ثابتة للسماح بنمو البلورة.
      ملاحظة: مع مخزونات البذور الجديدة وغير المختبرة، من المستحسن استخدام مخزون البذور الأكثر تركيزاً لتعظيم فرص الحصول على ضربات التبلور. ويمكن إعداد الشروط اللاحقة مع انخفاض تركيز البذور لتحسين عدد البلورات.
3. فحص الكريستال تحت المجهر بانتظام لنمو البلورات. وإذا كانت البلورات ذات جودة كافية، فيمكن حصادها لجمع البيانات. ويمكن أيضا أن تستخدم بلورات لتوليد مخزونات البذور الجديدة وشاشات RMMS جديدة للسماح للتحسين التكراري.

6 - جمع البيانات

1. بلورات الحصاد باستخدام cryoloops، cryoprotect البلورات وفلاش تبريد لهم في النيتروجين السائل. للحصول على معلومات إضافية عن بلورات التبريد فلاش، راجع تنغ³⁷ وغارمان وميتشل³⁸.
   1. خلال مرحلة cryoprotection ، إذا تم تمرير الكريستال من خلال محلول مائي جديد ، يمكن أن تضيع I3C من الكريستال بسبب القذف في محلول cryoprotection. استخدم الليثيوم I3C في محلول التبريد بتركيز يطابق شرط التبلور للتخفيف من هذا.
   2. وقد تم بنجاح بلورات نمت باستخدام هذا البروتوكول cryoprotected باستخدام Parabar 10312 النفط القائم على cryoprotectant (هامبتون للبحوث).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا مؤقتًا أثناء تخزين البلورات في النيتروجين السائل.
      تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل حروقًا باردة. النيتروجين السائل يمكن أيضا أن يسبب الاختناق إذا استخدمت في الأماكن المغلقة.
2. قم بتركيب البلورة على مقياس مصدر الأشعة السينية وجمع بيانات الحيود باستخدام البروتوكول المحدد لمصدر الأشعة السينية.
3. وتعتمد هذه التقنية على إشارة شاذة من ذرات اليود في I3C. وهكذا، حدد الطاقة من الأشعة السينية لتحقيق أقصى قدر من هذه الإشارة.
   1. تعيين سينكروترون مصادر الأشعة السينية مع الطاقات tunable منخفضة قدر الإمكان. بالنسبة للعديد من خطوط البلورات الجزيئية الكلية، فإن أقل طاقة قابلة للتكوين هي 8000 إلى 8500 eV.
   2. لا يمكن ضبط مصادر الأشعة السينية الدورية. مصادر الأنود شائعة الاستخدام مع النحاس لها حافة Kα في 8046 eV، والذي يوفر إشارة شاذة جيدة لليود (و" = 6.9 e). تحتوي مصادر الأنود مع الكروم على حافة Kα عند 5415 eV، مما يوفر إشارة شاذة كبيرة لليود (f" = 12.6 e).
4. يعتبر الضرر الإشعاعي مشكلة كبيرة أثناء جمع البيانات لأنه سيحط من الإشارة الشاذة³⁹. حدد وقت التعرض وتهين الشعاع لتحقيق أفضل حيود مع تقليل جرعة الإشعاع.
   ملاحظة: في مركب مراحل مماثل مع ذرات اليود استبدال ذرات البروم، وقد تبين أن الأضرار الإشعاعية تسبب التحلل الإشعاعي للرابطة برومين الكربون وانخفاض في شغل ذرات البروم^24.
   1. استخدام معكوس حزمة تجميع البيانات SAD كاستراتيجية جمع. يتم جمع البيانات في أسافين، مع أسافين متقابلة يتم جمعها بعد بعضها البعض. وهذا يسمح بجمع أزواج فريدل بجرعة مكافئة، مما يؤدي إلى تحسين قياس الإشارة الشاذة الأقل تأثراً بتلف الإشعاع. على سبيل المثال، إستراتيجية إسفين ثمانية لجمع 360 درجة سوف تنطوي على جمع البيانات في ترتيب إسفين 1 (0 درجة -45 درجة)، إسفين 2 (180 درجة -225 درجة)، إسفين 3 (46°-90 درجة)، إسفين 4 (225 درجة). -270 درجة)، إسفين 5 (90 درجة -135 درجة)، إسفين 6 (270 درجة -315 درجة)، إسفين 7 (135 درجة -180 درجة) وإسفين 8 (315°-360 درجة).
      ملاحظة: التناوب المستمر هو استراتيجية جمع بديلة عن تلك التي جمع البيانات شعاع عكسي. لمقارنة حديثة من إستراتيجيات المجموعة، انظر غارسي بونتي و كاتونا⁴⁰.

7. معالجة البيانات وحل الهيكل

1. إجراء تخفيض البيانات على بيانات الحيود باستخدام XDS⁴¹، بهدف تعظيم الإشارة الشاذة. معلمات إدخال تقليل البيانات خاصة لمجموعة البيانات وقد تتطلب بعض التجربة والخطأ. فيما يلي بعض التوصيات التي يجب البدء بها.
   1. تعيين قانون فريدل = FALSE. تنفيذ CORRECT مرتين، تعيين STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE و STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE. يمكن أن يكون لدى أحد الركض إشارة شاذة أعلى من الأخرى. قارن الإشارات الشاذة بين أشواط باستخدام 'كور الشذوذ' و 'SigAno' التخصصات في الإخراج. وهذا يوفر مؤشرا لنوعية البيانات.
   2. تشغيل SHELXC على XDS_ASCII. HKL للحصول على إشارة أكثر دقة إشارة شاذة. سوف يعطي الانضباط "Ranom" إشارة شاذة في قرارات مختلفة.
2. تشغيل لا طائل⁴² و AIMLESS⁴³ لتوسيع نطاق البيانات. في AIMLESS، تعيين المعلمة الشاذة على. إذا تم استخدام واجهة المستخدم الرسومية، حدد الخيار فصل الأزواج الشاذة للرفض غير الواضح ودمج الإحصائيات. قد يكون مطلوبا اختبار قطع القرار مختلفة لتعظيم إشارة شاذة.
3. حل هيكل البروتين باستخدام السيارات ريكشو آلية الكريستال هيكل خط أنابيب تحديد^{تصميم 44.} سيحاول Auto-Rickshaw حل مشكلة المرحلة وبناء بنية الكريستال للبروتين تلقائيًا مع برنامج نمذجة البروتين وصقله.
   1. بالنسبة للبروتينات التي لا يكون لها قالب نموذج homology، قم بتشغيل بروتوكول SAD لـ Auto-Rickshaw في الوضع المتقدم. أدخل المعلمات المطلوبة.
      1. حدد البروتين كنوع الجزيء.
      2. أدخل الطول الموجي لجمع البيانات في angstroms (Å).
      3. حدد "I" كعنصر بنية تحتية للإشارة إلى استخدام ذرات اليود.
      4. حدد "i3c" كنوع البنية الفرعية للإشارة إلى أن I3C هو جزيء التدرج.
      5. حدد "sub_direct" كأسلوب تحديد البنية الفرعية. هذه الطريقة توظف SHELXD³² للبحث عن البنية الفرعية.
      6. حدد "3" كرقم البنية الفرعية المتوقعة لكل مونومر.
      7. أدخل "1" كقطع الدقة للبحث تحتية. وهذا يسمح للسيارات - ريكشو لتحديد تلقائيا قطع القرار مناسبة.
      8. أدخل عدد المخلفات في مونومر واحد، ومجموعة فضائية من مجموعة البيانات، وعدد الجزيئات في الوحدة غير المتماثلة استناداً إلى معامل ماثيوز.
      9. حدد مستوى النشر المناسب لبيانات الأشعة السينية التي تناسب الاحتياجات. اختيار "AutoRickshaw المطورين" سيسمح للمطورين ريكشو السيارات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا ظهرت مشاكل.
      10. إدخال البيانات الشاذة كملف mtz.
      11. إدخال تسلسل البروتين كملف مُكَرَق أو بير أو txt. يمكن إنشاء ملف مُقَدّم في محرر نصوص (مثل المفكرة ++⁹ على Windows أو نانو في لينكس). إنشاء ملف جديد، أدخل التسلسل الأساسي للبروتين كخط واحد طويل أو مفصولة فواصل الأسطر. حفظ الملف مع ملحق الملف .seq.
      12. أدخل عنوان بريد إلكتروني مؤسسي.
4. يتم تسليم النتائج عبر رابط على شبكة الإنترنت يتم إرساله إلى عنوان البريد الإلكتروني المقدم.
   ملاحظة: AutoRickshaw هو خط أنابيب الآلي الذي يستدعي حزم البرمجيات البلورية المختلفة لحل هيكل الكريستال الأشعة السينية^{32،33،45،46،47،48،49،50،51،}52^{،53،54،55،56،57،58}. إذا فشل تشغيل Auto-Rickshaw في حل الهيكل، يمكن اختبار إعدادات Auto-Rickshaw الأخرى. يمكن تغيير أسلوب تحديد الهيكل إلى "sub_phassade" لاستخدام Phaser⁵⁹ بدلاً من SHELXD³². ويمكن أيضا زيادة عدد البنية الفرعية المتوقعة لكل مونومر أو نقصانه.
5. خلال مراحل تجريبية من بنية الكريستال، سوف لصناعة السيارات ريكشو محاولة لوضع ذرات الثقيلة في خلية وحدة، وخلق بنية تحتية. يمثل ترتيب المثلث متساوي الأضلاع لذرات اليود في I3C طريقة فعالة للتحقق من البنية الفرعية. إذا فشلت الخطوة 6.3، قد يساعد التحقق من صحة البنية الفرعية في حل البنية استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
   1. قم بتنزيل قائمة مواقع الذرات الثقيلة من صفحة نتائج Auto-Rickshaw. وهو ارتباط تشعبي يسمى "مواقع الذرة الثقيلة". هذا سيتم تحميل ملف نصي مع مواقع ذرة الثقيلة.
   2. تغيير ملحق الملف من .txt إلى .pdb.
   3. افتح الملف PDB في Coot⁶⁰. بدوره على التماثل لرؤية ذرات ثقيلة أخرى من وحدات غير متناظرة المجاورة.
   4. قياس المسافات بين الذرات الثقيلة، بما في ذلك عبر وحدات غير متناظرة. I3C سوف تظهر على أنها مثلث متساوي الأضلاع مع طول الجانب من 6 angstroms. وجود مثلث مع هذه الأبعاد يشير إلى مواضع تلك الذرات الثقيلة صحيحة.

النتائج

دمج I3C في rMMS يمكن أن تولد ظروف جديدة تدعم نمو البلورة المشتقة
وقد أظهرت فعالية فحص rMMS المتزامنة و I3C اشتقاق في اثنين من البروتينات, الدجاج البيض الأبيض lysozyme (HEWL, التي تم الحصول عليها كمسحوق lyophilized) والموضع المفترض Orf11 lysin N-terminal المجال (Orf11 NTD) من bacteriophage P68. تم فحص كل بروتين ضد PEG /ION HT تحت أربعة ظروف مختلفة بما في ذلك: غير المصنفة، المصنفة، غير المصنفة مع I3C وبذر مع I3C (الشكل 1). وبالنسبة لكلا البروتينين، فإن الإضافة الوحيدة لـ I3C لم تزيد من عدد الظروف المؤدية إلى التبلور. في حالة Orf11 NTD، تم تحديد حالة مناسبة واحدة فقط مع وبدون I3C (الشكل 1B). عندما تم إضافة I3C إلى شاشات HEWL ، تم تقليل عدد الزيارات من 31 إلى 26 ، مما يسلط الضوء على التعقيدات الإضافية للبلورة عند إدخال مركبات التدرج(الشكل 1A). بما يتفق مع دراسات أخرى، إضافة البذور إلى شاشات مصفوفة التجارية متفرق لتوليد شاشة rMMS زيادة كبيرة في عدد من الظروف التبلور ممكن لكلا البروتينات، مما أدى إلى زيادة 2.1 و 6 أضعاف لـ HEWL و Orf11 NTD، على التوالي^6،61 (الشكل 1). الأهم من ذلك ، إضافة في وقت واحد من I3C والبذور زيادة عدد الزيارات نسبة إلى شاشة غير مرئية ، مما يدل على زيادة 2.3 و 7 أضعاف لـ HEWL و Orf11 NTD ، على التوالي. العديد من البلورات من rMMS في وجود I3C إظهار مورفولوجيا الكريستال ممتازة (الشكل 2).

البذر يسمح بالسيطرة الدقيقة من عدد الكريستال في شاشات I3C rMMS
في تجارب البذور الدقيقة، يمكن التحكم في عدد البذور التي أدخلت في تجربة التبلور عن طريق تخفيف مخزون البذور وهذا يسمح للتحكم الدقيق في النوى في انخفاض^7،36. وهذا يسمح في كثير من الأحيان أكبر بلورات لتشكيل منذ هناك انخفاض المنافسة من جزيئات البروتين في مواقع nucleation. هذه الميزة تمتد أيضا إلى أسلوب I3C-rMMS وقد تم إثبات بنجاح في كل من HEWL و ORF11 NTD. استجمام حالة تبلور تم تحديدها من شاشة I3C-rMMS مع مخزون البذور المخففة أسفرت عن بلورات أقل ولكن أكبر(الشكل 3).

يمكن استخدام مراحل ساد لحل الهياكل من بلورات مشتقة من الشاشة rMMS I3C
بلورات نمت باستخدام مخزون البذور المخففة كما هو موضح في الشكل 3 واستخدمت في حل هيكل البروتينات باستخدام مراحل ساد باستخدام بيانات الحيود من بلورة واحدة(الشكل 4). تم جمع البيانات على خط الشعاع الأسترالي Synchrotron MX1⁶². يتم وصف تفاصيل جمع البيانات المفصلة و حلول البنية في مكان آخر²⁷.

الشكل 1 - تم استخدام rMMS لتوليد ظروف جديدة لنمو البلورات في وجود I3C لبروتين اختبار اثنين. 96 جيدا بخار نشر تبلور شاشات أجريت باستخدام شاشات مصفوفة التجارية متفرق. (A) تم اختبار البيض البيض Hen lysozyme مع شاشة HT مؤشر. تم البذور الصواني مع بلورات HEWL نمت في 0.2 M الترترات الأمونيوم دباسيتش 7.0، 20٪ (ث / الخامس) البولي إيثيلين جلايكول 3350. (ب)تم اختبار Orf11 NTD من bacteriophage P68 مع شاشة PEG/ION. تم البذور الصواني NTD Orf11 من بلورات من حالة G12 من الشاشة غير المصنفة، ويظهر باللون الأزرق. تظهر الظروف التي تدعم نمو البلورات باللون الأحمر. rMMS البذر في وجود وغياب I3C على حد سواء أعطى أكثر بكثير يضرب الكريستال من الصواني غير مرئية. الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون²⁷ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 - صور تمثيلية لبلورات نمت من تجارب انتشار البخار الموضحة في الشكل 1 (أ) و (ب). الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون²⁷ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 - تخفيف مخزون البذور هو وسيلة فعالة للحد من النوى في حالة تبلور وجدت باستخدام طريقة I3C-rMMS، للسيطرة على عدد من البلورات التي تشكل. إن تقليل التنو داخل قطرة غالباً ما يؤدي إلى نمو البلورات إلى أبعاد أكبر. الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون²⁷ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 -- Orf11 NTD (معرف PDB 6O43) و HEWL (معرف PDB 6PBB) وتبلور باستخدام طريقة I3C - rMMS وحلها باستخدام لصناعة السيارات ريكشو SAD مراحل. (أ)هياكل الشريط من HEWL و Orf11 NTD حلها من خلال مراحل التجريبية. (B) جزيء I3C ملزمة HEWL و Orf11 NTD. (ج) يتم ترتيب ذرات اليود الشاذة في I3C في مثلث متساوي الأضلاع من 6 Å. وبالتالي فإن وجود هذا المثلث في الهيكل الفرعي التدريجي يشير إلى وجود جزيء I3C في هذا الموضع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يتطلب تحديد بنية بروتين جديد في غياب نموذج homology مناسب للاستبدال الجزيئي مراحل تجريبية. هذه الأساليب تتطلب دمج الذرات الثقيلة في الكريستال البروتين الذي يضيف مستوى من التعقيد إلى خط أنابيب تحديد هيكل ويمكن أن أعرض العديد من العقبات التي يجب معالجتها. ويمكن دمج الذرات الثقيلة مباشرة في البروتين من خلال التعبير المسمى باستخدام سيلينوميثيونين وسيلينوسشتاين. وبما أن هذه الطريقة مكلفة وشاقة ويمكن أن تؤدي إلى انخفاض غلة البروتين، وغالبا ما يتم التعبير عن البروتين المسمى بعد أن تم العثور على ظروف التبلور وتحسينها مع البروتين غير المسمى. بدلا من ذلك، يمكن اشتقاق البلورات عن طريق نقع في محلول يحتوي على ذرات ثقيلة^22،63،64. وغالبا ما يستخدم هذا الأسلوب بلورات ذات جودة عالية، وبالتالي يتم تنفيذ بعد طريقة تبلور قوية قد تم بالفعل تطوير. الحصول بنجاح على الكريستال مشتق باستخدام هذه الطريقة يتطلب المزيد من التحسين لإجراءات النقع وفحص المركبات مراحل مختلفة، وبالتالي إضافة المزيد من الوقت لعملية شاقة بالفعل.

يمكن إجراء التبلور المشترك للبروتين مع الذرة الثقيلة في مرحلة الفحص ، وبالتالي تبسيط العملية بشكل فعال والحد من خطوات التلاعب بالكريستال التي يمكن أن تسبب الضرر. ومع ذلك ، لا يزال هناك سيناريو محتمل للحصول على عدد قليل من ضربات التبلور الأولي ومشكلة اختيار مركب ذرة ثقيلة متوافق. العديد من المركبات التدريجي المتاحة حاليا لا تتفق مع الزلاجة, المخازن المؤقتة والمواد المضافة التي توجد عادة في ظروف التبلور. قد تكون غير قابلة للذوبان في المخزونات الكبريتية والفوسفات، وchelate إلى سيترات وخلات، والرد بشكل غير موات مع هيبس وترايس المخازن المؤقتة أو تصبح معزولة من قبل DTT β-mercaptoethanol²¹. وبما أن مركب المراحل I3C لا يعاني من هذه التنافرات، فهو مركب قوي للتدرج يمكن أن يكون قابلاً للعديد من الظروف المختلفة.

في هذه الدراسة، يتم عرض طريقة مبسطة لإنتاج بلورات مشتقة جاهزة لتدرج ساد من خلال التبلور المتزامن لمركب I3C التدريجي و rMMS. ويؤدي الجمع بين كل من التقنيات إلى زيادة عدد مرات التبلور، مع وجود العديد من الظروف التي تحسنت خصائص المورفولوجيا والنقود. في كل من حالات اختبار NTD و HEWL، تم تحديد شروط جديدة في شاشة I3C-rMMS التي كانت غائبة عندما لم يكن I3C موجوداً. يحتمل، قد I3C ربط لصالح البروتين، وتسهيل تشكيل وتثبيت اتصالات الكريستال²⁷. وهذا بدوره قد يؤدي إلى التبلور وربما تحسين خصائص الحيود. بالإضافة إلى كونه مركب متوافق مع شاشات مصفوفة متفرقة، I3C هو أيضا مركب مراحل جذابة نظرا لخصائصه الجوهرية. المجموعات الوظيفية التي تتناوب مع اليود على سقالة حلقة العطرية تسمح ملزمة محددة للبروتينات. وهذا يؤدي إلى زيادة الإشغال ويحتمل أن يقلل من إشارة الخلفية²³. وعلاوة على ذلك، فإن ترتيب التشتت الشاذ في مثلث متساوي الأضلاع واضح في البنية الفرعية ويمكن استخدامه للتحقق بسرعة من تثبيت I3C (الشكل 4B و 4C). وأخيرا، فإنه يمكن أن تنتج إشارة شاذة مع إشعاع سينكروترون قابل للتواؤم وكذلك الكروم والنحاس الدورية مصادر الأشعة السينية الأنود. وبالتالي، يمكن تطبيقه على العديد من مهام سير العمل المختلفة. وبما أن I3C متاح على نطاق واسع وغير مكلف للشراء ، فإن هذا النهج في متناول معظم مختبرات البيولوجيا الهيكلية.

هناك العديد من الاعتبارات التجريبية التي يجب معالجتها عند استخدام أسلوب I3C-rMMS. لا يمكن تطبيق هذه الطريقة إذا لم يكن بالإمكان الحصول على المواد البلورية الأولية للبروتين. في الحالات الصعبة، يمكن أيضا أن تستخدم المواد البلورية من بروتين متماثل لتوليد مخزون البذور. وقد أظهرت هذه النهج البذر عبر لrMMS بعض النتائج الواعدة⁷. تحسين عدد البلورات من خلال تخفيف مخزون البذور هو خطوة حاسمة، والتي لا ينبغي إغفالها، لتعظيم فرصة إنتاج بلورات كبيرة ذات جودة عالية والحصول على بيانات الحيود المناسبة. وإذا كان هناك عدد قليل من المواقع المحددة في الوحدة غير المتماثلة، ينبغي تحسين الظروف المؤدية إلى التبلور مع زيادة تركيز I3C. وهذا قد يزيد من شغل I3C لتعظيم إشارة شاذة والمساعدة البلورة اشتقاق.

يمكن أن تكون هناك حالات حيث قد لا يكون هذا الأسلوب هو الطريقة المثلى لاشتقاق بلورات البروتين. كما يزيد حجم البروتين أو البروتين المعقدة، وعدد محدود من مواقع I3C على سطح البروتين قد لا توفر ما يكفي من قوة المراحل لحل الهيكل. في هذه السيناريوهات حيث يشتبه في أن حجم البروتين يعوق التدرج، قد يكون وضع وسم سيلينوميثيونين للبروتين نهجا أكثر قابلية للتطبيق على مراحل البروتين. إذا كان البروتين لديه أعداد كافية من بقايا الميثيونين في البروتين (يوصى بوجود الميثيونين واحد على الأقل لكل 100 بقايا⁶⁵⁾ويمكن تحقيق دمج السيلينيومثيونين عالي الكفاءة في البروتين (كما هو الحال في أنظمة التعبير البكتيري⁶⁶⁾، فإن ذرات السيلينيوم متعددة الإشغال عالية ستكون موجودة في البلورات لمرحلة الهيكل.

بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض البروتينات بطبيعتها غير مناسبة لاشتقاقها باستخدام I3C. مواقع الربط I3C على البروتينات تعتمد على بنية البروتين. قد توجد بروتينات تحتوي بشكل طبيعي على بقع قليلة مكشوفة متوافقة مع I3C ملزم. وبالتالي، فإنه ليس من غير المتوقع أن تكون هناك صعوبات في بلورة بعض البروتينات المستهدفة مع I3C.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محاقن لوير لوك ذات الاستخدام الواحد بسعة 10 مل	أديلاب ساينتيفك	T3SS10LAT	يستخدم لتوزيع شحم التفريغ لآبار صينية البلورات المعلقة
لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر	سيغما ألدريتش	CLS3527	يستخدم لتعليق صينية البلورات القطرية
شريط الختم الشفاف بعرض 3 إنش	أبحاث هامبتون	HR4-506	ل 96 شاشة تبلور بئر تم إعدادها بواسطة الروبوت
حمض 5-أمينو-2,4,6-ثلاثي يودوإيزوفثاليك	ألفا إيسار	B22178	يشار إليه عادة باسم I3C في المقال
آرت روبينز إنتيلي-بليت 96-2 الأصلي	أبحاث هامبتون	HR3-297	ل 96 شاشة تبلور بئر تم إعدادها بواسطة الروبوت
كوفرسلبز	ثيرمو فيشر العلمي	18X18-2	أغطية لآبار صينية البلورة المعلقة
شحم الفراغ من داو كورنينغ	أبحاث هامبتون	HR3-510	يستخدم لإغلاق آبار صينية البلورات المعلقة
Eppendorf Pipette 0.1 μ L-2.5 & mu; L	إبندورف	3120000011
جيلسون بيبيت 2 μ L-20 & mu; L	مجموعة جون موريس	1153247
جيلسون بيبيت 20 ومو؛ L-200 & mu; L	مجموعة جون موريس	1152006
ماصات الباستور الزجاجية	أديلاب ساينتيفك	HIR92601.01
بياض البيض اللي زوزيم	سيغما-ألدرتش	L6876	حوالي 95٪ نقي
شاشة IndexHT	أبحاث هامبتون	HR2-134
مضيء المجهر	ميجي تكنو	FT192/230	مصدر الضوء لإضاءة تجارب علم البلورات
شاشة HT من PEG/ION	أبحاث هامبتون	HR2-139
موزع سائل فينيكس	آرت روبينز إنسترومنتس	602-0001-10
مشرط مع شفرة المشرط رقم 15	أديلاب ساينتيفك	LV-SMSCPO15
مجموعة خرز البذور	أبحاث هامبتون	HR2-320	تحتوي المجموعة على مسبار زجاجي لسحق البلورات. خرزة بذور PTFE، المصممة لسحق البلورات، هي أيضا جزء من المجموعة لكنها غير مستخدمة في هذا البروتوكول.
المجهر الستيريو	ميجي تكنو	EMZ-5TR	المجهر لتصوير تجارب علم البلورات
الملقط	سيغما-ألدرتش	T5415
خلاط الدوامة	أديلاب ساينتيفك	RAVM1