مقالة منهجية

تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة

DOI:

10.3791/62023

⸱

مايو 16, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة مكررة لإزالة الأنسجة وتطبيقها على قلب الماوس البالغ. تم تصميم هذه الطريقة لمسح كثيفة، والأنسجة القلبية autofluorescent، مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية المسمى يعزى إلى استراتيجية مراسل الجينية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر انتشارا للوفيات في جميع أنحاء العالم وغالبا ما تتميز بزيادة تليف القلب التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة تصلب البطين مع تغيير وظيفة القلب. هذه الزيادة في التليف البطيني القلبي يرجع إلى تنشيط الخلايا الليفية المقيمة ، على الرغم من أن كيفية عمل هذه الخلايا داخل القلب ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) ، عند خط الأساس أو بعد التنشيط ، ليست مفهومة جيدا. لدراسة كيفية مساهمة الخلايا الليفية في أمراض القلب وديناميكياتها في القلب ثلاثي الأبعاد ، تم تطوير طريقة منقحة لإزالة الأنسجة والتصوير المستندة إلى CLARITY تظهر الخلايا الليفية القلبية المسماة بالفلورسنت داخل قلب الماوس بأكمله. تم تسمية الخلايا الليفية المقيمة في الأنسجة وراثيا باستخدام فئران المراسلة الفلورية Rosa26-loxP-eGFP المتقاطعة مع الأرومة الليفية القلبية التي تعبر عن خط طرق Tcf21-MerCreMer. وقد استخدمت هذه التقنية لمراقبة ديناميات توطين الخلايا الليفية في جميع أنحاء البطين الأيسر البالغ بأكمله في الفئران السليمة وفي نماذج الماوس الليفي لأمراض القلب. ومن المثير للاهتمام، في نموذج إصابة واحدة، لوحظت أنماط فريدة من الخلايا الليفية القلبية في قلب الفأر المصاب الذي تبع عصابات من الألياف الملفوفة في اتجاه الانكماش. وفي نماذج الإصابات الإقفارية، حدثت وفاة في الخلايا الليفية، أعقبها إعادة السكان من المنطقة الحدودية المحتشدة. بشكل جماعي ، تسمح تقنية توضيح الأنسجة القلبية المكررة ونظام التصوير الرقمي بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الليفية القلبية في القلب دون قيود فشل اختراق الأجسام المضادة أو القضايا السابقة المحيطة بالفلورسينس المفقود بسبب معالجة الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن خلايا القلب تشكل أكبر جزء حجم في القلب ، إلا أن الخلايا الليفية القلبية أكثر وفرة وتشارك بشكل حاسم في تنظيم السمات الهيكلية والتجزية الأساسية لهذا الجهاز. الخلايا الليفية القلبية هي متحركة للغاية، واستجابة ميكانيكيا، وتتراوح phenotypically اعتمادا على مدى تفعيلها. الخلايا الليفية القلبية ضرورية للحفاظ على المستويات الطبيعية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وإنتاج ECM قليل جدا أو أكثر من اللازم من قبل هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى المرض1،2،3. ونظرا لأهميتها في المرض ، أصبحت الخلايا الليفية القلبية موضوعا متزايد الأهمية للتحقيق نحو تحديد استراتيجيات العلاج الجديدة ، خاصة في محاولة للحد من التليف المفرط4و5و6و7. عند الإصابة ، تنشط الخلايا الليفية وتفرق إلى نوع خلية اصطناعية أكثر تعرف باسم الورم العضلي ، والتي يمكن أن تكون منتشرة وتفرز ECM وفيرة ، وكذلك نشاط انقباش يساعد على إعادة تشكيل البطينين.

في حين تم تقييم الخلايا الليفية القلبية على نطاق واسع لخصائصها في الثقافات ثنائية الأبعاد6و8و9و10، إلا أنه أقل بكثير من فهم خصائصها وديناميكياتها في القلب الحي ثلاثي الأبعاد ، إما عند خط الأساس أو مع تحفيز المرض. هنا ، وقد وصفت طريقة المكرر لمسح الأنسجة قلب الماوس الكبار مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية وصفت مع Rosa26 - loxP - eGFP x Tcf21 - MerCreMer نظام المراسل الجيني. داخل القلب، Tcf21 هو علامة محددة نسبيا من الخلايا الليفية هادئة4. بعد إعطاء تاموكسيفين لتنشيط بروتين MerCreMer غير القابل للانزدواج ، فإن جميع الخلايا الليفية هادئة ستعبر بشكل دائم عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) من مكان Rosa26 ، والذي يسمح بتتبعها في الجسم الحي.

توجد العديد من بروتوكولات تطهير الأنسجة الراسخة ، وبعضها تم تطبيقه على القلب11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك، تم العثور على العديد من الكواشف المستخدمة في بروتوكولات مختلفة لإزالة الأنسجة لإرواء إشارات الفلورة الذاتية18. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب مسح قلب البالغين بسبب البروتينات الوفيرة التي تحتوي على مجموعة الهيم التي تولد autofluorescence19. لذلك ، كان الهدف من هذا البروتوكول هو الحفاظ على مضان علامة الورم الليفي مع تثبيط متزامن للفلورة الذاتية للهيم في قلب البالغين المصابين للحصول على التصور الأمثل ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي12و13و14و16و17و20.

الدراسات السابقة في محاولة لفحص الورم الليفي القلب في الجسم الحي تستخدم الأجسام المضادة التي غرست لتسمية هذه الخلايا، على الرغم من أن هذه الدراسات كانت محدودة من قبل اختراق الأجسام المضادة وهيكل الأوعية الدمويةالقلبية 14،16،17،20. على الرغم من أن Salamon وآخرون قد أظهرت تطهير الأنسجة مع الحفاظ على مضان الخلايا العصبية الموضعية في قلب الوليد، وNehrhoff وآخرون أظهرت الحفاظ على الفلورية بمناسبة الخلايا النخاعية، والحفاظ على الفلورية الذاتية من خلال الجدار البطيني بأكمله لم يثبت بعد، بما في ذلك تصور الخلايا الليفية القلب الكبار في خط الأساس أو بعدالإصابة 13،20. هذا البروتوكول تطهير الأنسجة يصقل خليط من البروتوكولات السابقة على أساس طريقة وضوح (واضح تبادل الدهون الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة / في الموقع التهجين الأنسجة المتوافقة مع الهيدروجيل) وPEGASOS (البولي ايثيلين غليكول (PEG) المرتبطة نظام المذيبات). سمح هذا البروتوكول المكرر بفحص أقوى للخلايا الليفية القلبية في قلب الماوس عند خط الأساس وكيفية استجابتها لأنواع مختلفة من الإصابات. البروتوكول واضح وقابل للاستنساخ وسيساعد على توصيف سلوك الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال. المؤسسة هي أيضا AAALAC (الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية الحيوان المختبرية) معتمدة. تم قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، وأعطيت الفئران التي تخضع لإجراءات جراحية للبقاء على قيد الحياة تخفيف الألم (انظر أدناه). وتستند جميع الأساليب المستخدمة في إدارة الألم والقتل الرحيم إلى توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية. تم إيواء جميع الفئران في وحدات الفراش كوب الذرة مع الماء والغذاء المتاحة في جميع الأوقات. تم إيواء الفئران 4 إلى قفص مع نفس الجنس. لأغراض الجراحة أو إزالة الأنسجة غير المصابة، تم استخدام أعداد متساوية من الفئران والإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع.

ملاحظة: تم الحفاظ على الحالات الجراحية العقيمة في جميع العمليات الجراحية. تحول الجراح إلى فرك نظيف وثوب معقم ثم قام بارتداء أغلفة الأحذية وشبكة شعر. ثم قام الجراح بتنظيف أيديهم بالكلورهيكسيدين وارتداء قفازات جراحية معقمة. وساعد الجراح من قبل فني الذي مخدر, حلق, وتنظيف موقع شق 3 مرات لكل منهما, بالتناوب بين 2٪ جلوكونات الكلوروهيكسيدين و 70٪ ايزوبروبانول. ثم تم إحضار الفئران إلى الجراح، وأجريت عملية جراحية. بين الحيوانات ، تم تعقيم الأدوات في معقم حبة.

1. إعادة تركيب كري

  1. عبر Rosa26-loxP-eGFP الفئران (Rosa26-nLacZ [FVB. CG-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) مع فئران Tcf21-MerCreMer (الشكل 1A)6،21.
  2. عندما يصل نسل هذا الصليب إلى 6 أسابيع من العمر ، يمكنك إعطاء حقنة داخل الصفاق من 75 ملغم / كجم من تاموكسيفين المذاب في زيت الذرة. 22 إدارة هذا تاموكسيفين مرتين، 48 ساعة عن بعضها البعض (الشكل 1B).
  3. بعد حقن تاموكسيفين، وضع الفئران على نظام غذائي من الغذاء تاموكسيفين (~ 0.4 غرام / كجم تاموكسيفين سيترات) لمدة أسبوع واحد. بعد أسبوع واحد من الطعام تاموكسيفين، والعودة الفئران إلى نظام غذائي تشاو autoclaved العادي لمدة أسبوع واحد قبل إجراء عملية جراحية(الشكل 1B). تعيين عدد مناسب من الفئران (3 لكل حالة جراحية) لتكون ضوابط غير مصاب. التضحية هذه الفئران، والمضي قدما في عملية المقاصة المحددة أدناه بعد أسبوع واحد من النظام الغذائي تشاو العادي.
  4. بعد نظام تاموكسيفين وإعادة التركيب، قم بإجراء عملية جراحية.

2. نماذج جراحية

  1. الإقفارية/التروية (I/R)23،24
    1. تخدير الفئران مع 1.5٪ غاز isoflurane في هواء الغرفة في مربع التهوية. حلق صدورهم وأعناقهم مع المقصات الكهربائية، ومن ثم فرك المناطق حلق مع مسحة 2٪ كلورهيكسيدين جلوكونات غارقة.
    2. استخدام مرهم المسيل للدموع الاصطناعية لمنع الجفاف أثناء الجراحة عن طريق وضع مرهم على عيون الفئران مخدرة.
    3. إجراء قطع منتصف الرقبة باستخدام مقص الجراحية للسماح التصور من القصبة الهوائية. Intubate مع قسطرة 20 G عن طريق وضع أنبوب التنبيب في القصبة الهوائية وتصور القسطرة القصبي من خلال شق منتصف الرقبة. ضع الفئران على جهاز التنفس الصناعي أثناء تخديرها بغاز الأيزوفلوران (1.5٪) في هواء الغرفة.
    4. إجراء شق تحت الطرف الأمامي الأيسر مع مقص الجراحية، وقطع العضلات الوربي بين الأضلاع 3 و 4. انشر الأضلاع المفتوحة باستخدام الروافد.
    5. ضع إسفنجة صغيرة غارقة في محلول ملحي بين الرئة والقلب لمنع تلف الرئة.
    6. باستخدام إبرة fishhook (6.5 ملم، 3/8 ج)، ربط الشريان التاجي الأيسر مع عقدة زلة قابلة للإفراج باستخدام 8-0 البرولين.
    7. إزالة الإسفنج باستخدام ملقط.
    8. خياطة العضلات الوربي مغلقة باستخدام الحرير مضفر 4-0 وخياطة مستمرة في حين الخارج أيضا نهاية 8-0 عقدة زلة البرولين.
    9. أغلق شقوق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة الموضعية مع نهاية عقدة الانزلاق المغلقة البارزة.
    10. بعد ساعة واحدة من الانسداد، اسحب الطرف الخارجي من عقدة الانزلاق لإطلاق انسداد الشريان التاجي داخليا، وتخفيف نقص التروية والتسبب في إعادة التروية.
    11. إدارة 0.02 مل من 1 ملغ / مل الإفراج الموسعة البوبرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد (72 ه الإفراج) كمسكن للألم, ووضع الفئران في غرفة حضانة المؤوكسجين في 37 درجة مئوية, منفصلة عن الحيوانات الأخرى. مراقبة الفئران على الأقل كل 15 دقيقة حتى أنها قد تعافى من التخدير وقادرة على الحفاظ على وضع القص أو الجلوس. أعد الفئران إلى مسكنها العادي.
    12. تقييم الحيوانات للألم والضيق لمدة 48 ساعة بعد الجراحة، ورصد موقع شق يوميا حتى تلتئم تماما.
    13. مراقبة الفئران للترطيب والتغذية والرفاه العام بعد الجراحة حتى التضحية.
  2. احتشاء عضلة القلب (MI)25،26،27
    1. تنفيذ الخطوات 2.1.1-2.1.7.
    2. استخدام خياطة مستمرة لإغلاق العضلات الوربية باستخدام الحرير مضفر 4-0.
    3. أغلق شق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة الموضعية.
    4. تنفيذ الخطوات 2.1.11-2.1.13.
  3. ضخ مضخة أنجيوتنسين الثاني/الفينيليفرين التناضحي الدقيق
    1. إعداد حل عمل 10 ميكروغرام /ميكرولتر من أنجيوتنسين الثاني و 500 ميكروغرام / ميكرولتر حل العمل من الفينيليفرين في ظل ظروف معقمة (أي، في غطاء محرك السيارة تدفق صفح) عن طريق إضافة 1 ملغ من أنجيوتنسين الثاني إلى 100 ميكرولتر من الفوسفات المعقم العازلة المالحة (PBS) و 250 ملغ من هيدروكلوريد الفينيليفرين إلى 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. حساب تخفيف كل حل العمل والحجم النهائي للاستغناء عن مضخة التناضح الدقيق على أساس وزن الماوس.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتطلب فأر 20 جراما 20 جراما × 14 يوما × 1.5 ميكروغرام/يوم = 420 ميكروغرام أنجيوتنسين، أو 42 ميكرولتر من محلول العمل، بالإضافة إلى 20 جراما × 14 يوما × 50 ميكروغرام/يوم = 14000 ميكروجرام هيدروكلوريد فينيلفرين، أو 28 ميكرولتر من حل العمل.
    3. لوزن كل فأر، تمييع المخزون العامل من المخدرات في برنامج تلفزيوني عقيم وملء مضخات التناضح الدقيق (0.25 ميكرولتر / ساعة، 14 يوما، ما يقرب من 100 ميكرولتر) باستخدام إبرة 27 G وحقنة 1 مل.
      ملاحظة: هذا سوف تولد معدل تدفق 1.5 ميكروغرام ∙ ز-1∙ يوم-1 من أنجيوتنسين الثاني و 50 ميكروغرام ∙ ز-1∙ يوم-1 من هيدروكلوريد الفينيليفرين وضعت مرة واحدة في الفئران.
    4. تخدير الفئران مع استنشاق isoflurane 1.5٪ (للتأثير) في غرفة التهوية التي تحتوي على هواء الغرفة.
    5. ضع الفئران المخدرة على طاولة جراحية معقمة في وضع الأوبين، وحافظ على التخدير مع استنشاق غاز الأيزوفلوران (1.5٪) من خلال مخروط الأنف.
    6. استخدام مرهم المسيل للدموع الاصطناعية على عيون الحيوان لمنع جفاف أثناء الجراحة.
    7. حلق الفراء فوق منطقة الزرع مع مقصات الشعر الكهربائية، وتعقيم المنطقة ليتم قطع باستخدام الإيثانول ومسحة معقمة. إجراء شق صغير (حوالي 1 سم) مع مقص الجراحية في طبقة البشرة من جلد الماوس على الجانب الجانبي الأيمن من الظهر، تحت شفرة الكتف. استخدم الجوانب المملة لزوج من المقص الجراحي لتمديد الجلد برفق في منطقة الزرع وحولها لإدخال الضخة الصغيرة.
    8. ضع المضخة التناضحية الدقيقة داخل الشق ، وناور جسديا إلى يسار الخط الوسطي الظهري للفأر عن طريق تدليك المضخة يدويا تحت الجلد.
    9. أغلق الشق عن طريق خياطة مستمرة باستخدام الحرير 4-0 مع إبرة نقطة تفتق.
    10. بعد زرع المضخة، قم بإعطاء البوبرينورفين بطيئ الإطلاق بجرعة 0.1 ملغم/كجم من وزن الجسم عن طريق الحقن تحت الجلد للتسكين (إطلاق بطيء 72 ساعة). ضع الفئران في غرفة حضانة مؤوكسجينة عند 37 درجة مئوية ، منفصلة عن الحيوانات الأخرى. مراقبة الفئران على الأقل كل 15 دقيقة حتى يتعافى من التخدير ويمكن الحفاظ على وضع القص أو الجلوس.
    11. عند التعافي من التخدير في غرفة الاحترار 37 درجة مئوية ، ضع الفئران مرة أخرى في وحداتها السكنية القياسية.
    12. مراقبة الفئران للألم والضيق لمدة 48 ساعة بعد الجراحة، ورصد موقع شق يوميا حتى تلتئم تماما.
    13. مراقبة الفئران للترطيب والتغذية والرفاه العام بعد الجراحة حتى التضحية.

3. مسح قلوب الماوس الكبار باستخدام بروتوكول CLARITY النشط المعدلة

  1. إعداد منطقة جراحية نظيفة عن طريق تعقيم سطح الجراحة وجميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70٪. إعداد حل من البرد 1x PBS و 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في برنامج تلفزيوني (100 مل لكل منهما). ارتداء قفازات، معطف المختبر، قناع الوجه، وحماية العين.
  2. إعداد العازلة الهيبارين عن طريق تخفيف 10 وحدات من الهيبارين في 0.9٪ ث / v محلول كلوريد الصوديوم. حقن كل فأر intraperitoneally مع 60 ميكرولتر من الهيبارين-NaCl باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 27 G.
  3. بعد خمس دقائق من حقن محلول الهيبارين-NaCl ، قم بالتخدير للفئران باستخدام استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 1.5٪ (للتأثير) في غرفة التهوية التي تحتوي على هواء الغرفة.
  4. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، حيث يتم عقد الجزء الخلفي من الرأس مع شقة ، نهاية مغلقة من ملقط ، في حين يتم خلع العمود الفقري عن طريق سحب الذيل.
  5. تنظيف سطح البطن من الماوس مع الإيثانول 70٪ على مسحة القطن. إجراء شق عرضي 3 سم حوالي 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام مقص الجراحية.
  6. فصل الجلد من نسيج جدار البطن الكامنة عن طريق إزالة البطن حتى عملية xiphoid (عقد الجلد الأقرب إلى الذيل وسحب الجلد الأقرب إلى الرأس نحو القفص الصدري). إجراء شق عرضي 2 سم في نسيج جدار البطن تحت الجلد 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام مقص الجراحية. جعل قطع عمودي من هذا الشق العرضي، حتى خط الوسط وعبر القفص الصدري. ثبت القفص الصدري مرة أخرى، وكشف القلب.
  7. استخدام إبرة 27 G ومحاقنة 10 مل لحقن برنامج تلفزيوني الباردة في كافا فينا متفوقة وorta (أي تلاعب الموضعية للقلب ينبغي أن يتم بعناية مع ملقط حاد لتجنب ثقب) لمسح الدم من القلب.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة التشوه الكافي عن طريق ارتعاش الذيل وتلون الرئتين.
  8. استخدام إبرة 27 G ومحقنة 10 مل لحقن الباردة 4٪ PFA في كافا فينا متفوقة وorta لبدء عملية التثبيت.
  9. استأصل القلوب. يجب فصل الأذين والبطين الأيمن والحاجز والبطين الأيسر باستخدام مشرط مستقيم النصل. ضع هذا النسيج في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مملوء ببرودة PFA بنسبة 4٪، وضع على جهاز نوتاتور عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  10. غسل القلب 3 مرات لمدة 1 ساعة مع كل برنامج تلفزيوني 1x الباردة لإزالة PFA الزائدة.
  11. إعداد هيدروجيل (يطلق عليه A4P0 لتكوين الاكريلاميد النسبي / البولياكريلاميد) عن طريق خلط المواد الكيميائية التالية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل: 10٪ من 40٪ أكريلاميد، 10٪ 1x PBS، 80٪ ماء مقطر.
  12. إضافة الحل 0.25٪ من البروبان الضوئي (2،2-Azobis [2-(2-imidazolin-2yl)البروبان)dihydrochloride) إلى محلول الهيدروجيل فقط قبل غمر القلب في الهيدروجيل.
  13. ضع القلب في أنبوب مخروطي يحتوي على الهيدروجيل. التفاف أنبوب مخروطي في احباط، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية دون اضطراب جسدي.
  14. بعد حوالي 14 ساعة عند 4 درجات مئوية، حرك الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على القلب إلى حمام حبة 37 درجة مئوية.
  15. بعد 2.5 ساعة في حمام حبة، وإزالة القلب من الهيدروجيل بعناية مع ملقط.
  16. غسل القلوب 3 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني 1x في 37 درجة مئوية على نوتاتور.
  17. ضع القلوب في سلة آلة الكهربائي النشطة باستخدام ملقط، ووضع الغطاء على السلة. تأكد من أن الغطاء في مكانه بشكل آمن.
  18. ملء خزان غرفة الكهربية النشطة مع حل المقاصة الكهربائية عن طريق صب الحل في الغرفة.
  19. بمجرد أن تمتلئ الغرفة بحل التطهير الكهربائي ، يمكن غمر السلة التي تحتوي على القلب. ضع الغطاء على آلة الكهرومورفوريس بشكل آمن.
  20. تشغيل آلة الكهربائي في 1.5 A، 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  21. بعد 1.5 ساعة من الكهروفورسيس، تحقق من القلوب بصريا للتأكد من عدم وجود أنسجة مبهمة. إذا كانت مناطق الأنسجة لا تزال مبهمة، إعادة غمر القلب في محلول الكهربائي في غرفة كهربائية، والاستمرار في الكهروفورسيس لمدة 0.5 ساعة في وقت واحد.
    ملاحظة: يجب إيقاف الإلكتروفورسيس عند ظهور العلامات الأولى لتلف الأنسجة (مثل تآكل الأنسجة).
  22. غسل القلوب في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة، 3 مرات لكل منهما، في 37 درجة مئوية على نوتاتور.
  23. غمر قلوب في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على N,N,N′,N′-Tetrakis(2-هيدروكسي بروبيل)إيثيلينديامين – عامل إزالة اللون الذي يقلل من autofluorescence هيمي.
    ملاحظة: يجب تغيير هذا الحل كل 24 ساعة حتى القلوب واضحة تماما (حوالي 2 أيام).
  24. غسل القلوب في أنبوب مخروطي 15 مل مع 1x PBS 3 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما لإزالة عامل إزالة اللون الزائد.
  25. إعداد معامل الانكسار مطابقة الحل (RIMS) من خلال الجمع بين 30 مل من 0.02 متر الفوسفات العازلة، 40 غرام من 5-(N-2، 3-dihydroxypropylacetamido)-2، 4، 6-ثلاثي-iodo-N،N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) ايزيفثالاميد مع اثارة (يجب أن تذوب تماما– وهذا يمكن أن يستغرق ما يصل الى ساعة), 5 ملغ من أزيد الصوديوم, 50 ميكرولتر من Tween20, و 1 غرام من 1,4-diazabicyclo[2.2.2]أوكتان, وضبط درجة الحموضة إلى 7.5.
  26. توازن القلوب في RIMS لمدة 48 ساعة قبل التصوير.

4. مسح الصور قلوب باستخدام المجهر واحد تستقيم كونفوجكال فوتون

ملاحظة: يتكون جهاز التصوير من النصف السفلي من طبق بيتري زجاجي طوله 10 سم، وخزان قاع مطبوع ثلاثي الأبعاد، وزلزلة زجاجية مستديرة، وخزان علوي مطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 1C-E). تم صنع مواد مطبوعة ثلاثية الأبعاد داخليا من قبل قسم الهندسة السريرية في مستشفى سينسيناتي للأطفال.

  1. استخدام الشحوم فراغ لختم خزان القاع المطبوعة 3D في طبق بيتري الزجاج عن طريق وضع طبقة رقيقة من الشحوم فراغ على الجزء السفلي من قطعة مطبوعة 3D(الشكل 1C).
    ملاحظة: يجب أن يكون الخزان بنفس ارتفاع العينة التي يتم تصويرها (أي، لا ينبغي ضغط العينة بواسطة غطاء الزجاج الموضوع فوقه، كما يجب ألا تكون العينة قادرة على الطفو والتحرك داخل الخزان).
  2. ملء الخزان مع RIMS، وإزالة جميع فقاعات مع طرف pipet. ضع القلب في RIMS بعناية مع الجدار البطيني الأيسر المواجه لأعلى ، مما يضمن عدم إدخال أي فقاعات في الحل.
  3. الالتزام غطاء الزجاج إلى السطح السفلي من قطعة خزان 3D المطبوعة أعلى (الشكل التكميلي 1A) باستخدام الشحوم فراغ (مرة أخرى عن طريق وضع طبقة رقيقة من الشحوم فراغ على قطعة مطبوعة 3D، ووضعها على زلة الغطاء) (الشكل 1D).
  4. وضع غطاء الزجاج والخزان العلوي، coverlip الجانب إلى أسفل، على الخزان السفلي (الشكل التكميلي 1B)،دون إدخال فقاعات. الالتصاق بين RIMS وغطاء زلة سيوفر ختم بين أعلى وأسفل قطعة الخزان(الشكل 1E).
  5. ملء الخزان العلوي مع الجلسرين للاستخدام مع هدف الغمر 10x الجلسرين.
  6. استخدام مجهر فوتون واحد مجهزة رئيس مسح confocal متعددةphoton لصورة قلوب مسحها.
  7. خفض مرحلة المجهر فوتون واحد، ووضع طبق بيتري التي تحتوي على عينة في وسط المرحلة. رفع المرحلة وخفض هدف الغمر 10x الجلسرين في الجلسرين في الخزان العلوي للجهاز عينة. تأكد من أن العينة في بؤرة التركيز من خلال النظر إلى حافة العينة باستخدام العدسة.
  8. قم بالتبديل من عرض العدسة إلى عرض الكاميرا على الكمبيوتر من خلال النقر على الزر المباشر.
    1. تعيين المعلمات X و Y عن طريق تحديد موقع أول أوسع جزء من عينة الأنسجة، والتي ينبغي أن تكون في الجزء السفلي من طبق بيتري.
    2. انقر على اكتساب ND والعرف متعدد النقاط. إنشاء نقاط متعددة عن طريق العثور أولا على منتصف عينة الأنسجة باستخدام عصا التحكم لاكتساح اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل.
    3. ثم، استنادا إلى حجم الأنسجة، حدد حجم التبليط اللازم (عادة 6 × 5 لقلب فأر عمره 6-8 أسابيع). القيام بذلك عن طريق تشغيل اختبار التصوير عن طريق التقاط فقط X و Y المعلمات (إلغاء تحديد z تحت علامة التبويب اكتساب ND)للتحقق ما إذا كان تم التقاط طول وعرض الأنسجة بأكملها.
  9. لتعيين المعلمات z، افتح التنقل XYZ، وانقر على الرموز صعودا وهبوطا حتى العثور على أعلى وأسفل العينة.
    1. افتح لوحة تصحيح كثافة Z واضبط الفلورسينس في أعلى الأنسجة ووسطها وأسفلها لتصحيح كثافة الأنسجة عن طريق زيادة أو تقليل قوة الليزر عند كل نقطة z. تعيين هذه بالنقر على السهم مجموعة على يمين لوحة تصحيح كثافة Z.
    2. تعيين حجم الخطوة Z في لوحة اكتساب ND إلى 5 ميكرومتر.
  10. بعد تحديد المعلمات X و Y و Z للقلب وتعيين تصحيح شدة z ، استخدم المجهر المستقيم الآلي مع هدف غمر 10x glycerol مع ماسح ضوئي رنانة وأنابيب الفوسفيدية الضوئية (GaAsP PMTs) لتصوير القلوب المطهرة. تأكد من أن علامات التبويب XY و Z يتم فحصها ضمن اكتساب ND، واضغط على تصحيح Run Z.
  11. غرزة، unmix، وdenoise الصور الناتجة عن طريق فتح صورة متعددة النقاط في برنامج المعالجة والنقر على زر غرزة. تحت الصورة، انقر على التميي ، 2 قناة، ثم ابحث. وتحت الصورة، انقر على denoise.ai، ثم انقر على قناة الفلورسنت المفضلة (أي GFP).
    ملاحظة: ينتج عن هذه العملية صورة ثلاثية الأبعاد للخلايا الليفية الإيجابية ل GFP في البطين الأيسر بالكامل.
  12. استخدام برامج التحليل الثانوي لتحديد المزيد من الأنماط والاتجاهات في تشتت الخلايا الليفية القلبية. استخدم الدالة البقع عن طريق تشغيل برنامج معالج البقع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الليفية القلبية ضرورية لوظيفة خط الأساس للقلب وكذلك للاستجابة لإصابة القلب. وقد أجريت محاولات سابقة لفهم ترتيب ومورفولوجيا هذه الخلايا إلى حد كبير في إعدادات 2-D. ومع ذلك ، تم نشر تقنية تطهير الأنسجة القلبية المكررة(الشكل 2)وتقنية التصوير ثلاثي الأبعاد ، والتي تسمح بالتصور المتقدم والأكثر تفصيلا للخلايا الليفية القلبية. مع هذه التقنية التصوير، تم العثور على الخلايا الليفية لتكون معبأة بكثافة ولها مورفولوجيا مغزل في قلوب غير مصاب (الشكل 3، أشرطة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة مكررة لتطهير الأنسجة التي تسمح بتصور الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي ، سواء عند خط الأساس أو بعد الإصابة ، لتوصيف وفهم الخلايا الليفية بشكل أفضل في قلب الماوس. يعالج هذا البروتوكول المعزز القيود في بروتوكولات إزالة الأنسجة الموجودة التي حاولت تحديد أنواع خلايا محددة في قلب البالغين أو حديثي الولادة12و13و14و16و17و2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين أي إفصاحات تتعلق بمحتوى هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يعترفوا بجوهر التصوير Confocal CCHMC لمساعدتهم وتوجيههم في تطوير هذا النموذج ، وكذلك مات باتي من الهندسة السريرية لتصميم جميع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. تم دعم ديميتريا فيشيسر بمنحة تدريبية من المعاهد الوطنية للصحة ، (NHLBI ، T32 HL125204) وجيفري د. مولكينتين بدعم من معهد هوارد هيوز الطبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-0 حرير مضفرEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40٪ محلول أكريلاميدBio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
مرهم دموع اصطناعيCovetrus048272
DABCO (1،4-diazabicyclo [2.2. 2] أوكتان)ميليبور SigmaD27802-25G
GLUture لاصق الأنسجة الموضعيةWorld PrecisionInstruments 503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start AnalysisSoftware أكسفورد إنسترومنتسزN / A
مضخات التناضح الدقيقAlzetModel 1002
Nikon ElementsNikonN / A
نيكون A1R HD مجهر مستقيمنيكونN / A
عادي معقم تشاولابدايت5010
Nycodenz ، 5- (N-2 ، 3-dihydroxypropylacetamido) -2 ، 4 ، 6-tri-iodo-N ،
N'-bis (2 ، 3 ثنائي هيدروكسي بروبيل) إيزوفثلاميد		CosmoBioAXS-1002424
علوم المجهر الإلكترونيبارافورمالديهايد15710
فينيل إيفرين هيدروكلوريدسيجماP6126-10G
البادئ الضوئيواكو للكيماوياتVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ ، -EGFP) Glh / J]جاكسون مختبراتجاكس رقم المخزون: 012429
أزيد الصوديومSigma AldrichS2002-5G
محلول كلوريد الصوديومHospira، Inc.NDC 0409-4888-10
تاموكسيفينسيجما ألدريتشT5648
تاموكسيفين طعامEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol ، N ، N ، N ، N & Prime ؛ N & Prime ؛ N ؛ -Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine ، عامل إزالة اللونMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity غرفة المقاصة الكهربيةالشعارات BiosystemsC30001
X-Clarity محلول المقاصة الكهربائيالشعارات BiosystemsC13001
سلة أنسجة الرحلان الكهربائي X-Clarityالشعارات BiosystemsC12001
X-Clarity حامل سلة الأنسجة للرحلان الكهربائيشعارات BiosystemsC12002
Analysis Software

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

مقالات ذات صلة