يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من الأعضاء الدماغ البشري لنمذجة مرض الميتوكوندريا

6.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

يونيو 21, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

في هذه المقالة

ملخص

نحن نصف بروتوكول مفصل لتوليد الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية المستمدة من أعضاء الدماغ واستخدامها في نمذجة أمراض الميتوكوندريا.

الملخص

أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية في التمثيل الغذائي وغير قابلة للشفاء حاليا. هذه الأمراض تسبب عيوب نمائية عصبية لا تزال آلياتها الأساسية في حالة توضيح. حاجز رئيسي هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص ضعف الخلايا العصبية في وقت مبكر ينظر في المرضى. يتيح التقدم في تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) توليد أعضاء دماغية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) يمكن استخدامها للتحقيق في تأثير الأمراض على تطور الجهاز العصبي وتنظيمه. وقد أدخل الباحثون، بما في ذلك هؤلاء المؤلفين، مؤخرا organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات الميتوكوندريا. هذه الورقة تقارير بروتوكول مفصل للجيل قوية من الأعضاء الدماغ المستمدة من iPSC الإنسان واستخدامها في التنميط الحيوي الميتوكوندريا وتحليلات التصوير. هذه التجارب سوف تسمح باستخدام organoids الدماغ للتحقيق في الاختلالات الأيضية والتنموية، ويمكن أن توفر معلومات حاسمة لتشريح الأمراض العصبية من أمراض الميتوكوندريا.

المقدمة

أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية من التمثيل الغذائي1. وهي ناجمة عن الطفرات الوراثية التي تعطل عمليات الميتوكوندريا المختلفة، بما في ذلك الفوسفور التأكسدي (OXPHOS)2، وتجميع سلسلة الجهاز التنفسي، وديناميات الميتوكوندريا، ونسخ الحمض النووي الميتوكوندريا أو النسخ المتماثل3. تتأثر الأنسجة ذات متطلبات الطاقة بشكل خاص بخلل الميتوكوندريا4. وبناء على ذلك، فإن المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا عادة ما يطورون مظاهر عصبية مبكرة.

لا توجد حاليا علاجات متاحة للأطفال المصابين بأمراض الميتوكوندريا5. عائق رئيسي لتطوير المخدرات من أمراض الميتوكوندريا هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص مسار المرض البشري6. العديد من النماذج الحيوانية التي تمت دراستها حاليا لا تظهر العيوب العصبية الموجودة في المرضى7. وبالتالي ، فإن الآليات الكامنة وراء أمراض الخلايا العصبية لأمراض الميتوكوندريا لا تزال غير مفهومة تماما.

الدراسات الحديثة ولدت iPSCs من المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا واستخدمت هذه الخلايا للحصول على خلايا عصبية خاصة بالمرضى. على سبيل المثال، تم العثور على العيوب الوراثية المرتبطة بمرض الميتوكوندريا، متلازمة لي، تسبب انحرافات في الجيوجيات الحيوية الخلوية8،9، تخليق البروتين10، والكالسيوم homeostasis9،11. قدمت هذه التقارير أدلة ميكانيكية مهمة على ضعف الخلايا العصبية التي تحدث في أمراض الميتوكوندريا ، مما يمهد الطريق لاكتشاف الأدوية لهذه الأمراض المستعصية12.

الثقافات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، ومع ذلك ، لا تمكن من التحقيق في التعقيد المعماري والتنظيم الإقليمي للأجهزة ثلاثية الأبعاد13. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن استخدام الأعضاء العضوية ثلاثية الأبعاد في الدماغ المستمدة من iPSCs14 الخاصة بالمرضى قد يسمح للباحثين بالحصول على معلومات إضافية مهمة وبالتالي المساعدة في تشريح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على تطور الجهاز العصبي ووظيفته15. بدأت الدراسات التي تستخدم الأعضاء المشتقة من الدماغ iPSC للتحقيق في أمراض الميتوكوندريا في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا.

أظهرت الأجهزة العضوية في الحبل الشوكي التي تحمل طفرات مرتبطة بمرض الميتوكوندريا واعتلال الدماغ الميتوكوندريا وحمض اللاكتيك ومتلازمة الحلقات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) وجود خلل في تكوين الأعصاب وتمايز الخلايا العصبية الحركية المتأخر16. أظهرت الأجهزة العضوية القشرية المشتقة من المرضى الذين يعانون من مرض الميتوكوندريا ، متلازمة لي ، انخفاضا في الحجم ، وعيوبا في توليد البراعم الظهارية العصبية ، وفقدان العمارة القشرية17. أظهرت أعضاء الدماغ من مرضى متلازمة لي أن عيوب المرض تبدأ على مستوى خلايا السلف العصبية ، والتي لا يمكن أن تلتزم بعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، مما يسبب تفريع الخلايا العصبية الشاذة والمورفوجينيس18. وهكذا، قد تمثل السلف العصبية هدفا علاجيا خلويا لأمراض الميتوكوندريا، وقد تدعم الاستراتيجيات التي تعزز وظيفتها الميتوكوندريا التطور الوظيفي للجهاز العصبي.

قد يساعد استخدام الأعضاء العضوية في الدماغ في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا. تعتبر أمراض الميتوكوندريا بشكل رئيسي تنكس عصبي مبكر5. ومع ذلك ، توجد عيوب نمائية عصبية أيضا في المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا ، بما في ذلك تأخر النمو وضعف الإدراك19. قد تساعد الأعضاء العضوية الدماغية الخاصة بمرضى معينين في معالجة هذه الجوانب وتوضيح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على نمو الدماغ البشري. يمكن أن يلعب خلل الميتوكوندريا أيضا دورا مسببا للأمراض في الأمراض العصبية الأخرى الأكثر شيوعا ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون4. وبالتالي ، فإن توضيح تأثير عيوب الميتوكوندريا في النمو العصبي باستخدام أعضاء الدماغ قد يكون مفيدا أيضا لدراسة تلك الأمراض. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتوليد أعضاء الدماغ القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها لإجراء نمذجة الأمراض لأمراض الميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: قد يتطلب استخدام iPSCs البشرية موافقة أخلاقية. استمدت مراكز الرقابة الصحية الدولية المستخدمة في هذه الدراسة من أفراد مكافحة صحيين بعد الموافقة الأخلاقية المحلية (#2019-681). يجب أن يتم تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية العقيمة، وتطهير بعناية جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية قبل نقل تحت غطاء محرك السيارة. وينبغي أن يكون لدى مراكز زراعة الملوثات العصبية المضافة البشرية المستخدمة في التمايز رقم مرور يقل عن 50 لتجنب الانحرافات الجينومية المحتملة التي قد تحدث عند الثقافة الواسعة النطاق. يجب التحقق من صحة الحالة المتعددة القدرات للخلايا قبل توليد الجهاز ، على سبيل المثال ، من خلال مراقبة التعبير عن العلامات المرتبطة بالانفجار متعددة الخلايا مثل NANOG أو OCT4. وينبغي إجراء اختبارات الميكوبلازما أسبوعيا لضمان الثقافات الخالية من الميكوبلازما.

1. جيل من أعضاء الدماغ

  1. ثقافة iPSCs الإنسان
    1. ثقافة iPSCs الإنسان في ظل ظروف التغذية خالية في المتوسط iPSC (انظر جدول المواد) على لوحات مغلفة 6 آبار والاحتفاظ بها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: قد يعيق ترحيل الخلايا المغذية التمايز العضوي. مرور الخلايا مرة واحدة على الأقل في ظروف خالية من التغذية.
    2. مرور iPSCs في التقاء 80٪ باستخدام وسيط مفرزة خالية من الانزيم في نسب تتراوح بين 1:4 إلى 1:12. لزيادة بقاء الخلية، أضف 10 ميكرومتر بروتين مرتبط كيناز (ROCK) المثبط (Y27632) بعد كل تقسيم.
  2. فصل iPSCs (80٪ التقاء)-اليوم 0.
    1. إعداد التمايز القشري المتوسط I (CDMI) (الجدول 1). متوسط CDMI قبل الحرب في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) قبل إضافته إلى الخلايا.
    2. غسل الآبار التي تحتوي على iPSCs مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) لإزالة الخلايا الميتة والحطام.
    3. أضف 500 ميكرولتر من الكاشف A (جدول المواد) إلى كل بئر واحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق تحت المجهر لضمان انفصال الخلية.
    4. إضافة 1 مل من iPSC المتوسطة لتخفيف الكاشف A لتحييد نشاطها.
    5. استخدام ماصة 1000 ميكرولتر لتفكيك الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    6. طرد مركزي بلطف iPSCs في 125 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية).
    7. يستنشق بعناية supernatant لتجنب إزعاج بيليه الخلية.
    8. Resuspend بيليه مع 1 مل من CDMI للحصول على تعليق خلية واحدة، والعد رقم الخلية.
    9. إعداد وسيط البذر مع 9000 iPSCs لكل 100 ميكرولتر في CDMI تكملها مثبطات روك 20 ميكرومتر، 3 ميكرومتر WNT-كاتينين المثبط (IWR1)، و 5 ميكرومتر SB431542.
    10. إضافة 100 ميكرولتر من متوسط البذر لكل بئر إلى لوحة v-bottom 96-well.
    11. احتفظ باللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
  3. جيل الغلاف العصبي
    1. في اليوم الأول، لاحظ أن مجاميع الخلايا المستديرة (الخلايا العصبية) ذات الحدود الملساء المحددة تتشكل. لاحظ الخلايا الميتة حول التجميعات. الاستمرار في الثقافة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    2. في اليوم الثالث، قم بإثارة اللوحة عن طريق النقر على الجانبين ثلاث مرات لفصل الخلايا الميتة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من CDMI تكملها مع 20 μM روك المانع، 3 ميكرومتر IWR1، و 5 ميكرومتر SB431542 إلى كل بئر.
    4. أعد الطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    5. في اليوم السادس، قم بإزالة 80 ميكرولتر من الوسيط الفائق بعناية من كل بئر. تجنب لمس الجزء السفلي من البئر.
    6. إضافة 100 ميكرولتر من CDMI تكملها مع 3 μM IWR1 و 5 ميكرومتر SB431542 إلى كل بئر. أعد الطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    7. كرر الخطوتين 5 و6 كل 3 أيام حتى اليوم 18.
  4. نقل الغلاف العصبي
    1. في اليوم 18، قم بإعداد التمايز القشري المتوسط الثاني (CDMII) (الجدول 1) وإضافة 10 مل إلى لوحة ثقافة الخلايا المرفقة منخفضة للغاية مقاس 100 مم.
    2. استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع طرف قطع لنقل neurospheres الجولة من لوحة 96 جيدا إلى 100 ملم فائقة منخفضة لوحة ثقافة الخلية المرفق.
      ملاحظة: كن لطيفا لتجنب إتلاف الأعصاب عن طريق التأكد من أن فتحة الطرف واسعة بما فيه الكفاية وأن المجاميع لا يستنشق بسرعة كبيرة جدا.
    3. إزالة 5 مل من المتوسطة من لوحة تحتوي على الخلايا العصبية وإضافة 5 مل من CDMII الطازجة.
      ملاحظة: يساعد هذا الإجراء على تقليل مقدار وسيط CDMI التي قد تكون نقلت من نقل الأعصاب.
    4. ضع اللوحة على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: فحص بصريا في neurospheres في اليوم التالي. زيادة سرعة شاكر المداري إذا تم تجميعها معا أو تعلق على الجزء السفلي من لوحة.
    5. كل 3 أيام، يستنشق بعناية المتوسطة فائقة واستبدالها مع CDMII الطازجة. اترك كمية صغيرة من الوسط لمنع الغلاف العصبي من الجفاف.
    6. في اليوم 35، قم بإعداد التمايز القشري المتوسط الثالث (CDMIII) (الجدول 1).
      ملاحظة: يجب حل مكون المصفوفة في CDMIII الباردة.
    7. يستنشق المتوسط من لوحة وإضافة 10 مل من CDMIII الباردة.
      ملاحظة: هو أكثر فعالية لاستخدام المتوسطة الباردة بحيث يمكن للمكون مصفوفة معطف organoids دون تشكيل كتل.
    8. بعد تغيير الوسط، ضع اللوحة مرة أخرى على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
    9. تغيير المتوسط كل 3-5 أيام اعتمادا على معدل النمو، كما هو مبين في لون الوسط.
    10. في اليوم 70، قم بإعداد التمايز القشري المتوسط الرابع (CDMIV) (الجدول 1). استخدام CDMIV المتوسطة حتى يتم التوصل إلى العمر المطلوب من organoids. خلال هذه الفترة، احتفظ باللوحة على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة (37 درجة مئوية و5٪ CO2).
    11. تغيير المتوسط كل 3-5 أيام، اعتمادا على معدل النمو.

2. الاحتواء المناعي للأعضاء في الدماغ

  1. إعداد الأنسجة
    1. إعداد محلول paraformaldehydede (PFA) بنسبة 4٪، ووضعه تحت غطاء أمان.
      ملاحظة: ارتداء معدات السلامة الشخصية عند التعامل مع PFA.
    2. جمع organoids الدماغ ونقلها بلطف مع حادة يميل 3 مل البلاستيك باستور ماصة إلى لوحة 6-جيدا مليئة PFA.
      ملاحظة: استخدام organoids أقدم من 40 يوما للسماح التصور من الهياكل مع ارتفاع تعقيد الخلوية.
    3. الحفاظ على organoids في الحل PFA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة PFA بعناية مع ماصة باستور البلاستيك 3 مل، وغسل organoids ثابتة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
    5. تخزين organoids ثابتة في 4 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني حتى مزيد من الاستخدام.
  2. إعداد شرائح الجهازية في الدماغ
    1. إعداد محلول أجار 3٪ والحرارة ببطء حتى المسال.
    2. ضع القالب (نهاية قطع حقنة 10 مل) على قطعة من ورق التصفية الماصة (الجانب السلس لأعلى). ضع قطرة من أجار عليه.
    3. بسرعة تأخذ organoid واحد من لوحة 6-جيدا مع ملعقة وإزالة برنامج تلفزيوني المفرط مع ورقة التصفية.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم لمس organoid مباشرة مع ورقة التصفية.
    4. ضع الجهاز على قطرة أجار.
    5. كرر هذا الإجراء مع ما يصل إلى ثلاثة organoids.
      ملاحظة: العمل بسرعة لتجنب تجسيد أجار أثناء هذه الخطوة.
    6. إعادة ملء القالب مع أجار حتى يتم تغطية جميع organoids بالكامل.
    7. انتظر حتى يبدأ أجار لترسيخ، ومن ثم نقل بلطف القالب بأكمله الذي يحتوي على organoids، بما في ذلك ورقة تصفية ماصة، على عنصر التبريد.
      ملاحظة: إذا لم يكن عنصر التبريد متوفرا، قم بتخزين الأجهزة العضوية لبضع دقائق في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    8. في غضون ذلك، والاستعداد لإجراء تشريح: وضع شفرة حلاقة (تنظيفها مع الأسيتون وغسلها بالماء المقطر المزدوج) في حامل الهزاز، وجبل على الحمام، وملئه مع برنامج تلفزيوني.
    9. إزالة القالب من أجار (صلبة) واستخدام مشرط لتقليم لتشكيل مكعب.
    10. إرفاق مكعب أجار التي تحتوي على organoids على لوحة الناقل من الهزاز مع هلام لاصقة (انظر جدول المواد)، ووضعه في الحمام الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني.
    11. ضبط الهزاز (انظر جدول المواد) لقطع شرائح في سمك 150 ميكرومتر.
      ملاحظة: قد تكون إعدادات الهزاز (الزاوية المناسبة والسعة والتردد وسرعة النصل) مشابهة لتلك المستخدمة في تقطيع أنسجة الدماغ الثابتة المشتقة من الحيوانات المبكرة بعد الولادة. ومع ذلك ، فإن الإعدادات المثالية تعتمد بشدة على نوع الهزاز ويجب تحديدها في خطوة أولى لمنع تشويه أو حتى تمزيق الأنسجة أثناء القطع.
    12. بدء إجراء القطع. استخدام ماصة زجاجية أو ملعقة لنقل بلطف كل شريحة قطع الطازجة في لوحة 24 جيدا مليئة برنامج تلفزيوني.
    13. تخزين لوحة تحتوي على شرائح في 4 درجة مئوية (لمدة تصل إلى بضعة أيام) حتى مزيد من المعالجة.
    14. نقل شرائح من لوحة مع ماصة زجاجية أو ملعقة على الشرائح المجهر. استخدم شريحة 2 كحد أدنى لكل شريحة.
    15. إزالة بعناية أجار وبرنامج تلفزيوني الزائدة مع حقنة.
    16. السماح للشرائح لتجف حتى تلتزم الشرائح.
      ملاحظة: في حين يمكن تخزين شرائح المجهر في غرف بلاستيكية مليئة برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية، ينبغي أن تكون ملطخة في أقرب وقت ممكن بعد إجراء تشريح.
  3. تلطيخ الهسطو الكيميائي المناعي
    1. إعداد حل الحظر (الجدول 1).
    2. استخدم قلم PAP لرسم حدود مسعورة حول الشرائح على الشريحة للمساعدة في الحفاظ على جميع الحلول على الشرائح.
    3. أضف بعناية محلول الحجب على الشريحة، واحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية). لتجنب تدمير الأنسجة، لا تقم بإضافة الحل مباشرة على رأس الشرائح.
    4. يستنشق حل الحجب وتطبيق الأجسام المضادة الأولية المطلوبة المخففة في حل الحجب.
    5. احتضان الشريحة بين عشية وضحاها في غرفة رطبة في 4 درجة مئوية.
    6. شطف الشريحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    7. احتضان شرائح مع الأجسام المضادة الثانوية محددة مخففة في حل حجب وأداء تلطيخ Hoechst (1:2,500) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      ملاحظة: تذكر لتنفيذ عناصر تحكم سالبة للتأكد من وجود أي ربط غير محددة أو التلقائي-fluorescence.
    8. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 10 دقيقة لكل منهما في الظلام.
    9. إضافة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة إلى شريحة، ووضع غطاء على حافة قطرة، ووضع ببطء coverslip أسفل نحو شريحة لتجنب فقاعات الهواء.
    10. السماح للشريحة للراحة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تطبيق طلاء الأظافر على حدود غطاء لمزيد من ختم الشريحة. للتخزين طويل الأجل، يخزن عند 4 درجات مئوية.
  4. توثيق التلطيخ
    1. لمسح الصور الكبيرة للخياطة، استخدم مجهرا عريض المجال مزودا بمحرك (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل) هدفا عالي الجودة؛ مجموعة مرشح DAPI (على سبيل المثال، الإثارة (EX): 340-380 نانومتر، مرآة ديكهروي (DM): 400 نانومتر، مرشح حاجز (BA): 435-485 نانومتر)؛ مجموعة مرشحات الفلورسين ايزوثيوسيانات (على سبيل المثال، EX: 465-495 نانومتر، DM: 505 نانومتر، BA: 515-555 نانومتر)؛ مجموعة مرشحات Alexa594 (على سبيل المثال، ET 575/40؛ T 600 LPXR; HC 623/24)؛ كاميرا رقمية؛ برامج اقتناء عالية الأداء تسمح للغرز الآلي وعمليات المكدس.
    2. للتعامل مع الصور، استخدم برنامج معالجة الصور القادر على إنشاء ملفات tif 8 بت، وزراعة الغرز، وضبط التباين والسطوع، ودمج القنوات (مثل الأزرق والأخضر والأحمر)، وإضافة أشرطة المقياس.
    3. لمسح التفاصيل، استخدم مجهر مسح ليزر كونفوجال مزود بهدف عالي الجودة، ليزر الأشعة فوق البنفسجية (EX: 408 نانومتر)، ليزر الأرجون (EX: 488 نانومتر)، ليزر هيليوم نيون (EX: 543)، برنامج تصوير لمجهر كونفوجال.
    4. للتعامل مع الصور من التفاصيل، استخدم برنامج معالجة الصور قادرة على توليد إسقاطات أقصى كثافة من confocal z-stacks (على سبيل المثال، المقاطع البصرية من 0.6 ميكرومتر لكل منهما)، وتوليد 8 بت tif-files، وضبط التباين والسطوع، ودمج القنوات (على سبيل المثال، الأزرق والأخضر والأحمر)، إضافة أشرطة مقياس.
    5. استخدم محرر رسومي لترتيب الأرقام.

3. التنميط الحيوي للأعضاء في الدماغ

  1. إعداد الأجهزة العضوية للتنميط الحيوي
    1. إعداد الحل papain و DNase باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. نقل 3-5 organoids إلى لوحة 6-جيدا. غسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل الحرب.
    3. إضافة 2 مل من محلول الباباين المنشط قبل الحرب الذي يحتوي على DNase. باستخدام شفرة، وقطع organoids إلى قطع صغيرة.
    4. ضع اللوحة على شاكر مداري تم ضبطه على 27 دورة في الدقيقة داخل حاضنة ثقافة الخلية (عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2)، واحتضن لمدة 15-20 دقيقة.
      ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على مرحلة العضيات. يمكن استخدام الأجهزة العضوية في المراحل المبكرة كما هي. بالنسبة للأعضاء التي يزيد عمرها عن 3 أشهر ، يوصى بقطع الأعضاء العضوية إلى 2-3 قطع قبل الانفصال واحتضان القطع بسرعة هزازة محددة في 27 دورة في الدقيقة لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في إزالة الأنسجة النخرية التي قد تكون موجودة في الأجهزة العضوية في مرحلة لاحقة.
    5. جمع الأنسجة المهضومة في أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من CDMIV الثقافة العضوية المتوسطة (الجدول 1).
    6. تريتورات النسيج مع ماصة بلاستيكية 10 مل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10-15 مرات. دع الأنسجة غير المرتبطة تستقر في أسفل الأنبوب.
    7. نقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب 15 مل، وتجنب أي قطعة من الأنسجة غير المرتبطة. تصفية الحل من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (على سبيل المثال، أنابيب البوليسترين المستديرة القاع مع قبعات مصفاة الخلية).
    8. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. تقييم عدد الخلية وجودتها باستخدام تريبان الأزرق.
    10. لوحة العدد المطلوب (~ 20،000/ جيدا) من الخلايا على لوحات صغيرة المغلفة 96 جيدا. تغيير متوسط 6-8 ساعة بعد الطلاء إلى متوسط العصبية (الجدول 1).
    11. احتضان اللوحة الصغيرة المغلفة 96 جيدا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لمدة 4 أيام.
  2. التنميط الحيوي
    1. في اليوم الثالث بعد إعادة تجزؤ الخلايا المنفصلة، أضف 200 ميكرولتر من محلول المعايرة إلى كل بئر من الجزء السفلي من اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا، وضع خرطوشة الاستشعار الخضراء العلوية على اللوحة الدقيقة المائية.
      ملاحظة: ضع خرطوشة المستشعر أعلى اللوحة الدقيقة في الاتجاه الصحيح وتأكد من أن حل الخرف يغطي جميع أجهزة الاستشعار.
    2. احتضان اللوح الدقيق المرطب 96 جيدا في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. قم بتشغيل المحلل للسماح للأداة بالاستقرار عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. في اليوم الرابع بعد إعادة الصياغة، تفقد ثقافة الجهازية المفككة على اللوحة الدقيقة ذات 96 بئرا تحت المجهر لضمان ظهور الخلايا كطاهر أحادي التقاء.
    5. إعداد متوسطة المقايسة (الجدول 1).
    6. إزالة الخلايا العصبية المتوسطة من جميع الآبار مع ماصة دون لمس الجزء السفلي من البئر لمنع تلف الخلايا. بدلا من ذلك، عكس بعناية لوحة كاملة ومن ثم تجفيفها على ورق نظيف. العمل بسرعة لتجنب موت الخلايا.
    7. غسل الخلايا مرتين مع prewarmed 200 ميكرولتر من متوسطة اساي. أضف Assay Medium إلى حجم نهائي قدره 180 ميكرولتر لكل بئر. احتضان اللوحة الدقيقة ذات ال96 بئرا في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    8. إعداد حلول 10 ميكرومتر من مثبطات الميتوكوندريا في متوسطة المقايسة. لاحظ أن التركيز النهائي بعد الحقن هو 1 ميكرومتر.
    9. قم بتحميل خرطوشة الاستشعار الموضوعة في اللوحة الدقيقة المائية باستخدام حلول 10x لمثبطات الميتوكوندريا.
      1. إضافة 18 ميكرولتر من مثبطات الميتوكوندريا 1 في المنفذ A.
      2. إضافة 19.8 ميكرولتر من مثبطات الميتوكوندريا 2 في المنفذ B.
      3. إضافة 21.6 ميكرولتر من مثبطات الميتوكوندريا 2 في الميناء C.
      4. إضافة 23.4 ميكرولتر من مثبطات الميتوكوندريا 3 في الميناء D.
    10. ضع الخرطوشة المحملة في اللوح الصغير المرطب في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية حتى بداية الفحص.
    11. إعداد بروتوكول قيد التشغيل في برنامج الجهاز (الجدول 2).
    12. اضغط على START. خذ الخرطوشة المحملة من حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير وضعها في المحلل للمعايرة.
      ملاحظة: تأكد من إدراج اللوحة في الاتجاه الصحيح وبدون الغطاء.
    13. بمجرد انتهاء خطوة المعايرة، قم بإزالة لوحة المعايرة. خذ اللوحة الدقيقة ذات ال 96 بئرا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير وضعها في المحلل. انقر على متابعة لبدء القياسات.
    14. عند الانتهاء من تشغيل، وإزالة microplate ثقافة الخلية 96 جيدا من محلل وجمع المتوسطة من جميع الآبار دون إزعاج الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسيط عند -20 درجة مئوية واستخدامه لاحقا لقياس كمية اللاكتات التي تطلقها الخلايا في الوسط باستخدام مجموعة أجهزة قياس اللاكتات المناسبة.
    15. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x في كل بئر.
    16. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، تجميد لوحة في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام الصفيحة المجمدة لتحديد الخلايا أو البروتينات أو الحمض النووي في كل بئر من اللوحة الدقيقة. وستكون هناك حاجة إلى هذا التحديد الكمي لتطبيع معدلات الطاقة الحيوية التي تم الحصول عليها. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للخلايا أو البروتين أو مقايسات تحديد الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول الموصوف هنا يسهل توليد قوي من organoids الجولة (الشكل 1A). تحتوي الأجهزة العضوية المتولدة على خلايا عصبية ناضجة يمكن تصورها باستخدام علامات البروتين المحددة للمكونات (SMI312) والتشعبات (البروتين المرتبط بالميكروتبول 2 (MAP2)) (الشكل 1B).) لا تحتوي الأجهزة العضوية الناضجة على خلايا عصبية فقط (MAP2-positive) ولكن أيضا على خلايا جلوية (على سبيل المثال ، إيجابية لعلامة الخلايا الفلكية S100 بروتين ملزم للك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه الورقة الجيل القابل للاستنساخ من الأعضاء العضوية البشرية المشتقة من الدماغ iPSC واستخدامها لنمذجة أمراض الميتوكوندريا. يتم تعديل البروتوكول الموضح هنا استنادا إلى work20 المنشورة مسبقا. وإحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يتطلب التضمين اليدوي لكل عضو عضوي في مصفوفة سقالات. في الواقع ، يتم حل حل المصفوفة ببساطة في وسط ثقافة الخلية. وعلاوة على ذلك، ليست هناك حاجة لتوظيف المفاعلات الحيوية باهظة الثمن، كما يمكن زراعة الأجهزة العضوية في زراعة الأنسجة القياسية 6-لوحات جيدا وضعه على ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية أو غير مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر ميريام بونينج على الدعم الفني. نعترف بالدعم المقدم من دويتشه فوردشونجسجيمينشافت (DFG) (PR1527/5-1 إلى A.P.) وS spark ومعهد برلين للصحة (BIH) (صناديق التحقق من صحة BIH إلى A.P.) ، ويونايتد مؤسسة أمراض الميتوكوندريا (UMDF) (منحة الاتحاد الدولي لمتلازمة لي ل A.P.)، مستشفى دوسلدورف الجامعي (Forschungskommission UKD إلى A.P.)، ووزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) (e: بيو الشباب المحقق منح AZ 031L0211 إلى A.P.). تم دعم العمل في مختبر C.R.R. من قبل DFG (FOR 2795 "نقاط الاشتباك العصبي تحت الضغط"، Ro 2327/13-1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-mercaptoethanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (أوروبا) المحدودةبرنامج التخطيط ؛ محرر الرسومات المتجهات
Alexa Fluor 488 حمار مضاد لخنزير غينياSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 حمار مضاد للفأرThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-& beta Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781: 2000
Argon LaserMelles Griotأي ليزر آخر ، على سبيل المثال ، ليزر الصمام الثنائي الذي ينبعث منه 488 جيد ، أيضا
حمض الأسكوربيكSigmaA92902
B-27 مع فيتامين أجيبكو17504044
باكتو أجاربيكتون ديكنسون3٪ في PBS ، محلول التخزين عند -20 درجة ؛ C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
خلية ستار ثقافة الخلايا 6 لوحة بئرGreiner-Bio-One657160
تركيز الدهونGibco11905031
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر C1حلولوحدات مجهر متحد البؤر نظام
مصفوفة غشاء القاعدة Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) ،مصفوفةCorning356231
CyQUANT Cell Cell Proliferation AssayKit Thermo FisherC7026
DMEM / F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
الحمار المضاد للماعز Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
الحمار المضاد للفأر Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
الحمار المضاد للأرانب Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc كاميرانيكون المجهر Eclipse
90i مجهرنيكون حلول
Eclipse E 600FN مجهر مستقيمنيكون حلول
المجهر المقلوب Eclipse Ts2مقلوب نيكون Microsope Solutions
EZ-C1 الإصدار الفضي 3.91المجهر نيكونبرنامج التصوير للمجهر متحد البؤر
FCCPSigma Aldrich370-86-5
مصل الأبقار الجنينيGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
ماصة باستورزجاجية العلامة التجارية747715مقلوب
GlutamaxGibco35050-061
ليزر الهيليوم النيونMelles Griotكل ليزر آخر ، على سبيل المثال ، ليزر الصمام الثنائي الذي ينبعث منه 594 جيد، أيضا
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2< / sub> حاضنةThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cبرنامج معالجة الصور المعهد الوطني للصحة
Injekt Solo 10 مل / LuerBraun4606108V
Knockout Serum ReplacementGibco10828010
Laser (407 nm)متماسكأي ليزر آخر ، على سبيل المثال ، ليزر الصمام الثنائي الذي ينبعث منه 407 جيد ، أيضا
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041: 1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR Plusتقنية الخلايا الجذعية85850iPSC المتوسطة
Multifuge X3R الطرد المركزيالحراري العلمي10325804
MycoAlert طقم الكشف عن الميكوبلازماLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
إبرة للاستخدام الفردي (23G x 1 " TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2Nikon Imaging
Software Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAلرسم حاجز مسعور على الشرائح.
طقم نظام تفكك غراءورثينجتونLK003150
بارافورمالدهايدميرك8187154٪ في PBS ، حل المتجر عند -20 درجة ؛ C
ماصة باستور 7 مل VWR612-1681متدرجة حتى 3 مل
بنسلين ستربتومايسينجيبكو15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 الهواء DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope Solutionsالخطة الموضوعية
Apo VC 60x / 1.40 زيت DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13مجهرنيكونمطهر غمر الزيت موضوعي
البوليسترين بتري (100 مم)Greiner Bio-One664161
البوليسترين أنبوب دائري القاع مع غطاء مصفاة الخلية (5 مل)فالكون352235
كلوريد البوتاسيومروث6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
ترشيح نوعيVWR516-0813
مثبط الصخورMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100 & beta ؛AbcamAb111781:600
SB-431542شركة كايمان للكيماويات13031
شفرات مشرطهاينز هيرنز هامبورك1110918
SMI312Biolegend8379041:500
بيكربونات الصوديومميرك / سيجما31437-1 كجم - M
كلوريد الصوديومروث3957
الصوديوم فوسفات ثنائي الهيدروجينApplichem131965
بيروفات الصوديومGibco11360070
SOX2سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-173201:100
كاشف تفكك الخلايا AccutaseStemPro جيبكو / StemProكاشفA1110501 جل
الغراء الفائقUHU63261جل لاصق
SuperFrost PlusVWR631-0108
حقنة للاستخدام الفردي (1 مل)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Plate 24 WellSarstedt83.3922
TC Plate 6 WellSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
غطاءلزراعة الأنسجةThermoFisher51032711
TOM20سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-114151: 200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProduction تم إنهاؤه ، أي ميكروتوم آخر قابل للتعديل جيد أيضا.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck / Sigma28418852
Wnt Antagonist IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 محلل التدفق خارج الخليةSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM متوسطفرس البحر Bioscience103680-100
XF Caliberrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96 بئر ميكروبلاي)Seahorse Bioscience102416-100
المحدد كيميائيا مجهر نيكون مكون الخالي من Phenol Red ، وخالي من LDEV واسع النطاق مجهر حلول واين راسباند حلول ورق

المراجع

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية البشرية المحفزة وافرة القدرةتوليد العضوانياتالتمايز القشريتكوين الكرات العصبيةالتنميط الحيوي للطاقةالتصوير البؤريمعدل استهلاك الأكسجينالاستقلاب الميتوكوندري
جيل من الأعضاء الدماغ البشري لنمذجة مرض الميتوكوندريا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.