مقالة منهجية

التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

DOI:

10.3791/62757

⸱

يناير 5, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم نهج هنا للتصوير داخل الحيوية على المدى الطويل باستخدام نوافذ سيليكون واضحة بصريا يمكن لصقها مباشرة على الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد. هذه النوافذ أرخص وأكثر تنوعا من غيرها المستخدمة حاليا في هذا المجال ، ويسبب الإدخال الجراحي التهابا محدودا وضيقا للحيوانات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) تصور حركة الخلية وانقسامها وموتها بدقة خلية واحدة. IVM من خلال نوافذ التصوير التي يتم إدخالها جراحيا قوية بشكل خاص لأنها تسمح بالمراقبة الطولية لنفس الأنسجة على مدار أيام إلى أسابيع. تشتمل نوافذ التصوير النموذجية على غطاء زجاجي في إطار معدني متوافق حيويا يتم خياطته على جلد الماوس. يمكن أن تتداخل هذه النوافذ مع الحركة الحرة للفئران ، وتثير استجابة التهابية قوية ، وتفشل بسبب الزجاج المكسور أو الغرز الممزقة ، والتي قد يتطلب أي منها القتل الرحيم. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير نوافذ لتصوير أعضاء البطن والغدة الثديية على المدى الطويل من فيلم رقيق من polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون شفاف بصريا كان يستخدم سابقا لنوافذ التصوير في الجمجمة. يمكن لصق هذه النوافذ مباشرة على الأنسجة ، مما يقلل من الوقت اللازم للإدخال. يتميز نظام PDMS بالمرونة ، مما يساهم في متانته في الفئران بمرور الوقت - تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما. التصوير الطولي هو تصوير لنفس منطقة الأنسجة خلال جلسات منفصلة. تم تضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النوافذ لتوطين نفس المنطقة ، مما يسمح بتصور العمليات الديناميكية (مثل التفاف الغدة الثديية) في نفس المواقع ، بفارق أيام. سمحت نافذة السيليكون هذه أيضا بمراقبة الخلايا السرطانية المنتشرة المفردة التي تتطور إلى نقائل صغيرة بمرور الوقت. نوافذ السيليكون المستخدمة في هذه الدراسة أبسط في الإدخال من النوافذ الزجاجية ذات الإطار المعدني وتسبب التهابا محدودا في الأنسجة المصورة. علاوة على ذلك ، تسمح الشبكات المدمجة بالتتبع المباشر لنفس منطقة الأنسجة في جلسات التصوير المتكررة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) ، وهو تصوير الأنسجة في الحيوانات المخدرة ، نظرة ثاقبة على ديناميكيات الأحداث الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية في الأنسجة السليمة. تختلف تطبيقات هذه التقنية على نطاق واسع ، ولكن IVM كان له دور فعال في مجال بيولوجيا السرطان للمساعدة في توضيح كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة وانتشارها ، والتفاعل مع البيئة الدقيقة المحيطة ، والاستجابة للأدوية1،2،3. بالإضافة إلى ذلك ، كان IVM مفتاحا لتعزيز فهم الآليات المعقدة التي تحكم الاستجابات المناعية من خلال توفير رؤى مكملة لنهج التنميط خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي). على سبيل المثال ، كشفت تجارب التصوير داخل الحيوية عن تفاصيل حول وظائف المناعة من حيث صلتها بهجرة الخلايا والاتصال الخلوي الخلوي وقدمت منصة لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية استجابة للإصابة أو العدوى4،5،6،7. يمكن أيضا دراسة العديد من هذه العمليات من خلال التلطيخ النسيجي ، ولكن IVM فقط يسمح بتتبع التغييرات الديناميكية. في الواقع ، في حين أن القسم النسيجي يقدم لقطة للأنسجة في وقت معين ، يمكن للتصوير داخل الحيوية تتبع الأحداث بين الخلايا وتحت الخلايا داخل نفس النسيج بمرور الوقت. على وجه الخصوص ، سمح التقدم في وضع العلامات الفلورية وتطوير المراسلين الجزيئيين بربط الأحداث الجزيئية بالسلوكيات الخلوية ، مثل الانتشار والموت والحركة والتفاعل مع الخلايا الأخرى أو المصفوفة خارج الخلية. تعتمد معظم تقنيات IVM على الفحص المجهري الفلوري ، والذي بسبب تشتت الضوء ، يجعل تصوير الأنسجة العميقة أمرا صعبا. لذلك ، غالبا ما تحتاج الأنسجة المثيرة للاهتمام إلى التعرض جراحيا من خلال إجراء جراحي ونهائي في كثير من الأحيان. وبالتالي ، اعتمادا على موقع العضو ، يمكن تصوير الأنسجة بشكل مستمر لفترة تتراوح من عدد قليل إلى 40 ساعة8. بدلا من ذلك ، يسمح الإدخال الجراحي لنافذة تصوير دائمة بتصوير نفس الأنسجة بالتتابع على مدى فترة من الأيام إلى الأسابيع 7,9.

تم تسليط الضوء على تطوير نوافذ تصوير جديدة كحاجة تكنولوجية لزيادة تحسين أساليب التصوير داخل الحيوية10. نافذة التصوير النموذجية داخل الحيوية هي حلقة معدنية تحتوي على غطاء زجاجي مثبت على الجلد باستخدام خيوط11. التداخل مع حرية الحركة ، وتراكم الإفرازات ، وتلف الغطاء الزجاجي هي مشاكل شائعة شوهدت مع استخدام هذه النوافذ. علاوة على ذلك ، تتطلب النافذة النموذجية إنتاجا متخصصا ، ويمكن أن يتطلب الإجراء الجراحي تدريبا مكثفا. لمعالجة هذه القضايا ، تم تكييف polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون ، والذي تم استخدامه سابقا في نوافذ الجمجمة للتصوير طويل الأجل في الدماغ12 ، للاستخدام في تصوير أعضاء البطن والغدة الثديية. هنا ، يتم تقديم طريقة مفصلة لتوليد نوافذ السيليكون القائمة على PDMS ، بما في ذلك كيفية إلقاء النافذة حول شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتم وصف إجراء جراحي بسيط وخالي من الغرز لإدخال النافذة فوق أعضاء البطن أو الغدة الثديية. يتغلب هذا النهج الجديد على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا ويزيد من إمكانية الوصول إلى التصوير الطولي داخل الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية الجراحية لمختبر كولد سبرينج هاربور وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مختبر كولد سبرينج هاربور.

1. صب نافذة السيليكون

  1. تحضير بوليمر السيليكون (PDMS) عن طريق خلط المطاط الصناعي الأساسي وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 (v / v).
  2. قم بصب نافذة عن طريق إيداع كمية صغيرة من PDMS على سطح معقم وأملس وضبط نسبة الحجم إلى المساحة إلى السماكة المطلوبة.
    ملاحظة: يؤدي استخدام 200 ملغ من محلول البوليمر لدائرة قطرها 22 مم على غطاء غطاء 24 صفيحة جيدة إلى حل وسط جيد بين متانة النافذة والوضوح البصري.
  3. اختياري: لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة، اضغط برفق على شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ في السيليكون بعد أن يكون PDMS على سطح الصب المطلوب.
  4. لإزالة فقاعات الهواء ، ضع السطح المطلي في مجفف فراغ لمدة 45 دقيقة لإزالة غاز البوليمر.
  5. عالج نوافذ السيليكون في فرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  6. سجل البوليمر عند حواف القالب وقشر النوافذ المعالجة بلطف من السطح المستخدم في الصب باستخدام الملقط.
  7. قبل الجراحة ، قم بتعقيم النوافذ عن طريق التعقيم.

2. إعداد الماوس لإدخال نافذة السيليكون

  1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane. حرك الماوس إلى وسادة الاحترار على الطاولة الجراحية ، وضع الماوس في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ للصيانة طوال الجراحة.
  2. تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أصابع القدم من الأطراف الخلفية. لا تتابع حتى يصبح الماوس غير نشط ولا يظهر استجابة منعكسة لقرصة إصبع القدم.
  3. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
  4. إدارة التسكين الوقائي (البوبرينورفين 0.05 ملغم / كغ) تحت الجلد.
  5. حلق الموقع الجراحي وإزالة الشعر تماما باستخدام كريم إزالة الشعر.
  6. تطبيق محلول البوفيدون اليود (10٪ v / v) والإيثانول (70٪ v / v) على التوالي 3x لمنع عدوى الموقع الجراحي.

3. إدخال نافذة بطنية للتصوير في الكبد ؛ قابلة للتكيف مع أعضاء البطن الأخرى (الشكل 1)

  1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
  2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من 3 مم لأسفل من عملية الخناق باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة قسم 1-1.5 سم2 من الجلد على طول خط الوسط.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. اختياري: لتصور جزء أكبر من الكبد، استخدم مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم لدفع الكبد لأسفل من الحجاب الحاجز الذي يكشف عن الرباط المنجلي الذي يربط الكبد بالحجاب الحاجز. اقطع الرباط مع الحرص على عدم قطع الوريد الأجوف السفلي.
  6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها. تخلق هذه المادة اللاصقة ختما دائريا ، تاركة المنطقة المركزية سليمة للتصوير.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة. ليس من الضروري تجفيف الأنسجة قبل تطبيق المادة اللاصقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
  7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
  11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
    تنبيه: إذا تم تنفيذ الإجراء باستخدام تقنيات جراحية معقمة وتم تعقيم النافذة قبل الإدخال ، فإن إغلاق الجرح بمادة لاصقة جراحية يكفي لتجنب العدوى. ومع ذلك ، فإن الفشل في اتباع تقنيات التعقيم المناسبة أثناء الإدخال الجراحي أو الإغلاق غير الكامل يمكن أن يؤدي إلى عدوى علنية أو تحت السريرية وتجفيف الأنسجة.

4. إدخال نافذة جانبية للتصوير في الكبد ؛ متوافقة مع الحقن المتزامن للخلايا السرطانية في الوريد البابي (الشكل 2)

  1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
  2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة 1 سم2 قسم من الجلد.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
  6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  7. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  9. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
  10. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
  11. إذا كانت هناك حاجة إلى حقن الوريد البابي:
    1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
    2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من عملية الخناق في الجلد.
    3. باستخدام زوج ثان من المقص المعقم والملقط ، قم بعمل شق 10 مم في الصفاق.
    4. اغمس مسحتين من القطن في محلول ملحي معقم.
    5. استخدم مسحات القطن لسحب الأمعاء بلطف إلى شاش معقم مبلل بمحلول ملحي معقم ، مع الحرص على عدم التواء الاتجاه أو إزعاجه بطريقة أخرى.
    6. استمر في إزاحة الأمعاء من تجويف البطن حتى يصبح الوريد البابي مرئيا على الجانب الأيمن من البطن.
    7. أدخل إبرة 31-33 جم ذيلية 5-7 مم إلى نقطة دخول الوريد البابي إلى الكبد ، مع التأكد من المضي قدما داخل الوعاء الدموي وليس من خلاله.
    8. حقن الخلايا السرطانية ببطء (أعيد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة).
      ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، يمكن استزراع خط خلايا سرطان البنكرياس الامورين (على سبيل المثال ، KPC-BL/6-1199) في وسائط DMEM كاملة وخلايا 1 × 105 يتم حقنها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة.
    9. لمنع النزيف ، مباشرة بعد سحب الإبرة ، ضع ضغطا لطيفا على موقع الحقن بقطعة صغيرة من الإسفنج الجراحي لمدة 1-2 دقيقة.
    10. بعد تحرير الضغط ، راقب الموقع لمدة 1-2 دقيقة لضمان الإرقاء.
    11. باستخدام مسحات القطن المبللة ، أعد الأمعاء إلى تجويف البطن بعد التوجه الفسيولوجي للعضو.
    12. باستخدام ملقط معقم ، أدخل النافذة مباشرة تحت الصفاق ، على الجانب الأيسر من تجويف البطن للماوس.
    13. خياطة مع 4-0 خيوط الحرير وتدبيس شق خط الوسط مع مشابك الجرح 7 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    14. حرك الماوس إلى موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
    15. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم تحت القوس الساحلي من خلال الجلد باستخدام مقص وملقط معقم.
    16. إزالة قسم 1 سم2 من الجلد حول الشق.
    17. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
    18. اسحب النافذة إلى مكانها فوق الكبد قبل لصقها في مكانها ، كما هو موضح في الخطوات 4.8-4.10.

5. إدخال نافذة للتصوير في البنكرياس (الشكل 3)

  1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيمن.
  2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيسر 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة قسم 1 سم2 من الجلد حول الشق.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
  5. باستخدام مسحات قطنية معقمة غارقة في محلول ملحي معقم ، اسحب الطحال بلطف لتصور البنكرياس. انتقل إلى إعادة وضع البنكرياس باستخدام مسحات القطن المبللة لجعل مساحة السطح مرئية من خلال الشق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن حقن خلايا سرطان البنكرياس عن طريق تقويم العظام في البنكرياس إذا كان جزءا من التصميم التجريبي.
  6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح البنكرياس حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
  7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على البنكرياس حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
  8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
  9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
  10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة البنكرياس مرئية الآن من خلال النافذة.
  11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

6. إدخال نافذة للتصوير في الغدة الثديية (الشكل 4)

  1. ضع الماوس على وضع الاستلقاء.
  2. اصنعي شقا إنسيابيا بمقدار 10 مم لإحدى الحلمات الإربية باستخدام مقص وملقط معقمين.
  3. إزالة 0.5 سم2 جزء من الجلد فوق الغدة الثديية.
  4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم لفصل الغدة الثديية بعناية عن الجلد عن طريق نشر المقص بين السطحين لتعطيل الالتصاق.
    ملاحظة: لتسهيل تصوير منطقة الغدة الثديية الأربية، احرصي على تشريح جزء من الجلد فوق الغدة الثديية ولكن متفوقا على الساق الخلفية، بحيث لا تحد النافذة من حركة الماوس.
  5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الغدة الثديية حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
    تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
  6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام ضد الغدة الثديية حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
    ملاحظة: يجب أن تكون المنطقة الدائرية من أنسجة الغدة الثديية مرئية الآن من خلال النافذة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
  7. أضعاف حواف النافذة تحت الجلد.
  8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الجلد. اضغط لأسفل على الجلد باستخدام الملقط لتثبيت الجلد على النافذة.
  9. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

7. التعافي بعد الجراحة

  1. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف مع مواد تعشيش وافرة ، مما يضمن أن جزءا من القفص يستريح على وسادة تدفئة.
  2. راقب الماوس باستمرار حتى يصبح واعيا ومتحركا.
  3. إذا لزم الأمر ، قدم جرعة إضافية من المسكن 12 ساعة بعد الجرعة الوقائية.
    ملاحظة: التسكين الإضافي غير ضروري بشكل عام ، ولكن استشر الطبيب البيطري إذا أظهر الفأر علامات الضيق (مثل الظهر المنحني أو الفراء غير المهذب أو فقد الاهتمام بالطعام). راقب الفأر يوميا لأول 3 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات العدوى أو الآثار الضارة الأخرى. أقل من 2٪ من الفئران تتطلب عناية بيطرية أو القتل الرحيم ، وعادة ما يكون ذلك بسبب الانفصال الجزئي للنافذة. من المهم ملاحظة أنه بالنسبة للفئران الذكور التي لديها نوافذ تصوير الكبد البطني ، يمكن أن يؤدي القتال بين الفئران إلى انفصال النوافذ. يتم تجنب ذلك عن طريق إيواء الفئران بشكل منفصل.

8. التصوير من خلال النافذة

  1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane.
  2. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
  3. حرك الماوس من غرفة الحث إلى مرحلة المجهر. ضع الفأرة في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى حوالي 1-1.5٪ لتخدير الصيانة طوال عملية التصوير.
  4. ضع مستشعر وسادة الضغط أسفل الماوس لمراقبة معدل التنفس وتثبيت الماوس على المسرح باستخدام شريط جراحي ناعم.
  5. أدخل ميزان حرارة مستقيمي لمراقبة درجة حرارة الجسم طوال جلسة التصوير.
  6. قم بتشغيل الوسادة المسخنة ، وراقب الماوس عن كثب للتأكد من أن درجة حرارة الجسم لا تتجاوز 37 درجة مئوية.
  7. استخدم البرنامج لمراقبة معدل تنفس الماوس. المعدل الأمثل هو ~ 1 التنفس / الثانية. اضبط التخدير كما هو مطلوب.
  8. قبل كل جلسة تصوير، نظف النافذة من أي وسط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسحها بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).
  9. عند استخدام عدسة الغمر بالماء ، ضع هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة ، وتجنب الفقاعات.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الماء المقطر ولكن قد يتطلب إعادة تطبيقه أثناء التصوير.
  10. للعثور على العمق الأمثل للتصوير ، أولا ، حدد موقع الشبكة ووضعها في التركيز البؤري.
  11. حدد عمق تصوير الأنسجة التقريبي عن طريق تعيين الجزء السفلي من الشبكة إلى 0. هذه المعلومات ضرورية لتحديد موقع المستوى z المقابل في جلسات التصوير اللاحقة.
  12. لتحديد نفس الموقع عبر جلسات تصوير متعددة، استخدم المربعات الموجودة على الشبكة كنقطة مرجعية. أثناء التصوير ، لاحظ اتجاه الشبكة والموقع داخل شبكة كل مجال رؤية تم تصويره (على سبيل المثال ، الصف 2الثاني من الأعلى، المربع 4 من اليسار).
  13. أثناء جلسات التصوير المتتالية، استخدم الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة - وبالتالي حقول التصوير.
  14. بعد كل جلسة تصوير، قم بإزالة أي وسيط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسح النافذة بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام التصوير داخل الحيوية من خلال نوافذ التصوير لمراقبة وتتبع وتحديد مجموعة واسعة من الأحداث الخلوية والجزيئية بدقة خلية واحدة على مدى فترة من ساعات إلى أسابيع. وتشمل الميزات المثالية لنافذة التصوير ما يلي: (أ) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا ب) المتانة؛ ج) بساطة الإدراج ؛ د) معالم واضحة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد نوافذ التصوير داخل الحيوية أدوات مهمة للتصور المباشر للعمليات الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية أثناء تكشفها بمرور الوقت. يتغلب الإجراء الجديد الموصوف لصب وإدخال نوافذ تصوير مرنة من السيليكون في الفئران على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا (الإفرازات والكسر والتداخل مع التنقل العادي) ، ويوفر أمانا إضافيا للماوس ، ويزيد من إمكانية الوصول إلى هذه التقنية.

تتكون نوافذ التصوير الأكثر استخداما على نطاق واسع من إطار معدني يحمل غطاء زجاجي. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. هو عضو في المجلس الاستشاري البحثي لشركة brensocatib لشركة Insmed، Inc. ؛ عضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Vividion Therapeutics, Inc.؛ مستشار لشركة Protalix, Inc.; وتمتلك أسهما في شركة أجيوس للأدوية، وشركة D.A.T. هي المؤسس المشارك لشركة Mestag Therapeutics، وهي عضو في المجلس الاستشاري العلمي وتمتلك أسهما في Mestag Therapeutics و Leap Therapeutics و Surface Oncology و Cygnal Therapeutics. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر روب إيفرت على مساعدته في تصميم وتحسين شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة بالليزر. تم دعم هذا العمل من قبل مركز السرطان CSHL (P30-CA045508) وأموال ل M.E. من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01CA2374135 و 5P01CA013106-49) ؛ CSHL ونورثويل هيلث; مؤسسة عائلة طومسون؛ السباحة في جميع أنحاء أمريكا. ومنحة من مؤسسة سيمونز إلى CSHL. تم دعم MS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة جائزة تدريب العلماء الطبيين (T32-GM008444) والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1F30CA253993-01. L.M. مدعوم من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جيمس إس ماكدونيل. حصل J.M.A. على زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد أبحاث السرطان / Irvington (جائزة CRI # 3435). يتم دعم D.A.T. من قبل مختبر مؤسسة لوستغارتن المخصص لأبحاث سرطان البنكرياس ومؤسسة عائلة طومسون. تم إنشاء الرسوم المتحركة مع Biorender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريط جراحي من القماش الناعم 3M Medipore3M70200770819
خياطة حريرية 4-0 PERMA HAND BLACK 1 × 18 "RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP الفئرانمختبر جاكسون22974
مجموعة الركيزة AEC ، بيروكسيداز (HRP) ، (3-أمينو-9-إيثيل كاربازول)مختبرات ناقلات  SK-4200
مسحات كحولBD & nbsp ؛326895
شركة نظام التخديرلمنتجات التصوير الجزيئي
Acqknowledge البرمجيات وأجهزة الاستشعار BIOPACACK100W ، ACK100M ، TSD110
رذاذ البيتادين  LORIS109-08
c-fms< / em>-EGFP (MacGreen) الفئرانمختبر جاكسون18549
C57BL / 6J الفئرانمختبر جاكسون664
CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 الأجسام المضادةAbcamab125212
الإسفنج شاش Curity  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H& L (HRP) Abcamab6885
حمار مضاد للأرانب IgG H& L (HRP) Abcamab97064
حمار مضاد للفئران IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 علوم المجهر الإلكتروني الشفاف مغلف السيليكون24236-10جزأين ، نسبة خلط 10: 1
غطاء دائري للزجاج ، قطر 8 مم ، # 1.5 سمك   ؛علوم المجهر الإلكتروني72296-08
Ender-3 Pro طابعة ثلاثية الأبعادShenzhen Creality 3D Technology Co.، LTD
بطانية ساخنة بالأشعة تحت الحمراء البعيدةKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
حزمة معالجةفيجي https://imagej.net/software/fiji/
كربوكسيل FluoroSpheres ، 0.04 وميكرو ؛ م ، أصفر أخضر (505/515)نظام البوابات InvitrogenF8795
:BIOPAC Systems Inc.تسمح المكونات معا بمراقبة العناصر الحيوية للفأر أثناء التصوير والحصول على صور البوابات على تنفس الماوس. تم الحصول عليها جميعا من أنظمة BIOPAC.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
diff. & module, C series DA100C
نظام بوابات مزدوجDTU200   ؛
MP160 لنظام التشغيل Windows - نظامالتحليل MP160WSW 
ماوس أوكس بلس 120 فولت  موكس -120 فولت ؛ 015000 
وسادة الضغط TSD110 
GelfoamPfizer9031508إسفنجة جيلاتين قابلة للامتصاص
مقص ناعم مقوىأدوات العلوم الدقيقة14090-11زوجان ؛ الفولاذ المقاوم للصدأ ، حاد حاد
أطراف ، طرف مستقيم ، 26 مم
حافة القطع ، طول 11 سم
الإنسان / الفأر Myeloperoxidase / MPO الأجسام المضادةR & D SystemsAF3667
معقم الخرزة الساخنةأدوات العلوم الدقيقة18000-45قم بتشغيل حوالي 30 دقيقة
قبل الاستخدام ؛ تعقيم الأدوات عند >200
& deg ؛ C لمدة 30 ثانية
Imaris  Bitplanewww.bitplane.com
الغمر متوسط Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
محاقن الأنسولين بإبرة BD فائقة الدقة 6 مم × 31 جم 1 مل / سم مكعبBD324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (طماطم) ليكتين (LEL ، TL) ، DyLight & reg ؛ 594Vector Laboratories   ؛DL-1177-1
LysM< / em>-eGFPwww.mmrrc.orgملقط
دقيقRobozRS-5135مسنن ، منحنى طفيف ، عرض طرف 0.8 مم ؛ 4 بوصات طول
ملقط تشريح دقيقRobozRS-51531 × 2 أسنان ، منحنى طفيف ، رأس 0.8 مم < عرض BR / > ، 4 بطول
أنظمة MTS MiniBionix II 808MTSآلة اختبار المواد الهيدروليكية المؤازرة
Neutrophil Elastase 680 FAST probePerkinElmerNEV11169
توريد اللحام العامةبالنيتروجين
شركة توريداللحام العامة للأكسجين
خيوط حمض اللاكتيكHatchboxبقطر 1.75 مم
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube مرهم العينDechra & nbsp ؛NDC17033-211-38
Reflex 7 مقاطع الجرح RobozSurgicalRS-9255
شبكة الفولاذ المقاومFotofabOne يبلغ قطرها 0.200 بوصة ، بإجمالي 52 مربعا شبكيا فرديا يبلغ حجمها 0.016 × 0.016 بوصة. هناك 0.003 بوصة من المسافة بين كل مربع.  
زراعة الأنسجة المعقمة المعالجة بالسطحغطاءFB012929فيشر يستخدم كسطح علاج لنوافذ
التصوير TriM Scope Multiphoton المجهر   ؛LaVision BioTecImaging على مجهر 2 فوتون عمودي (Trimscope ، LaVision BioTec) مزود باثنين من ليزر Ti: Sapphire (Mai Tai و InSight ، Spectra-Physics) ومذبذب بصري بارامتري. تم استخدام مقسمات الشعاع ثنائية اللون Longpass (Chroma) التالية لتوجيه الإشارة نحو أربعة أنابيب مضاعفة ضوئية:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR زجاج غطاء صغيرVWR48404-453
التصوير صغير تشريح شركة . للصدأ ألواح علمي تم إجراء

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة