مقالة منهجية

iNEXT-Discovery and Instruct-ERIC: دمج الخدمات المتطورة للبحوث الانتقالية في البيولوجيا الهيكلية

DOI:

10.3791/63435

⸱

نوفمبر 16, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biochemistry and Oncode Institute, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, 2CERM/CIRMMP, University of Florence, 3Instruct-ERIC, Oxford University, 4MISTRAL beamline, Alba Light Source, 5Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Goethe University Frankfurt, 6Division of Structural Biology, Oxford University, 7Macromolecular Crystallographyy, Helmholtz-Zentrum Berlin

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقالات التي تمت مناقشتها:

Ahmad، M. U. D. et al. قياس فلوريمتر المسح الضوئي التفاضلي النانوي للفحص في اكتشاف الرصاص القائم على الشظايا. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (171), e62469 (2021).

Barbieri، L.، Luchinat، E. مراقبة تفاعلات البروتين والترابط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي في الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (169) ، e62323 (2021).

Berg، H. et al. فحص الأجزاء المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (172) ، e62262 (2021).

Beriashvili ، D. ، Schellevis ، R. D. ، Napoli ، F. ، Weingarth ، M. ، Baldus ، M. دراسات عالية الدقة للبروتينات في الأغشية الطبيعية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (169) ، e62197 (2021).

Cornaciu, I. et al. خطوط أنابيب علم البلورات الآلي في منشأة EMBL HTX في غرونوبل. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (172) ، e62200 (2021).

Crawshaw, A. et al. خط أنابيب تحضير عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (172) ، E62306 (2021).

Douangamath، A. et al. تحقيق فحص فعال للشظايا في منشأة XChem في مصدر ضوء الماس. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (171) ، e62414 (2021). < p class = "jove_content" >Groen ، J. et al. وصف رسم الخرائط ثلاثي الأبعاد للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية Cryo Soft. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (169), e62190 (2021).

Horrell ، S. et al. جمع البيانات التسلسلية المستهدفة الثابتة في مصدر ضوء الماس. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (168) ، e62491 (2021).

Jiménez-Moreno ، A. et al. Cryo-EM وتحليل الجسيم الفردي مع scipion. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (171) ، e62261 (2021).

Moravcová ، J. ، Pinkas ، M. ، Holbová ، R. ، Nováček ، J. التحضير والتصنيع الدقيق CryoFIB ل Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي CryoElectron. مجلة التجارب المتصورة: JoVE. E62351 (2021).

Vyas، N. et al. جمع البيانات المجهرية للإضاءة ذات الهيكل بالتبريد من الخلايا المحفوظة بالتبريد. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (171) ، e62274 (2021).

Weis، F.، Hagen، W.J.H.، Schorb، M.، Mattei، S. استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (169) ، e62383 (2021). < p class = "jove_content" > White ، J. B. R. et al. الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد أحادي الجسيم: من العينة إلى الهيكل. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (171) ، e62415 (2021).

Wollenhaupt، J. et al. سير العمل وأدوات فحص الأجزاء البلورية في helmholtz-zentrum Berlin. مجلة التجارب المرئية: JoVE. (169) ، e62208 (2021).

افتتاحية

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطور مجال البيولوجيا الهيكلية إلى نظام قوي لفهم علم الأحياء من خلال التفاصيل الذرية للهياكل الجزيئية الحيوية ، وإثراء فهمنا للمسارات الكيميائية الحيوية والأساس الجزيئي للأمراض ، وتقديم أداة لا غنى عنها للبحث الانتقالي.

على مر السنين ، ذهب علم الأحياء الهيكلي إلى ما هو أبعد من توفير الهياكل الثابتة ، ليقدم تقريرا أيضا عن التفاعلات الجزيئية ، سواء في المحلول أو في الخلايا ، وفحص المقاييس الزمنية والديناميكيات. يمكن الحصول على المعلومات لشرح العمليات على مقاييس مختلفة الحجم ، أي من الذرات والجزيئات الفردية إلى جزيئات وخلايا الفيروس بأكملها. توفر التقنيات المختلفة مجموعة تآزرية من الأساليب التجريبية ، بما في ذلك طرق التشتت القائمة على الأشعة السينية أو النيوترونات أو الإلكترونات ، على سبيل المثال ، علم البلورات بالأشعة السينية (MX) أو تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS). الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة والمحلول (NMR) ؛ وإعادة بناء الجسيمات المفردة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM). تضيف طرق مثل التصوير المقطعي بالتبريد EM ، والتصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد ، والرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية إلى هذه الترسانة من الأساليب لدراسة الأنظمة الجزيئية الكبيرة ، خاصة فيما يتعلق بأدوات التصوير الأخرى. جنبا إلى جنب مع الأساليب الفيزيائية الحيوية الإضافية التي توفر معلومات تكميلية حول الصلات والمقاييس الزمنية للتفاعل الجزيئي ، تقدم البيولوجيا الهيكلية التكاملية في الوقت الحاضر حزمة هائلة لفهم الحياة وتطوير الأدوية والبيولوجيا (الأجسام المضادة والأجسام النانوية واللقاحات) والمواد الحيوية والعوامل البيولوجية الأخرى ، مثل الإنزيمات التي يمكن استخدامها لتحلل البلاستيك ومساعدة البيئة.

في وقت مبكر ، أدركت المفوضية الأوروبية (EC) الفوائد التي تتمتع بها أبحاث البيولوجيا الهيكلية للمجتمع ، ومنذ الثمانينيات استثمرت أوروبا بقوة في فتح معدات البيولوجيا الهيكلية باهظة الثمن مجانا للمجتمع العلمي الأكبر. كان هذا التحول الديمقراطي للوصول إلى المرافق التي تبلغ تكلفتها ملايين اليورو قوة دافعة وحجر زاوية لتطوير مجال البيولوجيا الهيكلية على الصعيد الدولي. وضع هذا أوروبا في طليعة المجال ، وبالتالي تمكين قطاع صناعي قوي والمساهمة في الاقتصادات المحلية.

تعتز المفوضية الأوروبية بتقليد طويل ومثير للإعجاب في وصول الباحثين الخارجيين وتدريبهم في تقنيات البيولوجيا الهيكلية. بعد برنامج iNEXT الناجح (البنية التحتية للرنين المغناطيسي النووي والEM والأشعة السينية للأبحاث الانتقالية) الذي سمح بالوصول المجاني إلى البيولوجيا الهيكلية إلى المرافق المتطورة وجميع الباحثين الأوروبيين حتى نهاية عام 2019 ، بدأ مشروع Horizon2020 iNEXT-Discovery في فبراير 2020 لفترة أربع سنوات أخرى من الوصول الممول بالكامل إلى البنى التحتية للبيولوجيا الهيكلية. في موازاة ذلك ، يعد Instruct-ERIC معلما بارزا في منتدى الإستراتيجية الأوروبي حول البنى التحتية البحثية ، ويشكل معقلا مستداما في البيولوجيا الهيكلية للمجتمعات العلمية الأوروبية والدولية. ويطمحون معا إلى إشراك علماء الحياة وغيرهم في أبحاث البيولوجيا الهيكلية، ولهذا يقدمون الوصول إلى بعض من أفضل خبرات وتقنيات ومرافق البيولوجيا الهيكلية في جميع أنحاء العالم، للباحثين من الأوساط الأكاديمية والصناعة على حد سواء. جنبا إلى جنب مع شركاء إضافيين ، ينظمون أيضا ورش عمل وتدريب عملي.

بسبب جائحة Covid19 ، كان السفر إلى مرافق أبحاث iNEXT-Discovery و Instruct-ERIC ضعيفا إلى حد كبير ، مما يحظر بشكل أساسي فرص التدريب العملي. للتعويض جزئيا عن ذلك ، قام كل من iNEXT-Discovery و Instruct-ERIC بترتيب سلسلة ندوات عبر الإنترنت (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us ، https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function) ، بالإضافة إلى هذا العدد الخاص من الأساليب من مجلة التجارب المرئية. ستجد هنا أوصافا مفصلة ليس فقط للعديد من إجراءات الوصول السائدة لدينا ، ولكن أيضا للإجراءات الروتينية المتخصصة قيد التطوير في مجال البيولوجيا الهيكلية التكاملية. بينما تم وصف أساليبنا في هذا العدد بالتفصيل ، يتطلب بعضها خبرة ومعدات يصعب إنشائها محليا. تتوفر مرافق Instruct-ERIC و iNEXT-Discovery لتوفير هذه الأساليب ، بما في ذلك إنتاج الجزيئات الحيوية اللازمة للدراسات الهيكلية ، بمساعدة وإشراف موظفين محليين ذوي مهارات عالية.

طرق محسنة لتحديد الهياكل الجزيئية الكبيرة
على مدار العقد الماضي ، تطورت cryo-EM لتصبح تقنية شائعة للغاية لتحديد الهياكل المعقدة الجزيئية. يقدم الفريق من جامعة ليدز (المملكة المتحدة) نظرة عامة على جميع الخطوات المتضمنة في تحليل EM أحادي الجسيم ، مع التركيز على المتغيرات التي يمكن تحسينها أثناء سير العمل واستكشاف المشكلات الشائعة وإصلاحها1. مع تشغيل المجهر عبر الإنترنت من قبل المستخدمين الخارجيين أصبح قياسيا ، يلزم وجود بروتوكولات للتشغيل والتصوير عن بعد بكفاءة. من خلال تحليل الجسيمات المفردة ، يتم تصوير العينات المزججة لإنتاج أفلام تعرض الجسيمات في اتجاهات عشوائية. يحدد سير عمل معالجة الصور معلمات إعادة بناء العينة قيد الدراسة. يوفر برنامج Scipion من CSIC (ES) جميع الأدوات لإنشاء سير العمل هذا ، مما يسمح أيضا بالتتبع المباشر للنتائج2.

يوفر جمع بيانات حيود الأشعة السينية على عينات بلورية صغيرة جدا فرصا بحثية كبيرة بالإضافة إلى تحديات تقنية. يقدم فريق Diamond (المملكة المتحدة) استخدام أدوات cryo-EM لإعداد مئات البلورات الدقيقة على شبكة واحدة مع الحد الأدنى من السائل المحيط على دعم منخفض الضوضاء ، قبل جمع البيانات في بيئة خط شعاع مخصصة تتضمن فراغا في مسار الأشعة السينية قبل وبعد العينة3. يعد جمع بيانات الأشعة السينية التسلسلية في السنكروترونات أيضا مفتاحا لدراسة الأنظمة البلورية الصعبة الأخرى. في مساهمة أخرى ، يعرض Diamond تعليمات وأرقام ومقاطع فيديو خطوة بخطوة لجمع البيانات باستخدام مجموعة متنوعة من أنظمة توصيل البلورات ، من خلال سلسلة من الأمثلة4.

البيولوجيا الهيكلية التكاملية الحديثة في اكتشاف الأدوية
علم البلورات بالأشعة السينية راسخ لاكتشاف الأدوية القائمة على الأجزاء ويستخدم بالفعل بشكل شائع لتحديد الضربات التي يمكن تطويرها بسلاسة على المرشحين الرئيسيين. تصف فرق من Diamond5 و Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) و MAX IV (SE) 6 ووحدة EMBL Grenoble (FR) 7 أحدث تطوراتها في أتمتة سير العمل من أجل بلورة الهدف بكفاءة ، ونقع الشظايا ، وتركيب البلورات ، وفحص الأجزاء المدفوعة بعلم البلورات ، وترسيب الهيكل. خطوط الأنابيب الخاصة بهم مؤتمتة إلى حد ما ويستخدمها باحثون خارجيون في جميع أنحاء العالم. وقد تم تطبيقها بالفعل على أكثر من 100 هدف (غالبا عن بعد) لتحديد الضربات لمزيد من التصميم المركب وتطوير الرصاص بمساعدة الهيكل.

يستخدم الرنين المغناطيسي النووي أيضا بشكل شائع لفحص الأجزاء في حملات تطوير الأدوية ، واستهداف البروتينات أو عديد النوكليوتيدات ، سواء كانت قابلة للذوبان أو مرتبطة بالغشاء. تقدم جامعة جوته في فرانكفورت (DE) خطوط أنابيب محسنة لفحص الرنين المغناطيسي النووي ، مما يقلل من التدخل اليدوي أثناء التجريب والتحليلات8. تتعامل مغيرات العينات الخاصة بهم مع مئات عينات الرنين المغناطيسي النووي في جولة واحدة خلال عدة أيام من التجارب المتواصلة والتحليل الآلي.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق الفيزيائية الحيوية مكملة للأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي. يقدم فريق من المعهد الهولندي للسرطان (NL) سير عمل باستخدام مسعر المسح التفاضلي النانوي لمقايسات التحول الحراري لقياس التغيرات في درجة حرارة الذوبان المستهدفة عند إضافة الأجزاء9. يتبع المتطلبات الأساسية المتعلقة بجودة البروتين وتركيزه بروتوكول تحليلي للتصميم التجريبي وجمع البيانات وتحليلها.

نحو البيولوجيا الهيكلية الخلوية
غالبا ما يكون التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد هو الطريقة المفضلة للنظر في المجمعات الجزيئية الكبيرة في الخلايا. يتم الحصول على صور من العينات المزججة بزوايا ميل مختلفة ، وإعادة بناء مخطط مقطعي ثلاثي الأبعاد ، يتم استخراج الأحجام الفرعية منه لإعطاء دقة أعلى عن طريق متوسط التصوير المقطعي الفرعي. نظرا لأن الإلكترونات تتفاعل بقوة مع المادة ، فإن مثل هذه الدراسات تتطلب عينات أقل من 200 نانومتر. يقدم فريق CEITEC (CZ) بروتوكولا10 لتحضير الصفائح الخلوية بعد التجميد. على الرغم من أن الأتمتة في cryo-ET قد أحرزت تقدما مثيرا للإعجاب ، إلا أن ساعات من جمع البيانات مطلوبة قبل الحصول على سلسلة الإمالة ، ولا يزال يتم تحديد الأهداف عادة من خلال فحص الشبكة المرئية. تم إعداد بروتوكول أتمتة من قبل EMBL Heidelberg (DE) لرسم خريطة للشبكات ومربعات الشبكة ، وتحديد الأهداف وإعداد اكتساب سلسلة الإمالة11.

تناقش السنكروترونات ALBA (ES) و Diamond معا مزالق ومزايا بديل للتصوير المقطعي بالتبريد-EM الذي يسمح بفحص الخلايا السليمة ، وهي التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد (cryo-SXT) 12. يسمح تكييف تقنيات الدقة الفائقة مع درجات الحرارة المبردة بالتصوير المرتبط باستخدام cryo-ET و cryo-SXT. أيضا ، يضاعف الفحص المجهري للإضاءة عالي الإنتاجية (cryo-SIM) دقة التألق التقليدي ، مما يؤدي إلى موقع محدد للجزيئات أو الهياكل في عينات سميكة. يمكن ربط هذا ب cryo-SXT لتحديد ميزات محددة في السياق الخلوي13.

أبلغ فريق جامعة أوتريخت (NL) عن تحضير العينات وتجارب الرنين المغناطيسي النووي ذات الحالة الصلبة عالية الحساسية التي يمكن استخدامها لدراسة الأنظمة الفسيولوجية الصعبة ، بما في ذلك الأغشية الطبيعية وأنظمة البروتين والدهون والجليكان14. بالإضافة إلى ذلك ، يتطور الرنين المغناطيسي النووي في محلول الخلية بسرعة لتوضيح العمليات الوظيفية. يصف فريق CERM / CIRMMP (IT) كيفية تجميع وتشغيل المفاعلات الحيوية التي تسمح بتجديد العناصر الغذائية والأكسجين للخلايا الحية داخل مسبار الرنين المغناطيسي النووي في قلب مغناطيس عالي المجال15. يسمح ذلك بإجراء قياسات موسعة وتجارب تم حلها بمرور الوقت ، على سبيل المثال ، لمراقبة تفاعلات البروتين والترابط داخل الخلايا.

ملاحظات ختامية
هذا العدد مخصص بالكامل للتطورات الحديثة في علم الأحياء الهيكلي وتطبيقاته في البنى التحتية البحثية الأوروبية. معا ، يسمح iNEXT-Discovery و Instruct-ERIC لمتخصصي البيولوجيا الهيكلية ، ولكن أيضا علماء الحياة غير المتخصصين والباحثين الآخرين ، بمتابعة أهدافهم البحثية من خلال تقديم أحدث الخدمات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل إصدار مجموعة طرق JoVE هذا بواسطة iNEXT-Discovery، المشروع رقم 871037، بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62415(2021).
  2. Jiménez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with scipion. Journal of. Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  3. Crawshaw, A., et al. A sample preparation pipeline for microcrystals at the VMXmbeamline. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62306(2021).
  4. Horrell, S., et al. Fixed target serial data collection at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62491(2021).
  5. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at XChemfacility at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62414(2021).
  6. Wollenhaupt, J., et al. Workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum Berlin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62208(2021).
  7. Cornaciu, I., et al. The automated crystallography pipelines at the EMBL HTX facility in grenoble. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62200(2021).
  8. Berg, H., et al. NMR-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62262(2021).
  9. Ahmad, M. U. D., et al. Nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62469(2021).
  10. Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and CryoFIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for CryoElectrontomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e62351(2021).
  11. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62383(2021).
  12. Groen, J., et al. A 3D cartographic description of the cell by cryosoft X-ray tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62190(2021).
  13. Vyas, N., et al. Cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62274(2021).
  14. Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. High-resolution studies of proteins in natural membranes by solid-state NMR. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62197(2021).
  15. Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring protein-ligand interactions in human cells by real-time quantitative in-cell NMR using a high cell density bioreactor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62323(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Nano differential Scanning FluorimetryProtein ligand InteractionsIn cell NMRFragment based Lead DiscoverySolid state NMRAutomated CrystallographyCryo EMSingle particle AnalysisCryo electron TomographyData Acquisition StrategiesHigh resolution Protein StudiesBioreactor Technology

مقالات ذات صلة