يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

أكتوبر 27, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي البشري.

الملخص

نبلغ هنا عن إجراء قياسي لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs). تم استخدام أنسجة الليمبوس التي تم الحصول عليها من بنك العين لعزل LNCs. تم تقسيم الأنسجة إلى 12 قطعة تحت ظروف معقمة وهضمها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا باستخدام كولاجيناز A للحصول على مجموعات الخلايا مع LNCs والخلايا السلفية الظهارية القزحية. تم هضم مجموعات الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA للحصول على خلايا مفردة ثم زرعها في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) على سطح بلاستيكي مغطى ب 5٪ Matrigel. تم تمرير الخلايا عند التقاء 70٪ ، وتم تحديد LNCs باستخدام التألق المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، وقياس التدفق الخلوي. تم عزل LNCs الأولية ومرورها أكثر من 12 مرة. كان نشاط انتشار LNCs من P4 إلى P6 هو الأعلى. عبرت LNCs عن علامات خلايا جذعية أعلى من BMMSCs (SCF و Nestin و Rex1 و SSEA4 و CD73 و CD90 و MSX1 و P75NTR و PDGFRβ). علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن P4 LNCs عبرت بشكل موحد عن VIM و CD90 و CD105 و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، والتي يمكن استخدامها كعلامة لتحديد LNCs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ من LNCs عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF على التوالي ، بينما كانت 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ في BMMSCs. ويمكن أن توفر العملية المعيارية لعزل البلدان غير الطبيعية وتحديد هويتها أساسا مختبريا موثوقا به للاستخدام الواسع النطاق للبلدان غير الطبيعية.

المقدمة

أصبح حدوث نقص الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CESD) ، ويسمى أيضا نقص الخلايا الجذعية الطرفية (LSCD) 1 ، وتجديد ظهارة القرنية (CES) أكثر إلحاحا بسبب عدوى القرنية وإصابتها. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي CESD إلى العمى الذي يتطلب زرع القرنية. نتيجة لذلك ، أصبح تجديد CES أكثر أهمية. هناك مجموعة من الخلايا الداعمة تسمى الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs) التي توفر الدعم الأساسي لوظيفة CES. تم عزل الخلايا الجذعية اللحمية القزحية لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تحديدها بواسطة Xie et al.3 على أنها LNCs المترجمة في ظهارة القزحية تحت الانبساط وسدى الليمبوس. LNCs هي الخلايا الجذعية الداعمة الرئيسية لحافة القرنية ، ومع وظيفة MSC المشتقة من نخاع العظم (BMMSCs) ، ويمكن تحريضها على التطور إلى خلايا ظهارية القرنية وخلايا انسجة القرنية ، إلخ.3،4،5،6،7. أظهرت الدراسات السابقة أن صفات الخلايا الجذعية ل LNCs أكثر بدائية منBMMSCs 8 ، والتي تستخدم بالفعل على نطاق واسع في العيادة. قد تصبح LNCs الخيار التالي القابل للتطبيق بعد MSC ، خاصة لعلاج CESD. كخلايا داعمة مهمة ل CES ، فإن LNCs هي أيضا خلايا جذعية مشتقة من البنية "المتخصصة" للطرف. قد تلعب LNCs دورا رئيسيا في إلغاء تمايز الخلايا الظهارية القرنية الناضجة (MCEC) إلى CES9. ومع ذلك، لا تزال الدراسات المتعلقة بالشركات غير المحلية غير كافية نسبيا، ولا يوجد توافق في الآراء بشأن مصطلحات الشركات غير الساحلية وعزلها وتنقيتها وتحديدها وخصائصها. قام بعض الباحثين بتسمية LNCs الخلايا الجذعية اللحمية المشتقة من الخزعة الطرفية 10 ، والخلايا الجذعية الوسيطة الطرفية11 ، والخلايا الجذعية الليفية الطرفية12 ، والخلايا اللحمية المتوسطةالطرفية 13. نظرا لأن خصائص نمو LNCs لم يتم وصفها بالتفصيل ، وبسبب تطبيقاتها العلمية والسريرية الواعدة ، وقد تكون واحدة من أهم الأدوات السريرية في المستقبل ، فمن الضروري تلخيص عزل وتنقية وتحديد وخصائص LNCs.

وفقا لدراسة سابقة14 ، توجد LNCs بشكل رئيسي في ظهارة القزحية تحت وسدى الليمبوس. يتضمن هذا البروتوكول علاج أنسجة الأطراف باستخدام كولاجيناز أ ، والحصول على مجموعة تتكون من LEPC و LNCs ، وهضمها في خلايا مفردة مع 0.25٪ trypsin-EDTA (TE). ثم تم استزراع LNCs بشكل انتقائي في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) لتنقيتها. البروتوكول المذكور في هذه الورقة بسيط وله كفاءة عالية في الحصول على LNCs البشرية بكميات كبيرة.

تم تسجيل الإجراء التفصيلي لعزل LNC وثقافته وتحديد هويته في الفيديو للعلماء المهتمين بدراسة LNC ، ويمكن تكراره بسهولة عند الحاجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على أنسجة ليمبوس من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 50 و 60 عاما من بنك العيون التابع للصليب الأحمر ، مستشفى تونغجي (ووهان ، الصين). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في تونغجي وتم إجراؤه وفقا لإعلان هلسنكي.

1. العزلة

  1. احصل على أنسجة الحواف من وسط تخزين القرنية على المدى المتوسط واعمل في ظل ظروف معقمة على طاولة عمل فائقة النظافة.
  2. كشط وإزالة القزحية والبطانة حول القرنية باستخدام شفرة جراحية مستديرة معقمة.
  3. قطع الأنسجة الطرفية إلى اثني عشر قطعة متساوية الحجم مع شفرة جراحية مع ترك 1 مم على جانبي القرنية والصلبة.
  4. انقل أنسجة الأطراف إلى طبق استزراع 3.5 سم ، أضف 1 مل من كولاجيناز أ (2 مجم / مل ، في وسط DF-12) ، لغمر جميع الأنسجة للهضم.
  5. ضع اللوحة في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية ، وهضم الأنسجة الداكنة حول القزحية لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ إجراءات المتابعة في اليوم الثاني.
  6. قم بإعداد مصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 5٪ (Matrigel) مطلية بلوحة استزراع 6 آبار.
    1. قم بتغطية مصفوفة غشاء القاع بنسبة 5٪ (مذابة في MESCM [الجدول 1]) في قاع البئر.
    2. قم بإعداد أطراف 200 ميكرولتر و 1 مل ، وأنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 مل ، ولوحة واحدة من 6 آبار في كيس معقم.
    3. ضع الكيس المعقم (بما في ذلك النصائح وأنبوب الطرد المركزي) ولوحة جديدة من 6 آبار في بيئة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
    4. أخرج الأطراف المبردة مسبقا وأنبوب الطرد المركزي ولوحة 6 آبار من بيئة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية ، ثم قم بإجراء العمليات التالية على طاولة العمل فائقة النظافة.
    5. انقل مصفوفة غشاء القاعدية 50 ميكرولتر 5٪ إلى 1 مل MESCM باستخدام طرف 200 ميكرولتر ، واخلطهم برفق وبشكل متساو.
    6. انقل مصفوفة غشاء القاع بنسبة 5٪ (مذابة في MESCM) إلى بئر واحد من صفيحة استزراع ذات 6 آبار باستخدام طرف 1 مل المبرد مسبقا.
    7. هز لوحة 6 آبار برفق وأفقيا ، ضع لوحة الاستزراع المكونة من 6 آبار في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا ، ثم قم بتنفيذ الخطوة التالية.
  7. بعد 18 ساعة من الهضم ، أخرج الكولاجين من الأنسجة الطرفية المهضومة ، وستبقى فقط بعض المجموعات الصغيرة المرئية والأنسجة الصلبة غير المهضومة.
    ملاحظة: يكشف الفحص المجهري عالي التكبير عن مجموعة مكونة من العديد من الخلايا المعبأة بكثافة (بما في ذلك LNCs).
  8. استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لفصل المجموعات عن الأنسجة الصلبة غير المهضومة تحت المجهر المجسم.
  9. انقل المجموعات إلى لوحة الاستزراع التي يبلغ قطرها 3.5 سم واغمرها في 0.25٪ TE ، ثم ضع اللوحة في حاضنة الخلايا لمدة 15 دقيقة.
  10. أضف 1 مل MESCM مع مصل بالضربة القاضية بنسبة 10٪ لإيقاف هضم الخلايا وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المجموعات في خلايا فردية باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل.
  11. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  12. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج ترسيب الخلية ، ثم أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا.
  13. ماصة صعودا وهبوطا 2-3 مرات حتى يتم تعليق ترسيب الخلية السفلية بالتساوي في MESCM باستخدام طرف ماصة 1 مل ، واتخاذ تعليق خلية 20 ميكرولتر لعد الخلايا.
  14. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 6 آبار مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 5٪ مع طرف ماصة سعة 1 مل وقم بزيادة حجم MESCM إلى 2.5 مل.
  15. هز برفق لوحة 6 آبار أفقيا لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  16. نقل الخلايا إلى حاضنة الثقافة بعد تصويرها وتسجيلها. مراقبة وتصوير الخلايا يوميا ، وتغيير الوسيط كل 3-4 أيام.

2. تحديد LNC

  1. تلطيخ المناعي
    1. قم بهضم LNCs من أسفل اللوحة باستخدام 1 مل 0.25٪ TE لمدة 5 دقائق في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية.
    2. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 1 مل MESCM (يحتوي على مصل بالضربة القاضية) ، والطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية بعناية.
    3. أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا في التعليق. قم بإعداد تعليق خلية 80 ميكرولتر (4 × 103 خلايا لكل شريحة) ل 4 شرائح (20 ميكرولتر / شريحة) واستخدم نظام الطرد المركزي لإيداع الخلايا على شرائح المجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. قم بإصلاح الخلايا (الملتصقة بالشرائح في الخطوة 3) باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق تقريبا ، ثم قم بتخلل الخلايا على الشرائح بنسبة 0.2٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بسد الخلايا لمدة ساعة واحدة مع 2٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) قبل احتضانها بالأجسام المضادة الأولية (Pan-CK [1: 1000] ، Vim [1: 100] ، CD90 [1: 100] ، CD105 [1: 200] ، SCF [1: 100] ، PDGFRβ [1: 100]) على شاكر طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة عن طريق غسل (5 دقائق / غسل ، 3x) الشرائح باستخدام PBST (PBS + 0.1٪ Tween 20).
    6. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (حمار مضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي TRITC [1: 1000] ، حمار مضاد للأرانب IgG FITC [1: 500] ، حمار مضاد للفأر IgG 488 [1: 300] ، حمار مضاد للأرانب IgG 594 [1: 400]) لمدة ساعة واحدة مع أجسام مضادة IgG غير محددة مناسبة. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي غير المنضم باستخدام PBST (5 دقائق / غسل ، 3x).
    7. قم بتلطيخ النوى ب 5 ميكروغرام / مل DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole) وأغلق الشرائح.
    8. إجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر مضان (التكبير: 400x; وقت التعرض: 50 مللي ثانية).
  2. تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR)
    1. خذ مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. استخدم مجموعة نسخ cDNA عالية السعة لعكس نسخ 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA.
    3. قم بإجراء النسخ العكسي (42 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 50 درجة مئوية ، 85 دقيقة) و qPCR (95 درجة مئوية ، 5 دقائق ؛ 95 درجة مئوية ، 10 ثوان ، 40 دورة) في محلول 20 ميكرولتر يحتوي على cDNA (100 نانوغرام) ، مزيج فحص التعبير الجيني TaqMan (1 ميكرولتر) ، مزيج PCR Master العالمي (10 ميكرولتر) و ddH2O (إلى 20 ميكرولتر).
    4. استخدم تقنية التصوير المقطعي المحوسب المقارن (ΔΔCT)4,9 لفحص التعبير الجيني النسبي.

3. توصيف LNC

  1. عد الخلايا (مقياس الدم)
    1. قم بهضم LNCs من أسفل اللوحة باستخدام 0.25٪ TE لمدة 5 دقائق في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية.
    2. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 1 مل MESCM (يحتوي على مصل بالضربة القاضية) ، والطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية بعناية.
    3. أضف 1 مل MESCM لإعادة تعليق الخلايا ، ثم خذ تعليق خلية 10 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي 0.5 مل. أضف حجما متساويا من محلول تلطيخ أزرق Trypan بنسبة 0.4٪.
    4. ضع معلق خلية ملطخة 10 ميكرولتر على منطقة العد في مقياس الدم وقم بتغطيته بغطاء للعد.
      ملاحظة: يتم تعريف عدد الخلايا في مناطق المربع الأوسط الخمسة على أنها "A" ؛ يتم حساب رقم الخلية في 1 مل على أنه 5A × 104 × 2.
  2. فحص علامات LNC و BMMSC مع قياس التدفق الخلوي15
    1. الكشف عن تعبير SCF و CD73 و CD90 و CD105 في LNCs و BMMSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي 15 (2-4 ×10 6 أحداث / عينة ، تم الحصول على 2000 خلية من كل عينة ، بإجمالي 550000 خلية تم إغلاقها في وقت واحد).
    2. اجمع الخلايا وقم بتلطيخها عند 20-30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مخزن مؤقت مانع (3٪ BSA و 0.05٪ Tween-20 في PBS) باستخدام الأجسام المضادة المصنفة مسبقا (SCF [1:50] و CD70 [1:50] و CD90 [1:50] و CD105 [1:50]) وفقا لتعليمات المجموعة.
    3. قم بإجراء تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام مقياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج FACS Diva وبرنامج FlowJo. لكل عينة ، سجل 10000 حدث وقم ببوابة الخلايا الحية وتحليلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نمو LNC
تم عزل LNCs بنجاح وفقا لطريقة هضم كولاجيناز A (2 مجم / مل) لهضم أنسجة حافة القرنية الصلبة ، كما هو موضح أعلاه (الشكل 1). تمشيا مع دراسة تم الإبلاغ عنهاسابقا 3 ، بعد هضم كولاجيناز أ ، تم تصور مجموعات تشبه اليرقة تحت المجهر (الشكل 2). زادت نسبة خلايا المغزل تدريجيا مع مرور الخلية. يمكن أن تنمو الخلايا على شكل مغزل على ألواح مصفوفة غشاء قاعدي مطلية بنسبة 5٪ ، على عكس نظيراتها المزروعة على البلاستيك بدون مصفوفة غشا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عادة ما يتم الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الترتيب والتوزيع المنتظم للألياف الصغيرة (قطرها 25-30 نانومتر) في سدى القرنية ، وهو أمر بالغ الأهمية لحدة الرؤية الطبيعية16. هناك 253 مليون شخص يعانون من ضعف البصر في جميع أنحاء العالم ، 36 مليون منهم مكفوفون17. تعتبر منظمة الصحة العالمية (WHO) عمى القرنية أحد أخطر المخاطر على البصر البشري ، حيث تمثل 5.1٪ من جميع حالات العمى في جميع أنحاء العالم16. عيب ظهارة القرنية مع CES الطبيعي يمكن أن تلتئم بسرعة دون ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أي من المؤلفين أي إقرارات مالية ذات صلة.

شكر وتقدير

شكرا ل Wei Wang و Lingjuan Xu و Rong Liu على التوجيه بشأن هذا العمل ، و Yongyao Tan و Bihui Jin و Chunxiu You و Li Guigang لتوفير بعض المواد ، و Guanyu Su لكتابة المخطوطة ، و Xiao Zhou و Yihong Xiong و Huatao Xie لتصحيح المخطوطة ، و Guigang Li لتوجيهاته الكاملة. ودعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070936، 81470606، 81570819)، ومشروع البحث العلمي للصحة وتنظيم الأسرة في مقاطعة هوبى (No. WJ2017M073) ، أفضل عشرة مشاريع بحثية طبية متعدية من مستشفى تونغجي (رقم 2016ZHYX20) ، مشروع تدريب الرواد الطبيين الشباب في مدينة ووهان (رقم 2015whzqnyxggrc10) ، برنامج توظيف المواهب العالمية (G2022154028L) ، مشروع اللجنة الوطنية للصحة في مقاطعة هوبي في عام 2022 (WJ2021ZH0005) ، ومؤسسة البناء الموضوعي لقسم المالية في هوبى في عام 2022 (42000022815T000000102)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4 '، 6-Diamidino-2-PhenylindoleThermoFisherD13065 & mu ؛ جم / مل
أمفوتريسين بسيجماV9009191.25 مو ؛ جم / مل
Anti-CD73Abcamab2021221:50
ألبومين مصل البقرMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
حاضنة الخليةشنغهاي LishenK1119K4644HF90 (HT)
نظام الطرد المركزيStatSpin   ؛StatSpin CytoFuge
ARoche101035780012 مجم / مل
مجهر متحد البؤرZeiss   ؛LSM700-Culture
لوحةvirya350035635 مم
DME / F-12 1: 1 (1x)   ؛cytivaSH30023.0190٪
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانويThermoFisherA160161: 1000
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانويThermoFisher315681: 1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesTreeStar-Flow
CytometerBiosciencesBecton Dickinson LSRII-
المجهر الفلوريأوليمبوسcx31   ؛
جنتاميسينسيجماG191450 & مو ؛ جم / مل
مقياس الدمMERCKZ359629السعة Bright-Line
ThermoFisher4374966
مجهر تباين الطور المقلوب  ؛ UOPDSZ2000X
ITS (الأنسولين ، الترانسفيرين ، سيلينيت الصوديوم)SigmaI31465 & mu ؛ جم / مل الأنسولين ، 5 مو ؛ جم / مل ترانسفيرين ، 5 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم
بالضربة القاضية SR استبدال المصل ل ESCs / iPSCsgibco10828-02810٪
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531: 1000
ParaformaldehydeNoninBioNBS01354.00٪
ParaformaldehydeMKBioMM-15054٪
PDGFR & beta ؛AbclonalA14441:100
أداة PCR الكمية الفلورية في الوقت الحقيقيالنظم الحيوية التطبيقيةالخطوة الأولى بالإضافة إلى
المؤتلف البشري FGF-basicPeprotech100-18B4 نانوغرام / مل
مثبط لسرطان الدم البشري (Lif)Peprotech300-0510 نانوغرام / مل
RNeasy طقم عزل الحمض النووي الريبي الصغيرQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
مجهر مجسمZEISSSteREO Discovery. شفرة
Careforde29500مقاس 10
TaqMan Gene Expression Assay MixApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000.20٪
Trypan blueThermoFisher152500610.40٪
Trypsin-EDTAGenviewGP31080.25٪
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
UNIVERSAL PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Vim & nbsp ؛أبكامab925471:100
12-Collagenase BD مجموعة نسخ cDNA عالية عامل مستديرة جراحية معقمة V8

المراجع

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566(2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

EDTA
عزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.