مقالة منهجية

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

DOI:

10.3791/65690

⸱

فبراير 23, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس المستقلبات بدقة وموثوقية في أنواع الخلايا النادرة. تتيح التحسينات التقنية ، بما في ذلك سائل غمد معدل لفرز الخلايا وتوليد عينات فارغة ذات صلة ، إجراء تقدير كمي شامل للمستقلبات بإدخال 5000 خلية فقط لكل عينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد الوظيفة الخلوية بشكل حاسم على التمثيل الغذائي ، ويمكن دراسة وظيفة الشبكات الأيضية الأساسية عن طريق قياس وسيطة الجزيئات الصغيرة. ومع ذلك ، فإن الحصول على قياسات دقيقة وموثوقة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، لا سيما في أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم ، يتطلب تقليديا تجميع الخلايا من متعددة. يمكن البروتوكول الآن الباحثين من قياس المستقلبات في أنواع الخلايا النادرة باستخدام فأر واحد فقط لكل عينة مع توليد نسخ متماثلة متعددة لأنواع خلايا أكثر وفرة. هذا يقلل من عدد المطلوبة لمشروع معين. يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية عن بروتوكولات الأيض التقليدية ، مثل استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في الأسيتونيتريل ، واستخدام القياس الكمي المستهدف مع الاستخدام الصارم للمعايير الداخلية ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. على الرغم من الوقت اللازم لعزل الخلايا المفردة ، وتلطيخ الفلورسنت ، والفرز ، يمكن للبروتوكول الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا والعلاجات الدوائية إلى حد كبير.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأيض هو عملية بيولوجية أساسية تحدث في جميع الخلايا الحية. تتضمن عمليات التمثيل الغذائي شبكة واسعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية المنظمة بإحكام والمترابطة ، مما يسمح للخلايا بإنتاج الطاقة وتوليف الجزيئات الحيوية الأساسية1. لفهم وظيفة الشبكات الأيضية ، يقيس الباحثون مستويات الجزيئات الصغيرة الوسيطة داخل الخلايا. تعمل هذه المواد الوسيطة كمؤشرات مهمة للنشاط الأيضي ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة في الوظيفة الخلوية.

قياس الطيف الكتلي (MS) هو الخيار الأكثر شيوعا للكشف المحدد عن المستقلبات في العينات المعقدة 1,2. يتميز الرنين المغناطيسي النووي (NMR) بمزايا في القياس الكمي المطلق للمركبات وتوضيح البنية ، ولكن يمكن لمرض التصلب العصبي المتعدد في كثير من الأحيان حل المزيد من المكونات في الخلائط المعقدة مثل السوائل الحيوية أو مستخلصات الخلايا. في أكثر الأحيان ، يتم دمج MS مع الفصل المسبق للمركب عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري (CE) أو كروماتوغرافيا الغاز (GC) أو الكروماتوغرافيا السائلة (LC) 3. إن اختيار منصة الفصل مدفوع في الغالب بنطاق المستقلبات المستهدفة ونوع العينة ، وفي بيئة العالم الحقيقي ، بتوافر الآلات والخبرات. تحتوي جميع منصات الفصل الثلاثة على مجموعة واسعة ومتداخلة من المستقلبات المناسبة ولكن لها قيود مختلفة. باختصار ، يمكن ل CE فصل الجزيئات المشحونة فقط ويتطلب الكثير من الخبرة لتنفيذ تحليل قوي لعدد كبير من العينات4. يقتصر GC على الجزيئات الصغيرة وغير القطبية بما يكفي للتبخر قبل أن تتحلل3. بالنظر إلى جميع أعمدة LC المتاحة تجاريا ، يمكن فصل أي مستقلبين بواسطة هذه التقنية5. ومع ذلك ، فإن العديد من طرق LC تظهر قوة حل أقل من طرق CE أو GC ذات الطول المماثل.

عادة ما تكون الكمية النموذجية للمواد الأولية لقياسات الأيض في حدود 5 × 105 إلى 5 × 107 خلايا لكل عينة ، أو 5-50 مجم من الأنسجة الرطبة ، أو 5-50 ميكرولتر من سائل الجسم6. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب الحصول على مثل هذه الكميات من المواد الأولية عند العمل مع الخلايا الأولية لأنواع الخلايا النادرة ، مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) أو الخلايا السرطانية المنتشرة. غالبا ما توجد هذه الخلايا بأعداد قليلة جدا ولا يمكن زراعتها دون المساس بالميزات الخلوية الحرجة.

الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا السلفية متعددة القدرات (MPPs) هي الخلايا الأقل تمايزا في نظام المكونة للدم وتنتج باستمرار خلايا دم جديدة طوال حياة الكائن الحي. تنظيم تكون الدم له أهمية سريرية في حالات مثل سرطان الدم وفقر الدم. على الرغم من أهميتها ، تعد HSCs و MPPs من بين أندر الخلايا داخل نظام المكونة للدم. من ماوس واحد ، عادة ، يمكن عزل حوالي 5000 HSCs7،8،9. نظرا لأن طرق الأيض التقليدية تتطلب المزيد من مواد الإدخال ، فقد كان تجميع الخلايا من فئران متعددة ضروريا في كثير من الأحيان لتحليل أنواع الخلايا النادرة10,11.

هنا ، كنا نهدف إلى تطوير بروتوكول يتيح قياس المستقلبات في أقل من 5000 خلية لكل عينة لتمكين توليد بيانات الأيض من HSCs لفأر واحد12. في الوقت نفسه ، تسمح هذه الطريقة بتوليد نسخ متماثلة متعددة من فأر واحد لأنواع خلايا أكثر وفرة مثل الخلايا الليمفاوية. يقلل هذا النهج من عدد المطلوبة لمشروع معين ، وبالتالي يساهم في "3R" (الحد ، الاستبدال ، الصقل) للتجارب على.

يمكن أن يكون للمستقلبات في الخلايا معدلات دوران عالية جدا ، غالبا في حدودثوان 13. ومع ذلك ، فإن إعداد العينات لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) يمكن أن يستغرق ساعات ، ويمكن أن يستغرق فرز FACS نفسه من دقائق إلى ساعات ، مما يؤدي إلى تغييرات محتملة في الأيض بسبب الظروف غير الفسيولوجية. بعض الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول (مثل محلول تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم [ACK]) يمكن أن يكون لها تأثيرات مماثلة. يمكن أن تسبب هذه الحالات الإجهاد الخلوي وتؤثر على مستويات ونسب المستقلبات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى قياسات غير دقيقة أو متحيزة لعملية التمثيل الغذائي الخلوي14،15،16. يشار أحيانا إلى التغيرات الأيضية الناتجة عن تحضير العينة باسم فرز القطع الأثرية. يمكن أن تؤدي بروتوكولات الهضم الطويلة والكواشف القاسية التي قد تكون مطلوبة لإنتاج معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الصلبة أو الصلبة إلى تفاقم هذه المشكلة. تعتمد التغييرات التي يمكن أن تحدث على الأرجح على نوع الخلية وحالة المعالجة. لا تزال الطبيعة الدقيقة للتغيرات غير معروفة ، حيث لا يمكن قياس الحالة الأيضية للخلايا غير المضطربة في الأنسجة الحية.

يتضمن البروتوكول المقدم هنا العديد من الاختلافات الرئيسية مقارنة بالطرق التقليدية ، وهي استخدام 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم كسائل غمد ، والفرز مباشرة في محلول الاستخراج ، وحقن أحجام عينات كبيرة على كروماتوغرافيا السائل المحبة للماء - قياس الطيف الكتلي (HILIC-MS) ، واستخدام القياس الكمي المستهدف ، والاستخدام الصارم للمعايير الداخلية وضوابط الخلفية (الشكل 1). هذا البروتوكول لديه القدرة على الحفاظ على الاختلافات بين أنواع الخلايا وبين العلاج بالعقاقير ومراقبة المركبات إلى حد كبير12. حتى بالنسبة للخلايا المستزرعة ، فإنه يقارن بشكل إيجابي بالنهج البديلة ، مثل الطرد المركزي الأكثر رسوخا والإزالة اليدوية للطاف. ومع ذلك ، نظرا لاستمرار حدوث فرز القطع الأثرية ، يجب تفسير البيانات بحذر. على الرغم من هذا القيد ، يمثل البروتوكول تحسنا كبيرا في مجال التنميط الأيضي ، مما يسمح بقياسات أكثر دقة وشمولية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا الأولية النادرة12.

إن القدرة على قياس الملامح الأيضية الواسعة في الخلايا الأولية النادرة تفتح الباب أمام تجارب جديدة في البحوث الطبية الحيوية التي تشمل هذه الخلايا. على سبيل المثال ، ثبت أن التنظيم بوساطة التمثيل الغذائي في HSCs يؤثر على قدرة التجديد الذاتي للسكون ، مع آثار على فقر الدم وسرطان الدم11،17. في الخلايا السرطانية المتداولة المشتقة من المريض ، ظهرت اختلافات في التعبير عن الجينات الأيضية بين الورم والخلايا المجاورة18,19. يسمح هذا البروتوكول الآن للباحثين بدراسة هذه الاختلافات بشكل منهجي على مستوى التمثيل الغذائي ، والذي يعتبر عموما أقرب إلى النمط الظاهري الخلوي من التعبير الجيني.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء تربية وتربية جميع الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة حيوانية تقليدية في معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق (MPI-IE) وفقا للوائح السلطات المحلية (Regierungspräsidium Freiburg). تم القتل الرحيم للفئران باستخدام CO2 وخلع عنق الرحم من قبل موظفين مدربين على FELASA B وفقا للإرشادات واللوائح التي وافقت عليها لجنة رعاية التابعة ل MPI-IE والسلطات المحلية. لم يتم إجراء أي تجارب على ، وكانت الفئران بدون أعباء صحية.

ملاحظة: الطرق التحليلية عالية الحساسية مثل طريقة LC-MS المستخدمة في هذا البروتوكول لديها القدرة على اكتشاف حتى الملوثات البسيطة جدا في العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقليل هذه الملوثات. الإجراء الوحيد الأكثر أهمية هو ارتداء قفازات نظيفة عند لمس أي شيء يلامس العينات. ويشمل ذلك على سبيل المثال ، إعداد المخازن المؤقتة وسائل الغمد ، ووضع العلامات على أنابيب العينات ، وتنظيف معدات المختبرات. علاوة على ذلك ، يجب استخدام أدوات المختبر ذات الاستخدام الواحد كلما أمكن ذلك. يجب شطف الأواني الزجاجية بمذيبات من الدرجة LC-MS قبل الاستخدام. تساعد بيئة العمل النظيفة أيضا على تقليل التلوث.

1. الاستعدادات العامة

  1. تحضير محلول المخزون القياسي الداخلي: تحضير 6 مجم / مل كلورو فينيل ألانين (CLF) و 6 مجم / مل حمض أمينوتيريفتاليك (ATA) في 30٪ v / v 2-propanol في ماء عالي النقاء.
  2. تحضير مخزن إعادة التعليق FACS: أضف 0.9 جم من كلوريد الصوديوم ، و 99.5 مل من الماء عالي النقاء ، و 0.5 مل من محلول المخزون القياسي الداخلي. تبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  3. تحضير سائل الغمد: في خزان سائل غمد ، قم بإذابة 30 جم من كلوريد الصوديوم في 6 لتر من الماء منزوع الأيونات وقم بتوصيله بفارز خلوي.
    ملاحظة: تم تحسين تركيز كلوريد الصوديوم في سائل الغمد للسماح بانحراف القطرات في جهاز الفرز الذي يكون قويا كما هو الحال عند استخدام PBS كمائع غمد وفي نفس الوقت لتقليل الآثار السلبية على اكتشاف المستقلب بواسطة LC-MS12. التركيزات المنخفضة من كلوريد الصوديوم مفيدة للكشف عن المستقلب ولكنها تضعف الفرز القوي للخلايا.

2. عزل الخلايا البائية والتائية من الطحال

  1. قم بتبريد 90 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) لكل فأر في الثلاجة أو على الثلج إلى 4 درجات مئوية. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  2. عزل الطحال
    ملاحظة: من الأهمية بمكان العمل بسرعة ، على الجليد ، ومع المخازن المؤقتة الباردة (4 درجات مئوية) أثناء عزل الخلية وخطوات التلوين التالية. خلاف ذلك ، قد يتغير المظهر الأيضي للخلايا بشكل كبير.
    1. تحضير 1.5 mL من PBS في أنبوب تفاعل 2 mL على الجليد.
    2. القتل الرحيم للماوس C57BL6 / J وفقا للإرشادات والأساليب المعتمدة من قبل السلطات المحلية.
    3. تعقيم الفراء مع 70 ٪ من الإيثانول.
    4. افتح البطن بالمقص وأزل الطحال باستخدام ملقط ناعم دون تمزق العضو. ضع الطحال على الفور في برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية).
  3. توليد تعليق أحادي الخلية
    1. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ورطبها باستخدام برنامج تلفزيوني. مرر الطحال عبر الشبكة باستخدام مسند الإبهام لمكبس حقنة و 30 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية)
    2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة الطاف.
    3. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول تحلل ACK واحتضانها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 20 درجة مئوية).
    4. أضف 50 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية). أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة الطافية.
  4. تلطيخ FACS
    1. تحضير كوكتيل الأجسام المضادة في 500 ميكرولتر من PBS البارد (4 درجات مئوية) لكل ماوس: CD3-PE (1: 200) ، B220-A647 (1: 200).
    2. أعد تعليق بيليه الخلية في كوكتيل الأجسام المضادة. نقل إلى أنبوب 5 مل FACS. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
    3. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية). أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة الطافية.
    4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لإعادة تعليق FACS البارد (4 درجات مئوية). قم بتصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS بغطاء مرشح. الخلايا جاهزة للفرز القائم على قياس التدفق الخلوي.

3. عزل HSCs و MPPs من نخاع العظام

  1. تشريح وعزل نخاع العظام.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان العمل بسرعة والحفاظ على العظام المعزولة والخلايا باردة (4 درجات مئوية) أثناء الإجراء بأكمله للسماح بنتائج دقيقة. علاوة على ذلك ، لتقليل إشارات الخلفية ، اعمل واستخدم مساحة نظيفة ومعدات مختبرية.
    1. القتل الرحيم للفئران وفقا للمبادئ التوجيهية والأساليب المعتمدة من قبل السلطات المحلية.
    2. رش 70٪ إيثانول على الجزء السفلي من الفئران.
    3. تشريح الساقين والعمود الفقري باستخدام مقص. قم بعمل شق على الظهر وقم بتمديد الجرح إلى البطن. قشر الجلد من الأطراف الخلفية.
    4. مزق أو قطع الأطراف الخلفية ، وتأكد من احتواء الساقين على مفصل الساق وعظم الفخذ ومفصل الورك.
    5. خذ المقص واقطعه بالقرب من العمود الفقري حتى تتم إزالته تماما.
    6. قم بتوزيع الأرجل والعمود الفقري في 6 أطباق جيدة تحتوي على PBS بارد (4 درجات مئوية) واحتفظ بالألواح على الجليد.
    7. تنظيف عظم الفخذ والساق ومفصل الورك وفقرات الأنسجة الرخوة باستخدام مشرط ومقص.
    8. سحق العظام النظيفة بقذائف الهاون والمدقة في 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية).
    9. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.
    10. كرر الخطوات 3.1.8-3.1.9 حتى تظهر العظام بيضاء تماما.
  2. تحلل كريات الدم الحمراء:
    1. قم بطرد مركزي تعليق الخلية المحصودة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت ACK البارد (4 درجات مئوية). احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
    3. أضف برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية) لإيقاف التفاعل (اختياري).
    4. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  3. نضوب النسب:
    ملاحظة: لإثراء الخلايا السالبة (Lin-) ، تم استخدام مجموعة اختيار سلبية لخلايا CD4.
    1. تحضير الخرز المغناطيسي:
      1. أضف 500 ميكرولتر من الخرز إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل. ضع الأنابيب على مغناطيس وتخلص من المادة الطافية.
      2. اغسل الخرزات ب 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية) وتخلص من المادة الطافية.
      3. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية) وحافظ على برودة الخرز (4 درجات مئوية).
    2. احتضان الخلايا ب 500 ميكرولتر من كوكتيل النسب (50 ميكرولتر من الجسم المضاد الذي توفره المجموعة + 450 ميكرولتر من PBS) لمدة 25 دقيقة (الهز ، 4 درجات مئوية) في الظلام.
    3. اغسل الخلايا ببرنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية).
    4. قم بطرد الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق الخلايا في 1000 ميكرولتر من PBS البارد (4 درجات مئوية) وانقل تعليق الخلية إلى محلول الخرزة.
    6. احتضان لمدة 15 دقيقة على عجلة دوارة عند 4 درجات مئوية.
    7. ضع الأنابيب على مغناطيس وانتظر حتى يزول المحلول. انقل المادة الطافية إلى أنبوب FACS جديد.
    8. اغسل الخرز ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    9. ضع الأنابيب على مغناطيس وانتظر حتى يزول المحلول.
    10. انقل المادة الطافية إلى أنبوب FACS الجديد.
    11. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  4. تلطيخ ل FACS
    1. تحضير 300 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل فأر في برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية).
    2. مزيج الأجسام المضادة للخلايا الجذعية / السلفية: HSCs: CD4 (1: 1000) / CD8a (1: 1000) / B220 (1: 1000) / Ter119 (1: 500) / Gr-1 (1: 1000) / CD11b - PeCy7 (1: 1000) ، c-Kit - PE (1: 1000) ، Sca1 - APC-Cy7 (1: 500) ، CD48 - BV421 (1: 1000) ، CD150 - BV605 (1:300)
    3. احتضان الخلايا لمدة 40 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
    4. يغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد (4 درجات مئوية). جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لإعادة تعليق FACS وقم بتصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS بغطاء مرشح.

4. فرز FACS

  1. قم بإعداد فارز الخلايا.
    1. أدخل طرف فوهة 70 ميكرومتر. قم بتنشيط ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 633 نانومتر.
    2. اضبط وضع الفرز على 4 طرق النقاء: قناع العائد 0 ، قناع النقاء 32 ، قناع الطور 0
    3. اضبط تردد السقوط على 90400 هرتز ، واضبط السعة وتأخير السقوط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط جهد اللوحة على 5000 فولت.
    4. حدد بوابات الفرز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. لجميع أنواع الخلايا ، أولا ، حدد الخلايا المفردة بناء على إشارة التشتت الأمامي والتشتت الجانبي ، متبوعا بالتحديد بناء على التلوين الخاص بنوع الخلية.
      2. بالنسبة للخلايا البائية ، حدد السكان الموجب AF647 ، السالب PE.
      3. بالنسبة للخلايا التائية ، حدد السكان الموجب PE ، AF647 السلبي.
      4. بالنسبة إلى HSCs ، حدد السكان PE-Cy7 المنخفض ، و PE الإيجابي ، و APC-Cy7 الإيجابي ، و BV605 الإيجابي ، و BV421 - سلبي.
      5. بالنسبة إلى MPPs ، حدد السكان PE-Cy7 المنخفض ، الإيجابي PE ، APC-Cy7 الإيجابي ، BV421 الإيجابي ، BV605 السلبي.
      6. بالنسبة لعينات الحطام، حدد الأحداث الصغيرة جدا بحيث لا تمثل الخلايا السليمة بناء على إشارة التشتت الأمامي وإشارة التشتت الجانبي. ويظهر الشكل 2 والشكل 3 مخططات FACS النموذجية التي تبين استراتيجيات البوابات هذه.
    5. اضبط معدل التدفق للحصول على أقل من 15000 حدث / أحداث.
  2. تحضير لوحة التجميع
    1. تحضير محلول مخزون مستخلص الخميرة: أعد تعليق 1 حصة من مستخلص الخميرة 13C في 7.5 مل من H2O عالي النقاء و 2.5 مل من الميثانول.
    2. تحضير المخزن المؤقت للاستخراج: أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون مستخلص الخميرة 13درجة مئوية إلى 10 مل من الأسيتونيتريل واخلطه.
    3. تحضير لوحة التجميع: أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج إلى كل بئر من لوحة PCR 96 بئرا التي سيتم استخدامها لجمع العينة. لتقليل التبخر ، قم بتغطية الآبار بأغطية PCR (خطوط مقطعة إلى مفردات).
  3. قم بإجراء فرز الخلايا.
    1. افتح آبار التجميع حسب الحاجة لجمع الخلايا التي تم فرزها وإغلاقها في أسرع وقت ممكن لتقليل التبخر.
  4. إذا تعذر قياس العينات على الفور ، فقم بتخزينها في حاويات محكمة الغلق عند -80 درجة مئوية لعدة أيام. بعد ذوبان الجليد ، صوتنة العينات لمدة 5 دقائق لضمان إعادة التعليق الكامل للمستقلبات.

5. قياس LC-QQQ-MS

  1. تحضير مذيبات LC
    1. تحضير محلول مخزون حمض الميدرونيك (100 مللي مول): قم بإذابة 17.6 مجم من حمض الميدرونيك في 1 مل من H2O عالي النقاء.
    2. تحضير المخزن المؤقت A: قم بإذابة 1.92 جم من كربونات الأمونيوم في 1 لتر من H2O عالي النقاء ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول مخزون حمض ميدرونيك.
    3. تحضير المخزن المؤقت ب: امزج 50 مل من المخزن المؤقت مع 450 مل من الأسيتونيتريل.
    4. تحضير مزيج اختبار LC: امزج 1 جزء في المليون من كل من الليوسين والأيزولوسين و AMP و ADP و ATP في 80:20 الأسيتونيتريل: H2O عالي النقاء.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزون حمض Medronic في -20 درجة مئوية لعدة أشهر ؛ يمكن الاحتفاظ بالمخازن المؤقتة الأخرى في RT لمدة 2 أيام.
  2. برنامج LC-QQQ-MS طريقة
    1. قم بتحسين إعدادات MS الخاصة بالمركبة (على سبيل المثال ، طاقة الاصطدام) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لأجهزة السلسلة Agilent 6495 ، استخدم الإعدادات في الجدول التكميلي 1.
    2. قم بتحسين إعدادات MS الخاصة بالمصدر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة للأجهزة ذات مصدر ESI المسخن JetStream ، استخدم المعلمات التالية: درجة حرارة الغاز: 240 درجة مئوية ، تدفق الغاز: 15 لتر / دقيقة ، البخاخات: 50 رطل / بوصة مربعة ، درجة حرارة غاز الغمد: 400 درجة مئوية ، تدفق غاز الغمد: 11 لتر / دقيقة ، الجهد الشعري: 2000 فولت ، جهد الفوهة: 300 فولت.
    3. قم بتحسين إعدادات بصريات نقل الأيونات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لأجهزة Agilent ذات بصريات iFunnel ion ، استخدم المعلمات التالية: ارتفاع ضغط RF إيجابي: 110 فولت ، RF عالي الضغط سلبي: 90 فولت ، RF منخفض الضغط إيجابي: 80 فولت ، منخفض الضغط RF سلبي: 60 فولت.
    4. برمجة تدرج LC: 0 دقيقة ، 95٪ B ، 150 ميكرولتر / دقيقة ؛ 18 دقيقة ، 55٪ ب ، 150 ميكرولتر / دقيقة ؛ 19 دقيقة ، 30٪ ب ، 150 ميكرولتر / دقيقة ؛ 21.5 دقيقة ، 30٪ ب ، 150 ميكرولتر / دقيقة ؛ 22 دقيقة ، 95٪ ب ، 150 ميكرولتر / دقيقة ؛ 22.7 دقيقة ، 95٪ ب ، 200 ميكرولتر / دقيقة ، 23.5 دقيقة ، 95٪ ب ، 400 ميكرولتر / دقيقة ؛ وقت التوقف 28 دقيقة. درجة حرارة العمود: 35 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد أداة LC-MS.
    1. قم بتوصيل العمود الكروماتوغرافي في حجرة العمود التي يتم التحكم في درجة حرارتها.
    2. قم بتوصيل المخازن المؤقتة وتطهير جميع الخطوط.
    3. قم بتشغيل 4 عينات فارغة أو عينات تجمع على الأقل لموازنة العمود.
  4. قم بتشغيل مزيج اختبار LC للتحقق من الأداء الكروماتوغرافي. تأكد من استيفاء المعايير التالية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتنظيف الجهاز أو استكشاف الأخطاء وإصلاحها قبل تشغيل العينات.
    1. تأكد من أن الضغط العكسي الأولي هو <150 بار والحد الأقصى للضغط الخلفي هو <400 بار.
    2. تأكد من أن أوقات الاحتفاظ في نافذة ±1 دقيقة على النحو التالي: إيزولوسين 6.0 دقيقة ، ليسين 6.4 دقيقة ، AMP 9.5 دقيقة ، ADP 11.2 دقيقة ، و ATP 12.7 دقيقة.
    3. تأكد من أن الوادي بين الليوسين والإيزولوسين في الانتقال +132->86 هو < 20٪ من ارتفاع الذروة.
    4. تأكد من أن الفرق في وقت الاستبقاء AMP إلى ADP هو 1.5 إلى 1.9 دقيقة ، والفرق في وقت الاستبقاء ADP إلى ATP هو 1.1 إلى 1.9 دقيقة.
  5. إعداد قائمة العمل
    1. ابدأ بعينة فارغة لتقليل الترحيل من مزيج اختبار LC.
    2. قم بتشغيل العينات بترتيب عشوائي.
    3. انتهي بعينة فارغة لتنظيف العمود للتجارب المستقبلية.

6. المعالجة المسبقة للبيانات في automRm

ملاحظة: تناقش الخطوات التالية التحويل من .d إلى .mzML في msconvert ، وإعداد metabdb ، وتحميل البيانات والنماذج و metabdb ، والاستراتيجيات العامة لمراجعة الذروة اليدوية.

  1. قم بتحويل البيانات الأولية من تنسيق .d إلى تنسيق .mzML باستخدام ProteoWizard20 باستخدام الإعدادات التالية: دقة الترميز الثنائي: 32 بت ، مستويات MS 1-2 ، تحديد فهرس الكتابة ، استخدام ضغط zlib المحدد.
  2. ابدأ R.
  3. قم بتثبيت automRm21 وفقا لوثائق الحزمة (مطلوب مرة واحدة فقط قبل الاستخدام الأول).
  4. بدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية automRm في R: automRm :: automrm_gui ()
  5. معالجة دفعة ملفات .d في علامة التبويب عملية > دفعة معالجة.
    1. حدد .xlsx ملف يحتوي على معلومات الأيض. يجب أن يتطابق هذا الملف مع الأسلوب LC-QQQ-MS.
    2. اختار. ملف RData يحمل نموذج ML لاختيار الذروة.
    3. اختار. RData ملف يحمل نموذج ML للإبلاغ عن الذروة.
    4. حدد مجلد المشروع الذي يحتوي على ملفات .mzML.
    5. ابدأ المعالجة المسبقة للبيانات بالنقر فوق معالجة الدفعة.
  6. بعد الانتهاء من المعالجة المسبقة ، افتح peakoverview.pdf للتحقق من الكشف الصحيح عن القمم الكروماتوغرافية. اختياريا، قم بتحميل automRmdata_Review.RData من علامة التبويب مراجعة في واجهة المستخدم الرسومية التلقائية لتعديل تصفية الذروة وتكامل الذروة يدويا.
  7. افتح peakinfo.xlsx من مجلد المشروع وتحقق من البيانات.
    1. تحقق من الإشارة القياسية الداخلية 13C في علامة التبويب 13CArea: تأكد من عدم وجود اختلافات منهجية في قيم الشدة بين المجموعات التجريبية وبين عينات الخلايا وعينات الحطام. في حالة وجود مثل هذه الاختلافات ، استخدم فقط البيانات من علامات التبويب NormArea أو NormHeight للتحليل اللاحق ؛ بخلاف ذلك ، استخدم البيانات من علامات التبويب RawArea أو RawHeight.
    2. تحقق من شدة إشارة المعايير الداخلية ATA و CLF في علامة التبويب RawArea. تأكد من عدم وجود فروق منهجية في شدة أي من المركبين بين المجموعات التجريبية.
    3. لكل مستقلب ، قارن شدة إشارة العينات التي تحتوي على خلايا بعينات الحطام من نفس تعليق الخلية. استخدم اختبارا إحصائيا مناسبا لتحديد المستقلبات التي يكون فيها للعينات التي تحتوي على خلايا كثافة أعلى من عينات الحطام. قم فقط بتضمين المستقلبات التي تجتاز هذا الاختبار في تحليل البيانات اللاحق.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح فرز FACS عزل المجموعات السكانية النظيفة من أنواع الخلايا المختلفة من نفس تعليق الخلية (الشكل 2 والشكل 3). تعتمد خصوصية هذه الطريقة على تلطيخ أنواع الخلايا المختلفة بعلامات سطحية محددة (على سبيل المثال ، الخلايا البائية والخلايا التائية من الطحال) أو مجموعات محددة من علامات السطح (على سبيل المثال HSCs و MPPs). يتطلب تلطيخ العلامات داخل الخلايا عادة نفاذية غشاء الخلية. هذا يمكن أن يسبب تسرب الأيضات ، وبالتالي هذا النوع من تلطيخ غير مناسب للاستخدام في هذا البروتوكول.

يوفر LC فصل المستقلبات قبل اكتشافها بواسطة MS (الشكل 4). تنحرف المستقلبات من عمود HILIC مرتبة تقريبا حسب القطبية ، مع وجود مركبات قطبية أقل تسحب مبكرا والمزيد من المستقلبات القطبية في وقت لاحق. يتم تحديد شدة الإشارة من خلال كمية المستقلب المستهدف في العينة وعامل استجابة خاص بالأيض. وبالتالي ، لا يمكن مقارنة شدة الإشارة بشكل هادف عبر المستقلبات ولكن فقط لمستقلب واحد عبر العينات. تمثل القمم الثلاث التي تم إبرازها في الشكل 4 1: يتم اكتشاف النياسيناميد في كل من الحطام ومستخلص الخلايا ، وإن كان على مستويات مختلفة ، 2: أسيتيل كارنيتين الذي يتم اكتشافه بشكل حصري تقريبا في مستخلصات الخلايا ، و 3: حمض الأمينوتيريفاتاليك القياسي الداخلي الذي يتم اكتشافه على نفس المستوى في عينات الحطام ومستخلصات الخلايا.

يتم الحفاظ على الاختلافات الأيضية بين أنواع الخلايا من نفس النسيج باستخدام بروتوكول FACS-LC-MS المدمج (الشكل 5). بالنسبة ل HSCs و MPPs ، كانت هناك حاجة إلى خلايا من 6 فئران لتوليد 6 عينات ، مما أدى إلى تباين أكبر داخل كل مجموعة مقارنة بالخلايا البائية والخلايا التائية ، والتي تم فرزها من نفس طحال الفئران. يتم فصل عينات الحطام التي تمثل عينات التحكم الفارغة للعملية بوضوح عن العينات التي تحتوي على مستخلصات الخلايا. داخل عينات الحطام ، يظهر فصل واضح بين التجربتين ، مما يسلط الضوء على الاختلاف في البيئة الأيضية التي تواجهها الخلايا قبل الفرز. عند تمثيلها في خريطة حرارية مجمعة (الشكل 6) ، تصبح المعلومات الإضافية مرئية ، مثل المستويات النسبية للمستقلبات عبر العينات.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على الخطوات الرئيسية للبروتوكول المقدم. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Schoenberger et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عزل تجمعات نقية من الخلايا البائية والخلايا التائية عن الطحال. تم اختيار الخلايا وأحداث الحطام بناء على إشارات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). تم اختيار الخلايا البائية والخلايا التائية بناء على إشارات تلطيخ خاصة بنوع الخلية. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Schoenberger et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: عزل HSC وMPP من نخاع العظم. تم اختيار الخلايا وأحداث الحطام بناء على إشارات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). تم اختيار مجموعات HSC و MPP بناء على مراحل متعددة من إشارات التلوين الخاصة بنوع الخلية. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Schoenberger et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مثال على الكروماتوجراماتو. عينات تحتوي على (أ) 5000 HSCs و (ب) 5000 حدث حطام من نفس النوع. لاحظ أن المحور يشترك في نفس المقياس في كلتا اللوحتين. المستقلبات المميزة هي 1: نيكوتيناميد ، 2: أسيتيل كارنيتين ، 3: حمض أمينوتيريفتاليك (ATA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل المكونات الرئيسية (PCA) للملامح الأيضية لأنواع الخلايا المختلفة وعينات خلفية الحطام من نفس التجارب. لوحظ فصل كبير بين الأعضاء المختلفة وعينات خلفية الحطام من أي عضو. بالإضافة إلى ذلك ، يتم فصل أنواع الخلايا بوضوح داخل خلايا كل عضو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: خريطة حرارية تمثل المستقلبات المقاسة عبر أنواع الخلايا المختلفة ومطابقة عينات التحكم في الخلفية (الحطام). تم احتساب القيم المفقودة مع نصف القيمة الدنيا لنفس المستقلب عبر جميع العينات. للتخطيط ، تم تطبيع البيانات إلى الحد الأقصى بشكل منفصل في كل صف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: يسرد الجدول الإعدادات الخاصة بالمركب للمستقلبات المحددة ، بما في ذلك وقت الاحتفاظ (RT) ، والقطبية (Pol) ، والسلائف m / z (Q1) ، والشظية m / z (Q3) ، وطاقة الاصطدام (CE). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أهم الخطوات للتنفيذ الناجح للمستقلبات المستهدفة باستخدام هذا البروتوكول هي 1) استراتيجية تلطيخ وبوابات قوية من شأنها أن تنتج مجموعات خلايا نظيفة 2) معالجة دقيقة لأحجام السائل ، 3) توقيت قابل للتكرار لجميع الخطوات التجريبية ، ولا سيما جميع الخطوات قبل استخراج الأيض. من الناحية المثالية ، يجب معالجة جميع العينات التي تنتمي إلى تجربة واحدة وقياسها في دفعة واحدة لتقليل تأثيرات الدفعات22. بالنسبة للتجارب الأكبر حجما ، نقترح جمع مستخلصات الخلايا عند -80 درجة مئوية ثم قياس جميع المستخلصات في دفعة واحدة.

عند العمل مع عينات منخفضة المدخلات ، يجب التأكيد على المعالجة النظيفة لجميع المواد المستخدمة في سياق التجارب23. الملوثات الشائعة هي العازلة المتبقية والمنظفات ومنتجات العناية بالبشرة. أهم إجراء لتقليل التلوث هو استخدام القفازات المناسبة طوال التجربة.

لتقليل التغيرات المحتملة في تكوين الأيض بسبب تعرض الخلايا لظروف غير فسيولوجية ، من الضروري تحضير العينات على الجليد ومع الكواشف الباردة (4 درجات مئوية) أمر بالغ الأهمية. أيضا ، فإن السرعة الممكنة قبل خطوة FACS ستزيد من جودة القياس2. الأوقات المحددة لتلطيخ الأجسام المضادة قصيرة بقدر ما هي معقولة لكفاءة تلطيخ جيدة. يمكن إضافة خطوة إضافية لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بمستقبلات Fc باستخدام الأجسام المضادة لكتلة Fc قبل إجراء تلطيخ FACS24,25. هذا يمنع تلوث مجموعات الخلايا المستهدفة وينصح به بشكل خاص عند العمل مع معلقات الخلايا التي تشمل العديد من أنواع الخلايا العالية مستقبلات Fc (مثل الخلايا الوحيدة أو البلاعم) أو الخلايا التي تم استزراعها بدون مصل. ومع ذلك ، فإنه سيزيد من وقت المناولة الإجمالي بمقدار 10-15 دقيقة ، وبالتالي قد يضيف تباينا غير فسيولوجي إضافي للنتائج.

باستخدام طرق MRM الديناميكية على مطياف الكتلة الحديث ، يمكن تسجيل جميع المستقلبات المدرجة في إعدادات خاصة بالمركبات بحقنة واحدة. يسمح الحد من عدد المستقلبات المستهدفة بتنفيذ البروتوكول الموصوف على مقاييس الطيف الكتلي القديمة ويسرع المعالجة المسبقة للبيانات وتحليل البيانات.

مستوى معين من إشارة الخلفية في بيانات LC-MS أمر لا مفر منه. لذلك ، يجب توخي الحذر الشديد لتحديد تلك المستقلبات التي يمكن اكتشافها فوق الخلفية. يؤدي فرز الأحداث الصغيرة جدا بحيث لا تمثل الخلايا السليمة (الحطام) إلى إنشاء عينات فارغة ذات صلة بالعملية تمثل شدة إشارة الخلفية المعتمدة على المصفوفة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح المعايير الداخلية بتحديد العينات الإشكالية التي يجب استبعادها من تحليل البياناتالإضافي 26. يعمل كلا تدبيري ضمان الجودة بشكل أفضل إذا توفر عدد كبير بما فيه الكفاية من النسخ المكررة. نوصي باستخدام ستة نسخ متماثلة على الأقل لكل مجموعة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا منشأة التابعة لمعهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم التخلق على توفير المستخدمة في هذه الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
13< / sup>C مستخلص الخميرةحلول النظائرISO-1
40 & micro ؛ مصفاة الخلايا mCorning352340
Acetonitrile ، LC-MS gradeVWR83640.32
ACK تحلل عازلةGibco104921بدلا من ذلك: Lonza ، Cat # BP10-548E
ثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP)Sigma AldrichA2754
الأدينوسين أحادي الفوسفات (AMP)Sigma AldrichA1752
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)كربونات الأمونيوم Sigma AldrichA2383
، درجة HPLCFisher ScientificA / 3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC العمود (100 × 2.1 مم ، 1.7 وميكرو ؛ م)Waters186009982
B220-A647Invitrogen103226
B220-PE / Cy7BioLegend103222RRID: AB_313005
CD11b-PE / Cy7BioLegend101216RRID:
AB_312799 CD150-BV605BioLegend115927RRID: AB_11204248
CD3-PEInvitrogen12-0031-83
CD48-BV421BioLegend103428RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7BioLegend100422RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7BioLegend100722RRID:AB_312761
cKit-PEBioLegend105808RRID:AB_313217
مجموعة خلايا CD4 الماوس التي لم تمسها Dynabeads Invitrogen11415D
FACSAria IIIBD
Gr1-PE / Cy7BioLegend108416RRID: AB_313381
رقائق الختم الحراريNeolabJul-18
IsoleucineSigma Aldrich58880
JetStream ESI SourceAgilentG1958B
LeucineSigma AldrichL8000
حمض الميدرونيكسيجما ألدريتشM9508-1G
ميثانول ، LC-MS الصفكارل روثHN41.2
كلوريد الصوديومفلوكا31434-1 كجم
PBSسيجما ألدريتشD8537
Sca1-APC / Cy7BioLegend108126RRID:
AB_10645327 TER119-PE / Cy7BioLegend116221RRID: AB_2137789
مطياف الكتلة ثلاثي رباعي الأقطابAgilent6495B
Twin.tec PCR لوحة 96 بئر LoBindEppendorf30129512
UHPLC AutosamplerAgilentG7157B
UHPLC ترموستات عمودAgilentG7116B
UHPLC مضخةAgilentG7120A
UHPLC عينة ترموستاتAgilentG4761A

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023).
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927(2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980(2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237(2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59(2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546(2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة