مقالة منهجية

تصوير الخلايا الحية المتعددة للاستجابات الدوائية في النماذج العضوية المشتقة من المريض للسرطان

2.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

يناير 5, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

عضويات الورم المشتقة من المريض هي نظام نموذجي متطور للبحوث الأساسية والانتقالية. توضح مقالة الطرق هذه بالتفصيل استخدام تصوير الخلايا الحية الفلورية المتعددة للتقييم الحركي المتزامن للأنماط الظاهرية العضوية المختلفة.

الملخص

نماذج السرطان العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي نظام بحث متعدد الوظائف يلخص بشكل أفضل الأمراض البشرية مقارنة بخطوط الخلايا السرطانية. يمكن إنشاء نماذج شركة تنمية نفط عمان عن طريق زراعة الخلايا السرطانية للمريض في مستخلصات الغشاء القاعدي خارج الخلية (BME) وطلاءها على شكل قباب ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، فإن الكواشف المتاحة تجاريا والتي تم تحسينها لمقايسات النمط الظاهري في الثقافات أحادية الطبقة غالبا ما تكون غير متوافقة مع BME. هنا ، نصف طريقة للوحة نماذج PDO وتقييم آثار الدواء باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، نطبق أصباغ الفلورسنت المتوافقة مع القياسات الحركية لتحديد صحة الخلية وموت الخلايا المبرمج في وقت واحد. يمكن تخصيص التقاط الصور ليحدث على فترات زمنية منتظمة على مدار عدة أيام. يمكن للمستخدمين تحليل تأثيرات الدواء في صور Z-plane الفردية أو إسقاط Z للصور التسلسلية من مستويات بؤرية متعددة. باستخدام التقنيع ، يتم حساب معلمات محددة ذات أهمية ، مثل رقم PDO والمساحة وشدة التألق. نحن نقدم بيانات إثبات المفهوم التي توضح تأثير العوامل السامة للخلايا على صحة الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، والجدوى. يمكن توسيع منصة التصوير الحركي الآلي هذه لتشمل قراءات النمط الظاهري الأخرى لفهم الآثار العلاجية المتنوعة في نماذج PDO للسرطان.

المقدمة

تظهر عضويات الورم المشتقة من المريض (PDOs) بسرعة كنظام نموذجي قوي لدراسة تطور السرطان والاستجابات العلاجية. PDOs هي أنظمة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تلخص الملف الجينومي المعقد وبنية الورم الرئيسي 1,2. على عكس الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) لخطوط الخلايا السرطانية الخالدة ، تلتقط PDOs وتحافظ على عدم التجانس داخل الورم 3,4 ، مما يجعلها أداة قيمة لكل من البحث الميكانيكي والانتقالي. على الرغم من أن PDOs أصبحت نظاما نموذجيا شائعا بشكل متزايد ، إلا أن الكواشف المتاحة تجاريا وطرق التحليل للتأثيرات الخلوية المتوافقة مع ثقافات شركة تنمية نفط عمان محدودة.

إن عدم وجود طرق قوية لتحليل التغييرات الطفيفة في الاستجابة للعلاج يعيق الترجمة السريرية. يستخدم كاشف صحة الخلية القياسي الذهبي في الثقافات ثلاثية الأبعاد ، CellTiter-Glo 3D ، مستويات ATP كمحدد لصلاحية الخلية 5,6. في حين أن هذا الكاشف مفيد لفحوصات نقطة النهاية ، إلا أن هناك العديد من المحاذير ، وأبرزها عدم القدرة على استخدام العينات لأغراض أخرى بعد الانتهاء من الفحص.

تصوير الخلايا الحية هو شكل متطور من الفحص المجهري الحركي الذي ، عند دمجه مع الكواشف الفلورية ، لديه القدرة على تحديد مجموعة متنوعة من قراءات صحة الخلايا ضمن نماذج PDO ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج7،8،9 والسمية الخلوية10. في الواقع ، كان تصوير الخلايا الحية جزءا لا يتجزأ من الفحص عالي الإنتاجية للمركبات في منصات 2D 11,12. جعلت أنظمة مثل Incucyte التكنولوجيا ميسورة التكلفة وبالتالي في متناول مجموعات البحث في مجموعة متنوعة من الإعدادات. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذه الأنظمة لتحليل ثقافات 3D لا يزال في مهده.

هنا ، نصف طريقة لتقييم الاستجابة الدوائية في نماذج PDO للسرطان باستخدام تصوير الخلايا الحية المتعددة (الشكل 1). من خلال تحليل صور المجال الساطع ، يمكن مراقبة التغييرات في حجم شركة تنمية نفط عمان ومورفولوجيتها حركيا. علاوة على ذلك ، يمكن قياس العمليات الخلوية في وقت واحد بمرور الوقت باستخدام الكواشف الفلورية ، مثل Annexin V Red Dye لموت الخلايا المبرمج و Cytotox Green Dye للسمية الخلوية. تم تحسين الطرق المقدمة لنظام تصوير الخلايا الحية Cytation 5 ، ولكن يمكن تكييف هذا البروتوكول عبر منصات تصوير الخلايا الحية المختلفة.

البروتوكول

تمت مراجعة الدراسات التي تستخدم عينات الورم البشري والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة أيوا (IRB) ، البروتوكول #201809807 ، وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة. تشمل معايير التضمين تشخيص السرطان وتوافر عينات الورم.

1. طلاء PDOs سليمة في لوحة 96 بئر

  1. تحضير الكواشف.
    1. سخن ألواح 96 بئرا عند 37 درجة مئوية طوال الليل وقم بإذابة BME طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإعداد وسائط ثقافة عضوية كاملة محسنة لزراعة نوع السرطان محل الاهتمام. وترد في الجدول التكميلي 1 وسائط استزراع محددة مستخدمة للتجارب المبينة هنا.
      ملاحظة: قد تحتاج مكونات الوسائط إلى التعديل لأنواع الأورام المختلفة. على سبيل المثال ، يتم استكمال وسائط الثقافة العضوية مع استراديول 100 نانومتر لأورام النساء13. الوسائط المعدة مستقرة عند 4 °C لمدة 1 شهر. للتخزين طويل الأجل ، قم بتقسيم الوسائط إلى أنابيب سعة 50 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير حصتين منفصلتين من وسائط الاستزراع العضوي عند 4 درجات مئوية و 37 درجة مئوية. على سبيل المثال ، إذا تم طلاء 60 بئرا في صفيحة 96 بئرا ، فاستخدم 6 مل من وسائط الاستزراع العضوي الدافئ و 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع العضوي الباردة الجليدية.
  3. تحضير عازلة للغسيل العضوي: تكملة 1x PBS مع 10 mM HEPES ، 1x Glutamax ، 5 mM EDTA ، و 10 μM Y-27632. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
  4. حصاد PDOs المستزرعة في لوحة 24 بئر. نفذ جميع الخطوات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. نضح الوسائط من كل بئر باستخدام نظام خط التفريغ.
    2. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل العضوي المثلج البارد وماصة بلطف 2-3x باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. احتضان الطبق على الجليد لمدة 10 دقائق.
    3. انقل محتويات كل بئر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. للتأكد من أن جميع PDOs معلقة ، اشطف كل بئر ب 300 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للغسيل العضوي وانقله إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية
    4. نضح المادة الطافية من BME / الحبيبات العضوية باستخدام نظام خط فراغ ، وترك ~ 5 مل المتبقية في الأنبوب. أضف 20 مل من المخزن المؤقت للغسيل العضوي وأعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
    5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية. نضح المادة الطافية بنظام خط فراغ ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات PDO.
  5. طلاء PDOs في لوحة 96 بئرا: قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. أعد تعليق حبيبات PDO في كمية مناسبة من وسائط الاستزراع العضوي المثلج البارد لإنشاء تعليق PDO. انقل تعليق PDO إلى أنبوب طرد مركزي صغير بارد سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: لحساب كمية وسائط الاستزراع العضوي ، حدد عدد الآبار التي سيتم طلاؤها في صفيحة 96 بئرا ، مع الأخذ في الاعتبار أن PDOs مطلية في قبة 5 ميكرولتر بنسبة 1: 1 من وسائط الاستزراع العضوي و BME. على سبيل المثال ، عند طلاء لوحة واحدة من 96 بئرا واستخدام 60 بئرا داخلية فقط ، فإن إجمالي كمية تعليق PDO المطلوبة سيكون 300 ميكرولتر: 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع العضوي و 150 ميكرولتر BME. بالنسبة للنماذج التي تظهر نموا مثاليا بنسب مختلفة من BME ، يمكن تعديل نسبة BME: الوسائط في هذه الخطوة ، على الرغم من أنه من المهم توحيد النسبة عبر جميع المقايسات لكل نموذج محدد. لحساب خطأ السحب ، أضف حجما بنسبة 10٪ لكل مكون.
    2. احسب عدد PDOs.
      1. انقل 2.5 ميكرولتر من معلق PDO إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد سعة 1.5 مل واخلطه مع 2.5 ميكرولتر من BME. انقل الخليط سعة 5 ميكرولتر إلى شريحة مجهر زجاجية نظيفة. لا تغطي الشريحة. سوف يتجمد الخليط في قبة.
      2. تصور باستخدام مجهر المجال الساطع في 4x. حساب عدد PDOs في خليط 5 ميكرولتر ؛ الهدف هو الحصول على ما يقرب من 25-50 PDOs لكل قبة 5 ميكرولتر.
        ملاحظة: إذا لم يتم تحقيق الكثافة المطلوبة في خليط الاختبار ، فاضبط الحجم النهائي لتعليق PDO إما عن طريق إضافة المزيد من وسائط الاستزراع العضوي أو الطرد المركزي لتعليق PDO وتعليق حبيبات PDO في حجم أقل من وسائط الاستزراع العضوي المثلج البارد. بغض النظر عن كيفية تعديل تعليق PDO في هذه الخطوة ، فإن النسبة النهائية لتعليق BME: PDO في الخطوة 1.5.3. يجب أن يكون 1: 1.
    3. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع أطراف تجويف عريضة ، امزج تعليق PDO بعناية مع كمية متساوية من BME لتحقيق نسبة 1: 1 من وسائط الاستزراع العضوي إلى BME. تجنب الفقاعات ، والتي من شأنها تعطيل سلامة القباب.
    4. باستخدام ماصة 20 ميكرولتر ، يتم زرع قباب 5 ميكرولتر في وسط كل بئر من صفيحة 96 بئرا مسخنة مسبقا ، مع بذر 60 بئرا داخليا فقط. لضمان التوزيع المتساوي ل PDOs ، قم بسحب محتويات الأنبوب سعة 1.5 مل بشكل دوري باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع أطراف عريضة التجويف.
    5. بعد أن يتم زرع جميع الآبار ، ضع الغطاء على اللوحة واقلبها برفق. احتضان الصفيحة المقلوبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة للسماح للقباب بالتصلب.
      ملاحظة: يضمن عكس اللوحة أن قبة وسائط BME / الثقافة العضوية تحتفظ بهيكل 3D لتوفير مساحة كافية لتشكيل PDO.
    6. اقلب الطبق بحيث يكون جالسا مع رفع الغطاء واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.

2. العلاجات وإضافة الأصباغ الفلورية لتعدد الإرسال

  1. بينما تتصلب قباب BME في صفائح 96 بئرا ، قم بإعداد تخفيفات كواشف تصوير الخلايا الحية الفلورية. وترد هنا معلمات محددة لتعدد الإرسال Annexin V Red Dye و Cytotox Green Dye.
  2. تحضير الكاشف الفلوري (اليوم -1): احسب الحجم المناسب لوسائط الاستزراع العضوي بناء على عدد الآبار المراد معالجتها ، بافتراض أن كل بئر ستتم معالجته ب 100 ميكرولتر من الوسائط ذات الجرعات الصبغية. تمييع صبغة في وسائط الثقافة العضوية قبل التسخين إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: سيختلف إجمالي كمية الوسائط المطلوبة حسب التجربة. أضف 10٪ إلى الحجم النهائي لحساب خطأ الماصة. على سبيل المثال ، لمعالجة 60 بئرا داخلية لصفيحة 96 بئرا ، قم بإعداد 6.6 مل من الوسائط ذات الجرعات الصبغية (الجدول 1).
  3. عالج كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة العضوية ذات الجرعات الصبغية. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS المعقم إلى الآبار الفارغة الخارجية للوحة. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يقلل PBS في الآبار الطرفية من تبخر الوسائط من الآبار الداخلية.
  4. إضافة الأدوية / عوامل العلاج (اليوم 0): تحضير الأدوية في وسائط استزراع عضوي تم تسخينها مسبقا بتركيز 2x بحجم 100 ميكرولتر لكل بئر.
    ملاحظة: يمكن أن يكون DMSO ساما للخلايا بتركيزات عالية. لم يتم تجاوز تركيز 0.1٪ DMSO في التجارب التي أجريت في هذه الدراسة. بالإضافة إلى الأدوية ، يتم توزيع بعض الكواشف الفلورية كحل DMSO. من المهم حساب التركيز الكلي DMSO عند العمل مع هذه الكواشف.
  5. أضف 100 ميكرولتر من 2x وسائط مداوية بالصبغة إلى كل بئر ؛ تجنب خلق فقاعات.

3. إعداد معلمات التصوير

  1. ضع اللوحة في Cytation 5. مفتوح برنامج Gen5. انقر فوق مهمة جديدة > الوضع اليدوي للتصوير. حدد Capture Now وأدخل الإعدادات التالية: الهدف (حدد التكبير المطلوب) ؛ مرشح (حدد الصفيحة الدقيقة) ؛ شكل الصفيحة الدقيقة (حدد عدد الآبار) ؛ ونوع السفينة (حدد نوع اللوحة). انقر فوق استخدام الغطاء واستخدام سرعة حاملة أبطأ. انقر فوق موافق.
    ملاحظة: نوع السفينة: كن محددا قدر الإمكان عند اختيار معلومات حول اللوحة لأن البرنامج تمت معايرته إلى المسافة المحددة من الهدف إلى أسفل اللوحة لكل نوع لوحة وسمك البلاستيك.
    سرعة الناقل الأبطأ: حدد هذا المربع لتجنب تعطيل القباب عند تحميل / تفريغ اللوحات.
  2. قم بإنشاء Z-Stack الذي سيصور قبة BME بأكملها.
    1. حدد بئرا ذات أهمية لعرضها (اللوحة اليسرى ، أسفل الرسم البياني).
    2. حدد قناة الحقل الساطع (اللوحة اليسرى ، أعلى). انقر فوق التعريض التلقائي واضبط الإعدادات حسب الحاجة.
    3. اضبط الجزء السفلي والعلوي من علامة التبويب Z-Stack: توسيع وضع التصوير (اللوحة اليسرى ، المنتصف). حدد مربع Z-Stack . باستخدام أسهم ضبط المقرر الدراسي (اللوحة اليسرى ، المنتصف) ، انقر فوق الضبط لأسفل حتى تدخل جميع PDOs ثم تخرج عن التركيز وتكون غامضة. قم بتعيين هذا الجزء السفلي من Z-Stack. كرر في الاتجاه المعاكس باستخدام أسهم ضبط المسار لتعيين الجزء العلوي من Z-Stack.
    4. للتأكد من أن إعدادات Z-Stack مناسبة للآبار الأخرى ذات الأهمية ، حدد بئرا آخر (اللوحة اليسرى ، أسفل الرسم البياني) وتصور الجزء العلوي والسفلي من Z-Stack.
    5. لإدخال المواضع البؤرية يدويا ، انقر فوق النقاط الثلاث بجوار الضبط الدقيق (اللوحة اليسرى ، أعلى). سيتم فتح نافذة. اكتب في أعلى قيمة Z-Stack (الموجودة في اللوحة اليمنى، في المنتصف، ضمن وضع التصوير). كرر لقيمة Z-Stack السفلية. اضبط حسب الضرورة لالتقاط نطاق Z المطلوب بتكرار الخطوة 3.2.3. إذا كانت التعديلات ضرورية ، فحدد بئرا آخر للتحقق من الإعدادات.
  3. اضبط إعدادات التعرض لقناة (قنوات) الفلورسنت. يتم وصف الإعدادات لقناتي فلورسنت (GFP و TRITC). يعتمد العدد المحدد لقنوات الفلورسنت على التجربة ومكعبات الفلورسنت المثبتة في نظام تصوير الخلايا الحية.
    ملاحظة: إذا كان من المتوقع أن تكون شدة الإشارة أعلى بكثير في نهاية التجربة ، فيجب على المستخدمين التفكير في إجراء تجارب اختبار لتحديد إعدادات التعرض المثلى في نهاية التجربة والتي يمكن تطبيقها بعد ذلك عند إعداد المعلمات الأولية.
    1. قم بتوسيع علامة التبويب وضع التصوير (اللوحة اليسرى ، في المنتصف) وافتح تحرير خطوة التصوير. ستظهر نافذة منبثقة.
    2. ضمن القنوات ، انقر فوق الفقاعة للحصول على العدد المطلوب من القنوات. عين قناة واحدة للمجال الساطع وقنوات إضافية لكل قناة فلورسنت. في هذا المثال ، القناة 1 = حقل ساطع ؛ القناة 2 = هيئة أجيال السلام ؛ القناة 3 = TRITC. باستخدام القوائم المنسدلة Color ، حدد الإعداد المناسب لكل قناة. أغلق نافذة التحرير بالنقر فوق موافق.
    3. قم بإعداد كل قناة فلورسنت.
      1. قم بتبديل القناة إلى GFP (اللوحة اليسرى ، أعلى).
      2. انقر فوق التعريض التلقائي (اللوحة اليسرى ، أعلى). قم بتوسيع علامة التبويب التعرض (اللوحة اليسرى ، المنتصف) واضبط إعدادات التعريض الضوئي لتقليل إشارة الخلفية.
      3. انسخ إعدادات التعرض إلى علامة تبويب وضع الصورة باتباع الخطوات 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. انقر فوق رمز النسخ بجوار مربع تحرير خطوة التصوير . انقر فوق تحرير خطوة التصوير ، والتي ستفتح نافذة أخرى.
      5. ضمن قناة GFP، انقر أيقونة الحافظة في خط التعريض الضوئي لإضافة إعدادات الإضاءة ووقت التكامل وكسب الكاميرا إلى القناة.
      6. كرر الخطوات 3.3.3.4-3.3.3.5 لقناة TRITC. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
  4. قم بإعداد خطوات المعالجة المسبقة للصور و Z-projection لأتمتة المعالجة المسبقة للصور.
    1. انقر على أيقونة الكاميرا (اللوحة اليسرى ، الزاوية السفلية). سيتم فتح نافذة جديدة.
    2. ضمن إضافة خطوة معالجة (اللوحة اليسرى ، أسفل) ، انقر فوق المعالجة المسبقة للصور. سيتم فتح نافذة جديدة.
    3. في صفحة الحقل الساطع ، قم بإلغاء تحديد تطبيق المعالجة المسبقة للصور.
    4. لكل علامة تبويب قناة فلورسنت ، تأكد من تحديد تطبيق المعالجة المسبقة للصور . قم بإلغاء تحديد استخدام نفس خيارات القناة 1 وانقر موافق. سيتم إغلاق النافذة.
    5. ضمن إضافة خطوة معالجة ، انقر فوق Z Projection. سيتم فتح نافذة جديدة. إذا رغبت في ذلك ، اضبط نطاق الشريحة (على سبيل المثال ، لتضييق نطاق Z). أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
  5. إنشاء بروتوكول.
    1. انقر فوق مجموعة الصور في شريط الأدوات. في القائمة المنسدلة، انقر على إنشاء تجربة من مجموعة الصور هذه. سيتم إغلاق نافذة التصوير ، وسيتم فتح نافذة الإجراء .
      ملاحظة: سيتم تحميل المعلمات المحددة في وضع التصوير اليدوي تلقائيا في النافذة الجديدة، حيث يمكن إنشاء بروتوكول تجريبي.
    2. ضبط درجة الحرارة والتدرج: انقر على ضبط درجة الحرارة أسفل عنوان الإجراءات (يسار). سيتم فتح نافذة جديدة. حدد تشغيل الحاضنة وأدخل درجة الحرارة المطلوبة يدويا ضمن درجة الحرارة. بعد ذلك ، ضمن التدرج ، أدخل 1 يدويا. أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
      ملاحظة: سيؤدي إنشاء تدرج 1 درجة مئوية إلى منع التكثيف من التكون على غطاء اللوحة.
    3. تعيين الآبار للصورة.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق خطوة الصورة ضمن الوصف. انقر فوق لوحة كاملة (الزاوية اليمنى ، أعلى). سيؤدي هذا إلى فتح نافذة تخطيط اللوحة .
      2. تسليط الضوء على الآبار ذات الأهمية باستخدام المؤشر. انقر فوق موافق. إذا رغبت في ذلك، حدد مربعات تجميع التركيز البؤري التلقائي وتجميع الالتقاطات . انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
        ملاحظة: سيتطلب Binning تعديل التعرض، كما هو موضح في الخطوة 3.3.3.2 أعلاه. يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمعرفة سيناريوهات محددة يمكن استخدام هذه الميزة فيها.
    4. تعيين فترات للتصوير الحركي.
      1. انقر فوق خيارات تحت عنوان أخرى (يسار). حدد مربع الإجراء الحركي المتقطع .
      2. ضمن الوقت الإجمالي المقدر، أدخل وقت التشغيل للتجربة (على سبيل المثال، 5 أيام). ضمن الفاصل الزمني المقدر، أدخل الفاصل الزمني لتصوير اللوحة (على سبيل المثال، كل 6 ساعات).
      3. انقر فوق إيقاف مؤقت بعد كل تشغيل لإتاحة الوقت لنقل اللوحة إلى الحاضنة. أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
    5. تحديث خطوات تقليل البيانات.
      1. انقر فوق موافق لإغلاق إطار الإجراء. سيتم فتح علامة تبويب لتحديث خطوات تقليل البيانات. حدد نعم. انقر نقرا مزدوجا فوق المعالجة المسبقة للصور. انقر فوق القنوات المختلفة للتحقق من الإعدادات وانقر فوق موافق.
      2. انقر نقرا مزدوجا فوق Z Projection. انقر فوق القنوات المختلفة للتحقق من الإعدادات. انقر فوق موافق. ثم ، انقر فوق "موافق " مرة أخرى لإغلاق نافذة تقليل البيانات.
    6. قم بتنسيق تخطيط اللوحة.
      1. افتح معالج تخطيط اللوحة وقم بتعيين أنواع الآبار باتباع الخطوات 3.6.2-3.6.3.
      2. انقر فوق رمز تخطيط اللوحة في شريط الأدوات (الزاوية اليسرى ، أعلى) لفتح معالج تخطيط اللوحة.
      3. حدد المربعات بجوار أنواع الآبار المستخدمة في التجربة. ضمن عناصر تحكم الفحص، أدخل عدد أنواع عناصر التحكم المختلفة باستخدام الأسهم. انقر فوق التالي لفتح نافذة التحكم في الفحص #1 .
      4. قم بتعيين ظروف بئر التحكم في الفحص باتباع الخطوات 3.6.5-3.6.8.
      5. في النافذة التحكم في الفحص #1، أدخل تسمية عنصر التحكم في المربع معرف تخطيط اللوحة . إذا رغبت في ذلك ، أدخل الاسم الكامل في المربع المجاور. حدد عدد النسخ المتماثلة لحالة التحكم المعنية باستخدام الأسهم.
      6. في حالة استخدام تركيزات متعددة أو سلسلة تخفيف ضمن عنصر التحكم، انقر فوق تعريف التخفيفات/التركيزات واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد النوع. أدخل قيما لكل تركيز/تخفيف في الجدول.
        ملاحظة: يمكن استخدام الوظيفة التلقائية إذا تغيرت التركيزات بزيادة ثابتة.
      7. حدد علامة التبويب اللون في شريط الأدوات. اختر لون النص المطلوب ولون الخلفية للتحكم في القائمة المنسدلة. انقر فوق التالي.
      8. كرر حسب الضرورة مع عناصر تحكم إضافية.
      9. تعيين ظروف عينة جيدة التالية 3.6.10-3.6.12.
      10. في صفحة نموذج الإعداد ، أدخل بادئة معرف العينة (على سبيل المثال، SPL). حدد عدد النسخ المتماثلة باستخدام الأسهم. في حالة استخدام عينات بتركيزات معالجة مختلفة، حدد التركيزات أو التخفيفات في القائمة المنسدلة النوع . أدخل التخفيفات/التركيزات في الجدول وأدخل الوحدات في مربع الوحدة .
      11. حدد حقول التعريف في شريط الأدوات. أدخل اسم (أسماء) الفئة المطلوبة (على سبيل المثال، معرف العينة، الدواء) في الجدول.
      12. حدد علامة التبويب اللون في شريط الأدوات. حدد لونا مختلفا لكل مجموعة / عينة علاجية. انقر فوق إنهاء. سيؤدي هذا إلى فتح صفحة تخطيط اللوحة.
        ملاحظة: ترتبط الأرقام الموجودة على الجانب الأيسر بأرقام العينات المختلفة.
      13. قم بتعيين معرفات نموذجية باتباع الخطوات من 3.6.14 إلى 3.6.16.
      14. اختار SPL1 من اللوحة اليسرى. استخدم المؤشر لتحديد الآبار.
        ملاحظة: يمكن ضبط أدوات التحديد التلقائي في مربع التعيين التسلسلي. يمكن تحديد عدد النسخ المتماثلة واتجاه التخطيط مسبقا.
      15. كرر مع عينات أخرى لإكمال تخطيط اللوحة. بمجرد الرضا ، انقر فوق موافق.
      16. في شريط أدوات الملف ، حدد معرفات العينات. املأ أعمدة معرف العينة بالمعلومات المناسبة لكل عينة (على سبيل المثال، نوع الدواء). اضغط على موافق.
    7. احفظ البروتوكول.
      1. في شريط الأدوات، انقر فوق ملف > حفظ البروتوكول باسم. حدد الموقع لحفظ الملف. أدخل اسم ملف. انقر فوق حفظ لإغلاق النافذة.
      2. انقر فوق ملف > إنهاء في شريط الأدوات. سيتم فتح علامة تبويب لحفظ التغييرات في وضع التصوير اليدوي. حدد لا.
      3. سيتم فتح علامة تبويب لحفظ التغييرات في التجربة 1. حدد لا. سيتم فتح علامة تبويب لتحديث تعريف البروتوكول. حدد تحديث. أغلق البرنامج.
  6. قم باستيراد البروتوكول إلى BioSpa OnDemand وانتهي من إعداد التجربة.
    1. افتح برنامج BioSpa OnDemand (برنامج الجدولة).
    2. حدد فتحة متاحة في البرنامج.
    3. قم بإزالة اللوحة من نظام التصوير بالخلايا الحية. انقر فوق فتح الدرج للوصول إلى الفتحة المناسبة في برنامج الجدولة وأدخل اللوحة. انقر فوق إغلاق الدرج.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في أي وقت بمجرد إنشاء البروتوكول في الخطوة 3.5.7 أعلاه. ومع ذلك ، يجب أن تكون اللوحة في Cytation 5 لإجراء تشغيل توقيت في الخطوة 3.6.4.3 أدناه.
    4. استيراد البروتوكول.
      1. ضمن علامة التبويب معلومات الإجراء ، حدد المستخدم في القائمة المنسدلة. بجوار فتحة البروتوكول ، انقر فوق تحديد > إضافة إدخال جديد.
      2. بجوار فتحة البروتوكول، انقر على تحديد. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة للانتقال إلى البروتوكول المطلوب في بنية الملف. انقر فوق فتح لاستيراد البروتوكول إلى برنامج الجدولة.
      3. أدخل مقدار الوقت اللازم لتصوير اللوحة. انقر فوق موافق لإغلاق نافذة قائمة بروتوكولات Gen5 .
        ملاحظة: هذه الخطوة مهمة بشكل خاص عند تشغيل عدة تجارب في وقت واحد. لتحديد الوقت اللازم لتصوير الصورة، انقر فوق تنفيذ توقيت التشغيل الآن. انقر فوق موافق.
    5. تعيين فترات التصوير وجدولة التجربة.
      1. ضمن الفاصل الزمني، أدخل الفاصل الزمني للتصوير المحدد في الخطوة 3.5.4.
      2. ضمن خيارات وقت البدء، حدد عند توفرها. ضمن المدة، حدد ثابت أو مستمر.
        ملاحظة: يمكن تعيين وقت بدء محدد بدلا من تشغيل البروتوكول في الوقت المتاح التالي. سيؤدي تحديد المدة الثابتة إلى تعيين نقطة نهاية محددة للتجربة ويتطلب من المستخدم تعيين إطار زمني تجريبي. ستسمح المدة المستمرة بتشغيل التجربة بدون نقطة نهاية ولا يمكن إنهاؤها إلا من قبل المستخدم الذي يوقف التجربة.
      3. انقر فوق جدولة اللوحة / السفينة. سيؤدي هذا إلى فتح تسلسل التحقق من صحة اللوحة. سيتم فتح علامة تبويب مع وقت القراءة الأول المقترح. انقر فوق نعم لقبول هذا الجدول.

4. تحليل الصور في برنامج Gen5 (الشكل 2)

  1. افتح وحدة تحليل الصور.
    1. افتح Gen5. في إدارة المهام، حدد التجارب > فتح. حدد التجربة لفتح الملف. انقر فوق عرض اللوحة > في شريط الأدوات.
    2. تغيير القائمة المنسدلة البيانات إلى Z Projection. انقر نقرا مزدوجا فوق بئر الاهتمام. حدد تحليل > أريد إعداد خطوة جديدة لتقليل بيانات تحليل الصور. انقر فوق موافق.
  2. التحليل الخلوي
    1. قناع أساسي
      1. ضمن إعدادات التحليل، حدد النوع: التحليل الخلوي وقناة الكشف: ZProj[Tsf[حقل ساطع]] (اللوحة اليمنى، في الوسط).
      2. انقر فوق خيارات. سيؤدي هذا إلى فتح صفحة القناع الأساسي والعدد . في المربع العتبة ، حدد تلقائي وانقر فوق تطبيق. انقر مربع إبراز الكائنات (اللوحة اليمنى، أسفل) لإظهار الكائنات ضمن الحد المعين. اضبط حسب الضرورة لتضمين الأشياء ذات الأهمية.
        ملاحظة: تعتمد إعدادات العتبة على كثافة البكسل. على سبيل المثال ، إذا تم تعيين الحد إلى 5000 ، تضمين وحدات البكسل ذات الكثافة الأكبر من 5000 في التحليل.
      3. ضمن تحديد الكائن، قم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم الكائن (μm). اضبط حسب الضرورة لاستبعاد الحطام الخلوي / الخلايا المفردة.
        ملاحظة: قد يختلف حجم شركة تنمية نفط عمان اختلافا كبيرا بين الطرز والأنواع المختلفة. استخدم أداة القياس في برنامج Gen5 لتحديد الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم PDO لكل طراز. يمكن للمستخدمين اختيار حد أدنى أصغر لحجم PDO بالنسبة للقيمة التي توفرها أداة القياس من أجل منع استبعاد شظايا PDO في نقاط زمنية لاحقة بعد العلاج بالعقاقير.
      4. لقصر التحليل على منطقة معينة من البئر، قم بإلغاء تحديد تحليل الصورة بأكملها وانقر توصيل. في نافذة Image Plug ، استخدم القائمة المنسدلة لتحديد شكل التوصيل . اضبط معلمات الحجم والموضع حسب الضرورة لتناسب منطقة الاهتمام.
        ملاحظة: من المهم زيادة عدد PDOs داخل القابس مع استبعاد المناطق الخالية من PDO لتقليل الخلفية. قم بتعيين حجم قابس يلتقط باستمرار غالبية الكائنات ذات الأهمية عبر النسخ المتماثلة. يعد إنشاء قابس يستبعد أيضا حواف القبة أمرا مهما لأنه يستبعد أي كائنات قد تبدو مشوهة بسبب انكسار الضوء من الانحناء الشديد للقبة حول الحواف. تضمين كائنات الحافة الأساسية يمكن أيضا إلغاء تحديدها لالتقاط PDOs بالكامل فقط داخل القابس.
    2. تحليل السكان الفرعي. ويرد مثال على تعيين السكان الفرعيين في الشكل 3.
      1. انقر فوق المقاييس المحسوبة في شريط أدوات التحليل الخلوي . انقر على تحديد أو إنشاء مقاييس الاهتمام على مستوى الكائن (الزاوية اليسرى والسفلية). ضمن مقاييس الكائن المتاح ، حدد مقاييس الاهتمام (على سبيل المثال، الدائرية) وانقر فوق الزر إدراج . انقر فوق موافق.
        ملاحظة: سيحدد مورفولوجيا وكثافة كل نموذج من نماذج شركة تنمية نفط عمان أفضل المقاييس ذات الأهمية لتمييز السكان الفرعي.
      2. انقر فوق تحليل السكان الفرعيين في شريط أدوات التحليل الخلوي . انقر على إضافة لإنشاء مجموعة سكانية فرعية جديدة. سيتم فتح نافذة منبثقة.
      3. أدخل اسما للسكان الفرعيين، إذا رغبت في ذلك. ضمن مقاييس الكائن، حدد مقياسا للاهتمام واضغط على إضافة شرط. في نافذة تحرير الشرط ، أدخل معلمات لمقياس الكائن المختار. كرر مع مقاييس إضافية حسب الضرورة.
        ملاحظة: يمكن ضبط المعلمات يدويا أو تعيينها باستخدام أداة البحث. على سبيل المثال ، لاستبعاد الحطام ، يمكن للمستخدمين إضافة المساحة كمقياس كائن وتحديد كائنات أصغر من 800. يتم استخدام الدائرية كمقياس كائن بشكل روتيني ، ويتم تضمين أي كائنات ذات دائرية أكبر من 0.2-0.5 ، اعتمادا على النموذج.
      4. في الجدول أسفل النافذة ، تحقق من النتائج المطلوبة لعرضها. انقر فوق موافق > تطبيق.
      5. لعرض الكائنات داخل المحتوى الفرعي، استخدم القائمة المنسدلة تفاصيل الكائن (اللوحة اليمنى، في الوسط) لتحديد المحتوى الفرعي. سيتم تمييز الكائنات التي تقع ضمن المعلمات في الصورة.
        ملاحظة: لتغيير ألوان التمييز للقناع الأساسي والسكان الفرعي، انقر فوق الإعدادات (اللوحة اليمنى، أسفل).
      6. لضبط معلمات السكان الفرعي، أعد فتح نافذة تحليل السكان الفرعيين من شريط أدوات التحليل الخلوي . حدد المجموعة الفرعية وانقر فوق تحرير. انقر على إضافة خطوة.
        ملاحظة: سيطبق هذا نفس التحليل على جميع الآبار داخل التجربة في جميع النقاط الزمنية. في القائمة المنسدلة في صفحة Matrix ، يمكن تحديد مقاييس مختلفة للعرض الفردي.

5. تصدير البيانات من Gen5 إلى Excel

  1. لتخصيص ملف بيانات للتصدير، حدد أيقونة تقرير/تصدير منشئات في شريط الأدوات. في النافذة المنبثقة، انقر فوق تصدير جديد إلى Excel.
  2. في صفحة الخصائص في النافذة المنبثقة، حدد النطاق > اللوحة والمحتوى > مخصص. انقر فوق خيار المحتوى في شريط الأدوات. انقر فوق تحرير القالب ، والذي سيفتح برنامج Excel.
  3. ضمن جدول البيانات، حدد الوظائف الإضافية > الجدول > بيانات البئر. مرر مؤشر الماوس فوق التحديدات المختلفة للاطلاع على خيارات التصدير. حدد مقياس الاهتمام (على سبيل المثال ، كائن يعني [ZProj [Tsf [TRITC]]]).
    ملاحظة: يمكن إضافة تخطيط اللوحة إلى قالب تحليل جدول البيانات عن طريق تحديد الوظائف الإضافية > ملخص البروتوكول > تخطيط.
  4. سيتم فتح نافذة تحرير . في مربع الآبار ، قم بتعيين الآبار للتصدير إما عن طريق معرف البئر أو البئر #. حدد موافق. سيتم تحميل نموذج في ملف جدول البيانات. إغلاق جدول البيانات. يتم حفظ القالب تلقائيا.
  5. انقر فوق "موافق " على تصدير جديد إلى Excel نافذة وأغلق نافذة إنشاء التقارير / التصدير .
  6. انقر فوق رمز التصدير في شريط أدوات Gen5. حدد المربع بجوار ملف التصدير المطلوب. انقر فوق موافق. سيقوم Gen5 تلقائيا بملء قالب جدول البيانات وفتح الملف في Excel.

6. تحليل البيانات الخارجية

  1. افتح ملف التصدير (.xlsx) في Excel.
  2. لكل بئر ، قسم كل قيمة فردية على قيمة النقطة الزمنية 0:00 لهذا البئر. سيؤدي هذا إلى تعيين النقطة الزمنية 0 التي تساوي 1 ، وستكون كل قيمة بعد ذلك مرتبطة بالقراءة الأولية.
  3. افتح ملفا جديدا في برنامج تحليل البيانات. حدد خيار تخطيط XY .
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام GraphPad Prism (الإصدار 9.5.1).
  4. تسميات الإدخال لكل مجموعة بيانات. انسخ والصق النقاط الزمنية والقيم الطبيعية المقابلة لكل مجموعة علاج في جدول Prism. سيتم إنشاء رسم بياني للبيانات تلقائيا ويمكن العثور عليه ضمن الرسوم البيانية.

النتائج

كان هدفنا هو إثبات جدوى استخدام تصوير الخلايا الحية المتعددة لتقييم الاستجابة العلاجية لشركة تنمية نفط عمان. تم إجراء تجارب إثبات المفهوم في نموذجين منفصلين لشركة تنمية نفط عمان لسرطان بطانة الرحم: ONC-10817 و ONC-10811 (انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 لبيانات ONC-10811). تم رصد موت الخلايا المبرمج (تلطيخ الملحق الخامس) والسمية الخلوية (امتصاص السم الخلوي الأخضر) حركيا استجابة للعامل المسبب لموت الخلايا المبرمج ، ستوروسبورين. على وجه التحديد ، تم طلاء PDOs في 96 لوحة بئر ، ومعالجتها بأصباغ Annexin V Red و Cytotox Green ، ووضعها في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل كما هو موضح في الشكل 1. لقد أكدنا في نموذجين مستقلين من PDO أن العلاج بأصباغ Annexin V و Cytotox Green ليس ساما (الشكل التكميلي 2). في اليوم التالي ، عولجت PDOs بتركيزات متزايدة من الستوروسبورين (0.01 نانومتر ، 0.1 نانومتر ، 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر ، 500 نانومتر). بعد ذلك ، تم وضع بروتوكولات في برنامج Gen5 وتم تعيين التجارب لتستمر على مدار 5 أيام ، ويتم تصويرها كل 6 ساعات. تم تحليل البيانات باستخدام وظيفة التحليل الخلوي في برنامج Gen5 كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. تم ضبط القناع الأساسي باستخدام وظيفة العتبة التلقائية مع "تقسيم كائنات اللمس" دون تحديد ومع معلمات الحجم الحد الأدنى: 30 ميكرومتر والحد الأقصى: 1000 ميكرومتر. تم تعريف السكان الفرعيين لشركة تنمية نفط عمان من خلال دائرية > 0.25. تم تصدير متوسط شدة الكائن في TRITC (الملحق الخامس ، موت الخلايا المبرمج) وقنوات GFP (السم الخلوي الأخضر ، السمية الخلوية) داخل المجموعة الفرعية المعينة من PDO كملف .xlsx لمزيد من التحليل. تم تسوية متوسط كثافة الكائن لكل بئر في كل نقطة زمنية في كل من قناتي GFP و TRITC إلى الوقت 0. ثم تم نقل بيانات التألق الطبيعية إلى ملف بريزم وتصورها كمخطط خطي.

أدى العلاج بالستوروسبورين إلى زيادة كبيرة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا المبرمج وانخفاض في صحة الخلايا بمرور الوقت مقارنة بالتحكم في السيارة ، كما يتضح من الزيادة في كثافة متوسط الجسم في كل من قنوات TRITC (الملحق الخامس) و GFP (السم الخلوي) (الشكل 4 ، الشكل 5 ، الفيديو التكميلي 1 ، الفيديو التكميلي 2 ، الفيديو التكميلي 3 ، الفيديو التكميلي 4 والفيديو التكميلي 5 والفيديو التكميلي 6 والفيديو التكميلي 7). أدت جرعات 500 نانومتر و 100 نانومتر و 10 نانومتر من ستوروسبورين إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في كل من موت الخلايا المبرمج والسمية الخلوية بمرور الوقت (الشكل 5A-C) وكذلك في نهاية التجربة (الشكل 5E ، F). علاوة على ذلك ، فإن الستوروسبورين يثبط بشكل فعال نمو PDO وتكوينه عند هذه التركيزات ، كما يتضح من الانخفاض العام في إجمالي مساحة PDO ، في حين أظهرت آبار التحكم زيادة في إجمالي مساحة PDO (الشكل 4 والشكل 5 د).

نظرا لأن الميزة الرئيسية لتصوير الخلايا الحية هي القدرة على تصحيح التباين في الطلاء ، فقد أجرينا تجربة تم من خلالها تقييم صلاحية الخلية كمقياس لنقطة النهاية. تم جمع بيانات فحص نقطة نهاية إثبات المفهوم باستخدام نموذج PDO الذي تم إنشاؤه من طعم xenograft مشتق من المريض لسرطان البروستاتا. تم جمع صور المجال الساطع في بداية فترة العلاج (اليوم 0) ، تليها إضافة كاشف صبغة مزدوج يقيس كلا من الصلاحية (برتقال أكريدين ، AO) وموت الخلايا (يوديد البروبيديوم ، PI). يصدر مكون AO إشارة فلورية خضراء عند الارتباط بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، وهو مؤشر على صلاحية الخلية. يلطخ مكون PI الخلايا الميتة ويمكن استخدامه لقياس موت الخلايا استجابة للعلاج. من أجل حساب التباين في طلاء PDO ، ابتكرنا طريقة لتحديد عدد PDOs لكل بئر في الوقت 0 عن طريق تحويل صور المجال الساطع إلى صور تباين الطور الرقمي (الشكل التكميلي 3 والملف التكميلي 1).

تم علاج PDOs لسرطان البروستاتا باستخدام daunorubicin ، وهو عامل علاج كيميائي يسبب موت الخلايا ، لمدة 7 أيام. عند الانتهاء من التجربة ، تم تلطيخ العينات ب AOPI كما هو موضح في الملف التكميلي 1 ، متبوعا بتحليل الصور الفلورية في Gen5. يوضح الشكل 6A لوحة من الصور من مقايسة نقطة نهاية AOPI في اليوم 7. عند مقارنة PDOs المعالجة بالمركبات (الصف الأول) ب PDOs المعالجة ب 10 ميكرومتر داونوروبيسين (الصف الثاني) ، كان هناك انخفاض واضح في التألق الأخضر (مقياس الصلاحية ، العمود الثاني) وزيادة في التألق الأحمر (مقياس موت الخلايا ، العمود الثالث). ثم تم تحديد هذه النتائج في الشكل 6B ، حيث نعرض مجموعة القراءات التي يمكن تحقيقها باستخدام تقنية تلطيخ نقطة نهاية AOPI. يصور الرسم العلوي الأيسر قياس الجدوى الناتج عن صبغة AO ، والذي تم تطبيعه إلى عدد PDO الذي يحدده تحليل صورة تباين الطور الرقمي لكل بئر في اليوم 0. ترتبط هذه البيانات بالنتيجة المرئية من الشكل 6 أ ، حيث مع زيادة تركيز داونوروبيسين ، انخفضت الصلاحية بشكل كبير. يتم تلخيص هذا بشكل أكبر في الرسم البياني العلوي الأيمن ، والذي يوضح زيادة في موت الخلايا التي تدل عليها زيادة في التألق الأحمر المكتسب مع صبغة PI.

ثم تم دمج بيانات مؤشر الأداء مع قراءة الجدوى (AO) لحساب نسبة قابلة للحياة إلى الميتة (الشكل 6B ، الرسم البياني الأيسر السفلي). هذه النسبة هي طريقة مفيدة لتحديد ما إذا كان الدواء مثبطا للخلايا أو ساما للخلايا. على وجه التحديد ، سيصل الدواء السام للخلايا إلى ما يقرب من 0 من دواء تثبيط الخلايا نظرا لحقيقة أن الدواء المثبط للخلايا سيمنع النمو ولكنه قد لا يحفز موت الخلايا. أخيرا ، يمكن حساب مساحة PDOs بدقة باستخدام التألق الأخضر لصبغة AO ، حتى عندما تكون PDOs عرضة لموت الخلايا والفجار. يصور الرسم البياني السفلي الأيمن متوسط مساحة شركة تنمية نفط عمان ، والتي تم حسابها على أنها مجموع المنطقة المشار إليها في تحليل السكان الفرعيين مقسوما على رقم شركة تنمية نفط عمان. يمكن أن يعطي تحليل المنطقة مزيدا من المؤشرات حول ما إذا كان العلاج ببساطة يثبط نمو شركة تنمية نفط عمان أو يتسبب بالفعل في تراجع شركة تنمية نفط عمان. لاحظ أنه تم إجراء تحليل متوسط مساحة PDO باستخدام قناة GFP ووظيفة التحليل الخلوي ، على عكس الشكل 5D ، الذي استخدم صور المجال الساطع لحساب إجمالي مساحة PDO. تسلط هذه البيانات الضوء على مرونة خط أنابيب التحليل اعتمادا على توفر البيانات واهتمام المستخدم.

أخيرا ، قارنا المعيار الذهبي لقراءات الجدوى ، CellTiter-Glo 3D ، بقراءة مضان الجدوى باستخدام AOPI (الشكل 6C). لاحظ أنه لم يتم تسوية البيانات الموجودة في هذه اللوحة إلى رقم الوقت 0 PDO نظرا لأن هذا التطبيع لا يتم إجراؤه عادة بواسطة المختبرات التي تستخدم مجموعة CellTiter-Glo 3D. لاحظنا نفس الاتجاه لتأثير الدواء في كلا المقايسات ، حيث انخفضت صلاحية PDO مع زيادة تركيز daunorubicin. كان الاختلاف البصري الوحيد بين هذه القراءات هو أن تحليل CellTiter-Glo 3D وصل إلى IC50 قبل تحليل AOPI ووصل بالكامل تقريبا إلى 0. يمكن تفسير هذه النتيجة من خلال آلية عمل داونوروبيسين. Daunorubicin هو مثبط topoisomerase-II الذي يقدم فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية وفي النهاية موت الخلايا المبرمج14. أثناء توقف دورة الخلية ، يمكن أن يحدث استنفاد ATP15. بالنظر إلى أن اختبار CellTiter-Glo 3D يعتمد على تفاعل ATP-luciferase لتوليد إشارة تلألؤ ، فإننا نفترض أن الانخفاض الأقوى في صلاحية الخلية عند تركيزات أعلى من daunorubicin كان بسبب استنفاد ATP بدلا من موت الخلية الكامل. لدعم هذه الفكرة ، تصور الصور في الشكل 6 أ مجموعة سكانية تعيش PDOs في الثقافة ، كما هو موضح بالتألق الأخضر.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول الطلاء والتصوير والتحليل. يتم طلاء PDOs في لوحة 96 بئرا ومعالجتها بأصباغ الفلورسنت والأدوية. يتم إنشاء معلمات التصوير للتجربة (على سبيل المثال ، التعرض ، Z-stack) في برنامج Gen5. يتم الحصول على الصور بواسطة Cytation 5 ومعالجتها في Gen5 ، ويتم تصدير البيانات لمزيد من التحليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نظرة عامة على ميزة التحليل الخلوي. 1: تعيين القابس: تم تعيين قابس ليشمل مجالات الاهتمام. 2: تعيين القناع الأساسي: يحدد القناع الأساسي الكائنات ذات الأهمية بناء على الحجم وكثافة البكسل في القناة المختارة. في هذه الصورة التمثيلية، الكائنات المضمنة في القناع الأساسي موضحة باللون الأرجواني. 3: تعريف السكان الفرعي: يمكن تعريف مجموعة سكانية فرعية إضافية لزيادة تحسين السكان المطلوبين للتحليل. يتم تعريف السكان الفرعيين في صورة المثال (الموضحة باللون الأصفر) بناء على الدائرية (>0.25) والمساحة (>800). تم الحصول على الصور بهدف 4x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أمثلة على إخفاء السكان الفرعيين باستخدام ميزة التحليل الخلوي. يتم تعريف المجموعات السكانية الفرعية في قناة الحقل الساطع. يتم تعريف السكان الفرعيين في الصور النموذجية (الموضحة باللون الأصفر) بناء على الدائرية (>0.25) والمساحة (>800). تم الحصول على الصور بهدف 4X. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: يؤدي علاج Staurosporine إلى زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا المبرمج والسمية الخلوية. يتم عرض صور المجال الساطع (هدف 4x) مع تراكب مضان GFP و TRITC لجرعات 500 نانومتر و 10 نانومتر و 0.1 نانومتر من ستوروسبورين في 3 نقاط زمنية: 0 ساعة ، 54 ساعة ، 114 ساعة. تشير إشارة الفلورسنت الحمراء إلى موت الخلايا المبرمج (الملحق V) ، وتشير إشارة الفلورسنت الخضراء إلى السمية الخلوية (السم الخلوي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تصوير الخلايا الحية الفلورية المتعددة لتقييم استجابة شركة تنمية نفط عمان. تم طلاء نموذج PDO ONC-10817 بألواح 96 بئرا وتم تحضينه بأصباغ Annexin V Red (1: 400) و Cytotox Green (200 نانومتر) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، عولجت PDOs بتركيزات متزايدة من الستوروسبورين وتم تصويرها كل 6 ساعات لمدة ~ 5 أيام. (أ، ب) زيادة تعتمد على الوقت والجرعة في (أ) السمية الخلوية أو (ب) موت الخلايا المبرمج استجابة للستوروسبورين. تم رسم البيانات على أنها متوسط كثافة الكائن في قناة GFP أو TRITC. ج: مقارنة المسار الزمني لموت الخلايا المبرمج والسمية الخلوية استجابة ل 100 نانومتر أو 500 نانومتر من الستوروسبورين. تم رسم البيانات كقيم متوسط كثافة الكائن في قناتي GFP و TRITC. (د) يمنع ستاوروسبورين نمو PDOs. تم رسم البيانات كمتوسط إجمالي مساحة شركة تنمية نفط عمان. تمت تسوية البيانات في A-D إلى رقم PDO في الوقت 0 h في كل بئر وتم رسمها كمتوسط وخطأ معياري للمتوسط (SEM). N = 5 مكررات تقنية لكل علاج. p < 0.0001 مقابل التحكم في السيارة بواسطة 2-way ANOVA. (ه) صور المجال الساطع التمثيلي ، GFP ، و TRITC ل 500 نانومتر من PDOs المعالجة بالستوروسبورين مقابل السيارة في نهاية التجربة (114 ساعة). تم الحصول على الصور بهدف 4x. (و) التحديد الكمي للسمية الخلوية وموت الخلايا المبرمج والصلاحية عند النقطة الزمنية 114 ساعة. تم حساب متوسط كثافة كائن GFP (يسار) ومتوسط كثافة كائن TRITC (وسط) عند النقطة الزمنية 114 ساعة باستخدام نتائج من اللوحات A-C. تم تقييم الجدوى (يمين) باستخدام كاشف CellTiter-Glo 3D وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تطبيع قيم التلألؤ الخام (RLU) إلى إجمالي مساحة PDO في الوقت 0 ساعة وتم رسمها على أنها قابلية الطي بالنسبة للتحكم في السيارة ، والتي تم تعيينها عند 1.0. ** p<0.01 ، ***p<0.001 ، **** p<0.0001 مقابل التحكم في السيارة عبر ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunnett اللاحق. N = 5 مكررات فنية لكل علاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: استخدام تصوير الخلايا الحية للمساعدة في تطبيع بيانات مقايسة نقطة النهاية. عولجت PDOs بتركيزات متزايدة من مثبط توبوإيزوميراز II ، داونوروبيسين ، لمدة 7 أيام. تعرضت PDOs لمحلول تلطيخ AOPI وتم تصويرها كما هو موضح في الملف التكميلي 1. AO = برتقالي أكريدين ، مقياس للجدوى (قناة GFP) ؛ PI = يوديد البروبيديوم ، مقياس لموت الخلايا (قناة تكساس الحمراء). (أ) الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام تلطيخ AOPI بعد 7 أيام من العلاج باستخدام 10 ميكرومتر داونوروبيسين أو التحكم في السيارة (0.1٪ DMSO). (ب) قراءات مختلفة باستخدام مضان AOPI كطريقة جدوى / موت الخلية لنقطة النهاية. انظر الملف التكميلي 1 للحصول على وصف مفصل لطرق التحليل. أعلى اليسار ، تحليل صلاحية شركة تنمية نفط عمان بعد 7 أيام على النحو الذي يحدده تلطيخ AO. أعلى اليمين ، تحليل موت الخلايا عن طريق تلطيخ PI. تم تطبيع بيانات تلطيخ AO و PI إلى رقم PDO في الوقت 0 h ثم للتحكم في السيارة ، والذي تم تعيينه عند 1.0 ، وتم رسمه على أنه المتوسط والانحراف المعياري. أسفل اليسار ، حساب نسبة قابلة للحياة إلى الميتة باستخدام متوسط تكاملات الكائن لبقع AO و PI. أسفل اليمين ، منطقة PDOs كما هو محدد بواسطة تلطيخ AO. تم إجراء التحليل الخلوي في قناة GFP. (ج) مقارنة طريقتين لاختبار جدوى شركة تنمية نفط عمان. بعد التصوير ، تم تقييم الجدوى باستخدام كاشف CellTiter-Glo 3D وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم رسم بقاء الطي بالنسبة للتحكم في السيارة بتركيزات متزايدة من داونوروبيسين. تمثل البيانات المتوسط والانحراف المعياري ل N = 6 مكررات تقنية لكل معاملة ؛ لم يتم تسوية البيانات إلى الوقت 0 h في اللوحة C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العلاج# عدد الآبارحجم الوسائطالمرفق100 ميكرومتر السم الخلوي
التخفيفحجمالتخفيفحجم
متعدد606.6 مل1:40016.5 ميكرولتر200 نيوتن متر13.2 ميكرولتر

الجدول 1: مثال على تجربة تعدد الإرسال. الملحق الخامس الأحمر يربط سيرين فوسفاتيديل المكشوف على النشرة الخارجية لأغشية الخلايا المبرمجة. يتكامل Cytotox Green في الخلايا ذات سلامة الغشاء المخترق ويربط الحمض النووي.

الشكل التكميلي 1: تصوير الخلايا الحية المتعددة ل ONC-10811. تم طلاء PDOs في 96 لوحة بئر وتم حضنها في Annexin V Red (1: 400) ، وأصباغ Cytotox Green (200 نانومتر) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، عولجت PDOs بتركيزات متزايدة من الستوروسبورين وتم تصويرها كل 6 ساعات لمدة 5 أيام. أ: الزيادة المعتمدة على الوقت والجرعة في السمية الخلوية استجابة للستوروسبورين. تم رسم البيانات على أنها متوسط كثافة الكائن في قناة GFP. ب: استجابة جرعة الستاوروسبورين عند 114 ساعة. تم رسم البيانات كقيم متوسط كثافة الكائن في قناة GFP عند النقطة الزمنية 114 h. (ج) الزيادة المعتمدة على الوقت والجرعة في موت الخلايا المبرمج استجابة للستوروسبورين. تم رسم البيانات على أنها متوسط كثافة الكائن في قناة TRITC. د: استجابة جرعة الستوروسبورين عند 114 ساعة. تم رسم البيانات كقيم متوسط كثافة الكائن في قناة TRITC عند النقطة الزمنية 114 ساعة. تم تطبيع البيانات في A و C إلى رقم PDO في الوقت 0 ساعة على مستوى البئر. N = 5 مكررات تقنية لكل معالجة في كل نموذج. p < 0.0001 مقابل التحكم في السيارة بواسطة 2-way ANOVA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: العلاج بالملحق الخامس والسم الخلوي لا يزعج صلاحية شركة تنمية نفط عمان. تم طلاء PDOs في 96 لوحة بئر وتم تحضينها بأصباغ Annexin V Red (1: 400) و Cytotox Green (200 نانومتر) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد حضانة 24 ساعة ، تم تقييم الجدوى باستخدام مقايسة CellTiter-Glo 3D وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. (أ) الصلاحية في PDOs المعالجة بالصبغة وغير المعالجة عند النقطة الزمنية 24 ساعة. يتم عرض كل من قيم وحدة الضوء النسبية (RLU) والقيم التي تم تسويتها إلى مساحة مجموع PDO. على وجه التحديد ، تم تطبيع CellTiter-Glo3D RLU لكل بئر إلى جمع منطقة PDO لذلك البئر في وقت الطلاء (أي مباشرة بعد إضافة الصبغة). تم تحديد إجمالي مساحة PDO باستخدام حساب "مساحة مجموع الكائنات" في التحليل الخلوي. ن = 10. (ب) الصلاحية في PDOs المعالجة بالصبغة وغير المعالجة في النقطة الزمنية 114 ساعة. يتم عرض كل من قيم التلألؤ الخام والقيم التي تم تطبيعها إلى إجمالي مساحة PDO. تم تطبيع CellTiter-Glo3D RLU لكل بئر إلى جمع منطقة PDO عند 24 ساعة بعد الطلاء ، وهو ما يتوافق مع الوقت 0 ساعة في تجارب التصوير الحركي. ن = 5. تم تقييم الأهمية في A و B باستخدام اختبار t غير المزاوج ؛ يتم سرد قيم P على الرسوم البيانية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحليل خال من الملصقات ل PDOs باستخدام تباين الطور الرقمي. يحتوي هذا الشكل على صور تمثيلية (هدف 2.5x) تصور تحليلا خاليا من الملصقات كما هو موضح في الملف التكميلي 1: إعداد معلمات التصوير لمستوى بؤري واحد من تحليل الرؤية (صور تباين المجال الساطع / الطور الرقمي) وتحليل صورة تباين الطور الرقمي في برنامج Gen5. (أ) مثال على صورة المجال الساطع لنموذج PDXO لسرطان البروستاتا في مستوى بؤري واحد. (B) تم تحويل صورة المجال الساطع في A إلى صورة تباين الطور الرقمي. تظهر الكائنات المظلمة في صورة المجال الساطع ساطعة في صورة تباين الطور الرقمي والعكس صحيح. (C) مثال على إخفاء PDO باستخدام صورة تباين الطور الرقمي. لاحظ أن حواف الكائنات ذات الأهمية تصبح أكثر تحديدا مقارنة بصور المجال الساطع. في هذه الصورة التمثيلية، تكون الكائنات في القناع الأساسي محددة باللون الأصفر. يتم تعريف السكان الفرعيين في (C) (الموضحة باللون الوردي) بناء على الدائرية (>0.3) ، والمنطقة (>1000) ، والمتوسط [Dig.Ph.Con] > 2000 ، و StdDev [Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 ، و Peak [Dig.Ph.Con] > 12500. تم تطبيق المعلمات المستخدمة في هذا الشكل التمثيلي على البيانات الواردة في الشكل 6 لتطبيع عدد الخلايا في اليوم 0. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: قد تختلف نماذج شركة تنمية نفط عمان في مورفولوجيتها واتساق الطلاء. اللوحة العلوية: أمثلة على التشتت التفاضلي ل PDOs في قباب BME. اللوحة السفلية: صور تمثيلية لأجهزة PDO القرصية مقابل الدائرية. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر EVOS. ويلاحظ التكبير. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: مثال على الصور باستخدام التحليل الخلوي مقابل إحصائيات الصور لقياس التألق. باستخدام التحليل الخلوي ، يمكن للمستخدمين تحديد مجموعات سكانية محددة داخل الصورة وقياس التألق في تلك المناطق. يمكن أيضا استخدام إحصائيات الصورة لقياس التألق في الصورة عن طريق تحديد عتبة لاستبعاد إشارات الخلفية. راجع المناقشة لمعرفة قيود استخدام إحصائيات الصور. الصور عند تكبير 4x. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: مكونات وسائط الاستزراع العضوي. لاحظ أنه تم تحسين الكواشف لزراعة PDOs لسرطان أمراض النساء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: فيديو بفاصل زمني لعلاج 500 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 2: فيديو بفاصل زمني لعلاج 100 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 3: فيديو بفاصل زمني لعلاج 10 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور المكتسبة كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 4: فيديو بفاصل زمني لعلاج 1 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور التي تم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 5: فيديو بفاصل زمني لمعالجة 0.1 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 6: فيديو بفاصل زمني لعلاج 0.01 نانومتر من الستوروسبورين مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 7: فيديو بفاصل زمني للمركبة (0.06٪ DMSO) مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 6 ساعات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: البروتوكولات التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

أصبحت ثقافات شركة تنمية نفط عمان شائعة بشكل متزايد في نظام النماذج المختبرية نظرا لقدرتها على عكس الاستجابات والسلوكيات الخلوية2. تم إحراز تقدم كبير في تقنيات توليد PDO وثقافتها وتوسعها ، ومع ذلك فقد تأخرت طرق تحليل الاستجابات العلاجية. مجموعات الجدوى 3D المتاحة تجاريا هي مقايسات نقطة النهاية lytic ، وفقدان بيانات الاستجابة الحركية ذات القيمة المحتملة والحد من التحليلات اللاحقة بطرق أخرى8. تطبق الدراسات الناشئة تصوير الخلايا الحية لتقييم الاستجابات الدوائية في نماذج شركة تنمية نفط عمان. هنا ، نقدم طريقة لتقييم الاستجابات العلاجية لشركة تنمية نفط عمان بمرور الوقت باستخدام تصوير الخلايا الحية الفلورية المتعددة. تسمح الأصباغ الفلورية المتعددة بقياس الاستجابات الخلوية المختلفة في وقت واحد. بالإضافة إلى موت الخلايا المبرمج والسمية الخلوية ، نتصور أنه يمكن توسيع هذا النهج في الدراسات المستقبلية لفحص تأثيرات النمط الظاهري الأخرى في PDOs.

تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للحصول على صور حركية ساطعة المجال وفلورسنت ل PDOs مطلية كقباب في لوحة 96 بئرا. تشمل الخطوات الرئيسية 1) الطلاء ، 2) المعالجة بالصبغة والدواء ، 3) تحديد معلمات التصوير ، 4) المعالجة المسبقة للصور وتحليلها عند الانتهاء من الحصول على الصور الحركية ، و 5) تصدير البيانات للتحليل في البرامج الإحصائية الأخرى (الشكل 1). يتم طلاء PDOs السليمة في لوحة 96 بئرا مثل قباب BME 5 ميكرولتر تتكون من نسبة محددة مسبقا من BME ووسائط الثقافة العضوية (عادة 1: 1). يستخدم البروتوكول المقدم هنا UltiMatrix باعتباره BME نظرا للحد الأدنى من التباين من دفعة إلى أخرى والخصائص البصرية الفائقة للتصوير. قد يكون من الضروري إجراء تعديلات لحصاد PDOs المستزرعة في BMEs الأخرى ، مثل Matrigel ، وكذلك للنماذج المتكتلة والتي يصعب فصلها (انظر الأمثلة الشكل التكميلي 4). بعد ذلك ، تضاف الأصباغ الفلورية إلى وسائط الثقافة العضوية في وقت الطلاء (اليوم -1) بتركيز 2x في حجم 100 ميكرولتر ويتم حضنها طوال الليل لتحديد موت الخلايا الأساسي. في اليوم التالي (اليوم 0) ، تضاف الأدوية أو العلاجات الأخرى إلى وسائط الثقافة العضوية بتركيز 2x في حجم 100 ميكرولتر ، ثم تضاف إلى كل بئر لحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر يقلل من تأثير الغضروف المفصلي مع التصوير. يتم الحصول على الصور الحركية باستخدام قارئ لوحة Cytation 5 بالشراكة مع حاضنة الطاولة BioSpa. تسمح حاضنة BioSpa بحضانة الألواح التجريبية عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئويةوبيئة CO 2 بنسبة 5٪. يمكن تخزين ما يصل إلى 8 لوحات في BioSpa وبالتالي ، يمكن إجراء 8 تجارب في وقت واحد. يتم إعداد معلمات التصوير لكل لوحة في برنامج Gen5 باستخدام "الوضع اليدوي للتصوير" وحفظها كبروتوكول. ثم يتم تحميل البروتوكول في برنامج الجدولة (BioSpa OnDemand). يقوم برنامج BioSpa OnDemand بأتمتة سير العمل للحصول على الصور الحركية ، بما في ذلك النقل المادي للوحة من حاضنة BioSpa إلى Cytation 5 وإملاء البروتوكول الذي يجب تشغيله في Gen5 لجمع البيانات. يتم تحليل الصور باستخدام وظيفة التحليل الخلوي في برنامج Gen5 (الشكل 2). وصفنا طرقا محددة لتحليل إسقاطات Z لصور المجال الفلوري والساطع. يتم توفير طرق محددة لتحليل مستويات Z المفردة و / أو صور المجال الساطع فقط في الملف التكميلي 1. وأخيرا، يمكن للمستخدمين تحديد ميزات بيانات محددة، مثل منطقة شركة تنمية نفط عمان ورقمها ومتوسط شدة التألق، لتصديرها كجدول بيانات إكسل للتحليل الإحصائي اللاحق لآثار الأدوية.

وبالنظر إلى أن نماذج شركة تنمية نفط عمان هي نظام نموذجي جديد نسبيا لاستجواب آثار المخدرات، فإن طرق استيعاب ظروف الثقافة، ولا سيما النمو في BME، لا تزالناشئة 16. يعتمد الجزء الأكبر من الدراسات التي تقيم استجابة شركة تنمية نفط عمان للعلاج الدوائي على مقايسات نقطة النهاية القائمة على ATP كبديل لصحة الخلية (CellTiter-Glo 3D). تتطلب هذه الطريقة تحلل الخلية ، مما يحول دون التحليلات اللاحقة في المصب. قدمت مقايسات نقطة النهاية البديلة ، مثل تلطيخ الفلورسنت ، والتصوير بنقطة زمنية واحدة ، والتتبع المورفولوجي ، مقاييس أخرى لتوصيف استجابة الدواء مع السماح باستخدام العينة لأغراض إضافية. على سبيل المثال ، تم تطبيق بروتوكولات تثبيت نقطة النهاية داخل اللوحة لتحليل عالي الإنتاجية لتأثيرات الدواء17,18. ومن مزايا هذه الطريقة أنها تتحايل على المعالجة المكثفة المطلوبة في الكيمياء الهيستولوجية المناعية النموذجية والتصوير المناعيالفلوري 19 وهي مفيدة بشكل خاص عندما تكون العينة محدودة، كما هو الحال بالنسبة لنماذج شركة تنمية نفط عمان. كما أنه قابل للتصوير عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. اختبار نقطة النهاية الآخر الذي لا يتطلب تحلل الخلايا هو تصوير الخلايا الحية باستخدام الكواشف مثل يوديد البروبيديوم أو برتقال أكريدين. يسلط تحليلنا المقارن ل CellTiter-Glo 3D و AOPI ، والذي لا يتطلب الأخير تحلل الخلية ، لتقييم صلاحية الخلية وموتها (الشكل 6C) الضوء على مزايا استخدام أصباغ تصوير الخلايا الحية في نماذج شركة تنمية نفط عمان. تم تطبيق هذه الطريقة من قبل عدة مجموعات ، بما في ذلك مجموعتنا ، لتقييم التأثيرات المظهرية في ختام تجربة18،19،20. ومع ذلك ، فإن الحصول على البيانات الحركية باستخدام طرق التثبيت داخل البئر أو طرق تصوير الخلايا الحية في نقطة النهاية يتطلب عينة كبيرة. يتغلب التقييم المورفولوجي الخالي من الملصقات ل PDOs بمرور الوقت جزئيا على هذا القيد ويمكن تقييمه باستخدام مجموعة واسعة من طرق التصوير8،10،17،18 ، ومع ذلك قد لا تكون التغييرات في التشكل ممثلة لمجموعة من تأثيرات الأدوية المحتملة مثل موت الخلايا المبرمج والتغيرات في صلاحية الخلية. لقد لاحظنا تباينا كبيرا من نموذج إلى نموذج في التغيرات المورفولوجية استجابة للأدوية. على سبيل المثال ، ستزداد مساحة بعض PDOs لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج ، بينما قد تتقلص النماذج الأخرى. تم مضاعفة التقييمات المورفولوجية الحركية إما بمقايسات نقطة النهاية الفلورية الثابتة أو الحية في عدد محدود من الدراسات18،20. الطرق المعروضة هنا هي من بين أولى الطرق التي تقوم بتعدد الأصباغ الفلورية المختلفة لتقييم التأثيرات الخلوية المتعددة في وقت واحد في نظام عالي الإنتاجية.

أحد أكبر التحسينات التي يوفرها تصوير الخلايا الحية الحركية هو أنه يتغلب على القيود الرئيسية المرتبطة بمقايسات نقطة النهاية. على سبيل المثال ، يعد طلاء عدد متساو من PDOs لكل بئر أمرا صعبا تقنيا لأن معظم عدادات الخلايا الآلية عبارة عن بوابات للأجسام الأصغر من 60 ميكرومتر. يسمح التصوير بالخلايا الحية بالتطبيع مع رقم أو منطقة PDO في وقت 0 ساعة في كل بئر ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لضبط التباين في الطلاء بين الآبار. مقايسة نقطة النهاية القياسية الذهبية ل PDOs هي مجموعة CellTiter-Glo 3D ، والتي تقيس ATP كبديل لصلاحية الخلية. لقد استخدمنا هذا الفحص على نطاق واسع في دراساتنا لسرطان النساء وسرطان البروستاتا PDOs13،21،22،23،24. بالإضافة إلى اشتراط تحلل الخلايا لتدابير ATP ، يمكن للأدوية والطرائق العلاجية الأخرى تغيير مستويات ATP ، مما قد يوفر تقييما غير دقيق للاستجابة العلاجية. يسمح استخدام أصباغ تصوير الخلايا الحية بقياس نطاق أوسع من الاستجابات الخلوية المحددة ، مثل موت الخلايا المبرمج والسمية الخلوية. الأهم من ذلك ، أن هذه الكواشف لا تزعج صلاحية الخلية أو تسبب تلف الحمض النووي ، كما هو الحال مع يوديد البروبيديوم. وهذا يسمح بالتقييم المتكرر لاستجابة شركة تنمية نفط عمان بمرور الوقت. على الرغم من أننا لم نستكشف استخدام برتقال أكريدين (AO) للمقاييس الحركية ، إلا أن آلية العمل الخاصة ب AO لا ينبغي أن تمنع مثل هذا التطبيق في المستقبل.

تتكون الأورام من عدة مجموعات خلايا متميزة ذات ملامح جينومية وأشكال مختلفة. نظرا لعدم التجانس المعقد لنماذج شركة تنمية نفط عمان، قد تختلف الاستجابات الفردية لشركة تنمية نفط عمان، ويمثل تتبع هذه الاستجابات تحديا. يوفر بروتوكولنا طريقة لتقييم مقاييس استجابة شركة تنمية نفط عمان المتعددة على أساس كل بئر على حدة. ومع ذلك ، لا تزال بعض الاعتبارات الفنية تنطبق على تصوير الخلايا الحية. يعتمد عدد الآبار في صفيحة 24 بئرا اللازمة لبذر صفيحة 96 بئرا على كثافة ومعدل نمو كل نموذج من نماذج شركة تنمية نفط عمان. نظرا لأن التكتل يمكن أن يربك تحليل الصور (الشكل التكميلي 4) ، فقد تحتاج نماذج PDO إلى خطوات معالجة إضافية قبل الطلاء. إذا لزم الأمر ، يمكن قص PDOs ميكانيكيا أثناء المعالجة من خلال ماصة قوية بطرف p200 ذو تجويف غير عريض. يمكن أيضا استخدام الهضم الأنزيمي باستخدام TrypLE Express قبل الطلاء لتعزيز تفكك PDO وتقليل التكتل. في تجربتنا ، لاحظنا أن طول حضانة TrypLE متغير للغاية اعتمادا على النموذج. لذلك ، يجب تحسين حضانة TrypLE لكل نموذج ، خاصة إذا كان الباحثون يرغبون في الحصول على معلقات أحادية الخلية. قد يكون وقت التعافي قبل بدء العلاج ضروريا لنماذج PDO الحساسة بشكل خاص للهضم الأنزيمي.

نقدم طرقا لكواشف تصوير الخلايا الحية المحددة. أحد القيود على التطبيق الواسع للطرق المعروضة هنا هو ندرة الكواشف المتوافقة مع BME. بالنسبة للأصباغ / الكواشف الأخرى التي لم يتم تحسينها بعد للاستخدام في PDOs ، قد يكون من الضروري استكشاف الأخطاء وإصلاحها الإضافية لتحديد التركيز الأمثل وتقليل تأثيرات المذيبات. اعتمادا على قراءات الاهتمام (على سبيل المثال ، موت الخلايا المبرمج أو السمية الخلوية) ، يجب استخدام العلاج بمركب معروف بتحفيز موت الخلايا ، مثل staurosporine أو daunorubicin13 لتحسين ظروف الكاشف. هناك اعتبار إضافي هو الوقت الأمثل لدمج الصبغة في قبة BME. في تجاربنا ، نقوم بإجراء حضانة ليلية قبل العلاج للسماح بالامتصاص الكامل للصبغة في القباب وكذلك تحديد صحة الخلية الأساسية. نظرا لأن شدة الإشارة ستزداد بمرور الوقت ، يجب على الباحثين إجراء دراسات تجريبية باستخدام الأصباغ لتحديد وقت التعرض المثالي في نهاية التجربة لتجنب الصور المعرضة بشكل مفرط. أخيرا ، يجب ألا تتداخل الكواشف مع العمليات الخلوية. على سبيل المثال ، الأصباغ التي تقحم في الحمض النووي غير متوافقة مع التصوير الحركي. ومع ذلك ، يمكن استخدام تصوير الخلايا الحية لتطبيع البيانات في مقايسات نقطة النهاية. في الواقع ، نقدم طريقة تكميلية لتحديد قابلية بقاء الخلية وقابلية البقاء: نسبة الخلايا الميتة باستخدام AOPI. في هذه التجربة ، يتم تطبيع إشارة الفلورسنت إلى رقم PDO لكل بئر كما هو محدد بواسطة تصوير الخلايا الحية في اليوم 0 (يوم العلاج ، الشكل 6).

من القيود الأخرى على ورقة الأساليب هذه الاعتماد على السحب اليدوي للتجارب ، مما قد يؤدي إلى تباين أكبر في النسخ المتماثلة التقنية. يمكن تحقيق مزيد من التحسينات في استنساخ البيانات من خلال إضافة الأتمتة إلى خطوات أخرى من العملية التجريبية ، مثل استخدام معالج سائل آلي للطلاء وتوزيع الأدوية ، كما أوضح آخرون 8,10. ومع ذلك ، تتطلب هذه الإضافة استثمارا إضافيا في البنية التحتية البحثية التي قد لا تكون متاحة لجميع المحققين. نظرا لعدم التجانس في منطقة PDO لكل نموذج ، فإن تطبيع النتائج إلى رقم أو منطقة PDO الأولية في الوقت 0 h لا يزال نهجا مفيدا مع البذر الآلي.

الميزة الرئيسية ل Cytation 5 على منصات تصوير الخلايا الحية الأخرى هي القدرة على تخصيص ميزات الصورة والتحليل. ومع ذلك ، فإن برنامج Cytation 5 / Gen5 لديه منحنى تعليمي حاد ويفترض أن المستخدمين لديهم معرفة أساسية بالتصوير. أحد أهداف ورقة الأساليب هذه هو توفير تعليمات خطوة بخطوة لتقليل الحاجز أمام الباحثين الآخرين لدمج تقنيات تصوير الخلايا الحية المتطورة في برامج أبحاث شركة تنمية نفط عمان الخاصة بهم. في حين أن خطوات التحليل المحددة المعروضة هنا هي لنظام واحد ، يمكن للمستخدمين تطبيق مبادئ تعدد الإرسال على منصات أخرى ، على أساس أن التحليل النهائي قد يتطلب استخدام برامج تابعة لجهات خارجية ، مثل NIH ImageJ.

يجب اختيار مقاييس التحليل بناء على كل من الأهداف التجريبية وظروف الطلاء. على سبيل المثال ، إذا أجريت التجربة باستخدام صبغة فلورية لتحديد موت الخلايا ، فإن شدة التألق هي قراءة فعالة. يعتمد مقياس التألق الأكثر فعالية (إجمالي التألق مقابل متوسط شدة الكائن) على ظروف الطلاء (الشكل التكميلي 4). إذا كانت PDOs مشتتة بالتساوي ولها مورفولوجيا أكثر دائرية وتماسكا ، فيمكن تحديد التألق في مجموعة فرعية محددة من PDO. الوظيفة المحددة في برنامج Gen5 هي التحليل الخلوي ، والإخراج هو متوسط شدة الكائن. ومع ذلك ، إذا كان نموذج PDO متكتلا أو يحتوي على مورفولوجيا قرصية ، فإننا نوصي بتحديد كمية إشارة التألق على مستوى الصورة ؛ يمكن العثور على هذه الوظيفة ضمن إحصائيات الصورة ، والإخراج هو شدة التألق الكلية. في حين أن هذه الطريقة مفيدة لمراقبة التغييرات على مستوى البئر الفردي ، فإن هذا المقياس ليس محددا للكائنات ذات الأهمية ويمكن أن يتغير بشكل خاطئ إذا تحركت PDOs خارج القابس المعين خلال مدة التجربة. في السيناريوهات التي يوجد فيها حطام كبير أو خلايا مفردة ميتة ، يقترح استخدام التحليل الخلوي لإخراج أي إشارة فلورية غير مرتبطة على وجه التحديد بشركة تنمية نفط عمان. ويرد مثال على النتائج التفاضلية باستخدام التحليل الخلوي مقابل إحصاءات الصور في الشكل التكميلي 5.

لتحديد الحد الأمثل لوظيفة إحصائيات الصور ، يمكن استخدام أداة الخط. باستخدام أداة الخط ، يمكن للمستخدمين تحديد نطاق شدة التألق داخل الصورة. قمنا بتعيين الحد الأدنى كقيمة 25٪ لكثافة الذروة داخل الصورة. لعرض مناطق الفلورسنت المضمنة في العتبة المعينة ، حدد مربع "القيم المتطرفة للعتبة". قد يكون من الضروري إجراء ضبط إضافي لقيمة العتبة الأدنى.

يتمثل التحدي الكبير في تصوير الخلايا الحية في تخزين الكمية الهائلة من البيانات التي تم إنشاؤها مع كل تجربة. ويكتسي هذا الأمر أهمية خاصة في حالة ثقافات شركة تنمية نفط عمان، حيث تستخدم مكدسات Z للتصوير عبر عدة مستويات بؤرية وإنشاء إسقاط Z. هناك طرق متعددة للتغلب على هذه المشكلة. أولا ، تأكد من سعة تخزين كافية. لقد قمنا بتركيب ثلاثة محركات أقراص صلبة بإجمالي 17 تيرابايت. تشمل الخيارات الأخرى نقل الملفات التجريبية إلى محركات أقراص صلبة خارجية أو تخزين متصل بالشبكة. لا يوصى بكتابة الملفات مباشرة إلى التخزين المستند إلى السحابة. لتحليل البيانات التي تم تخزينها على محرك أقراص خارجي ، ما عليك سوى نقل التجربة وملفات الصور إلى جهاز كمبيوتر مزود ببرنامج Gen5 (ملاحظة: قد يستغرق نقل الملفات الكبيرة فترات زمنية طويلة). قبل التحليل ، يجب إعادة ربط الصور بالتجربة. افتح ملف التجربة، وانقر على البروتوكول في شريط الأدوات، وحدد خيارات البروتوكول. انقر فوق خيارات حفظ الصورة وانقر فوق تحديد مجلد صورة جديد. حدد موقع ملف الصورة وانقر فوق تحديد مجلد لإعادة الربط.

اعتمادا على أهداف التجربة ، قد يكون من المناسب أيضا استخدام ميزة binning داخل Gen5. يقلل Binning حجم الملف عن طريق تقليل عدد وحدات البكسل ، مما يؤدي إلى انخفاض دقة الصورة (راجع الخطوة 3.5.3.2). لذلك ، لا يوصى باستخدام binning إذا كانت الصور عالية الدقة مطلوبة. عند استخدام ميزة binning ، ستحتاج إعدادات التعرض إلى الضبط. بمجرد إنشاء الملف التجريبي ، انقر نقرا مزدوجا فوق قسم الصورة ، وانقر فوق رمز المجهر لإعادة فتح وضع التصوير اليدوي. استخدم وظيفة التعريض التلقائي أو اضبط التعريض الضوئي يدويا حسب الحاجة.

باختصار ، نقدم طرقا لتقييم موت الخلايا المبرمج وصحة الخلايا في PDOs استجابة للعوامل السامة للخلايا. الدراسات المستقبلية ضرورية لتحسين الأساليب وتطوير استراتيجيات تحليل إضافية للتصوير الحركي ل PDOs ، مثل الأنماط الظاهرية الأخرى وتأثيرات الأدوية التي تكون مثبطة للخلايا وليست سامة للخلايا. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في التوافر التجاري للأصباغ والكواشف المتوافقة مع BME. لا يزال هناك المزيد من العمل الضروري لفهم أفضل لكيفية استخدام تصوير الخلايا الحية الحركية بشكل كامل لاستخراج معظم البيانات من هذه النماذج.

الإفصاحات

KWT هي مالك مشارك لشركة Immorttagen Inc. CJD هو موظف في Agilent. عملت JSdB في المجالس الاستشارية وتلقت رسوما من Amgen و Astra Zeneca و Astellas و Bayer و Bioxcel Therapeutics و Boehringer Ingelheim و Cellcentric و Daiichi و Eisai و Genentech / Roche و Genmab و GSK و Harpoon و ImCheck Therapeutics و Janssen و Merck Serono و Merck Sharp و Dohme و Menarini / Silicon Biosystems و Orion و Pfizer و Qiagen و Sanofi Aventis و Sierra Oncology و Taiho و Terumo و Vertex Pharmaceuticals. هو موظف في معهد أبحاث السرطان (ICR) ، الذي تلقى تمويلا أو دعما آخر لعمله البحثي من AZ و Astellas و Bayer و Cellcentric و Daiichi و Genentech و Genmab و GSK و Janssen و Merck Serono و MSD و Menarini / Silicon Biosystems و Orion و Sanofi Aventis و Sierra Oncology و Taiho و Pfizer و Vertex ، والتي لها مصلحة تجارية في abiraterone ، تثبيط PARP في السرطانات المعيبة لإصلاح الحمض النووي ، ومثبطات مسار PI3K / AKT (لا يوجد دخل شخصي) ؛ تم تسميته كمخترع ، بدون مصلحة مالية لبراءة الاختراع 8 822 438 ، المقدمة من Janssen والتي تغطي استخدام أسيتات أبيراتيرون مع الستيرويدات القشرية ؛ كان CI / PI للعديد من التجارب السريرية التي ترعاها الصناعة ؛ وهو باحث أول في المعهد الوطني للبحوث الصحية (NIHR). ليس لدى أي مؤلفين آخرين أي تضارب محتمل في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لمركز شراء الأنسجة والدكتورة كريستين كولمان في جامعة أيوا لتقديم عينات أورام المرضى وللدكتورة صوفيا غابريلوفيتش في قسم أمراض النساء والتوليد للمساعدة في توليد نموذج شركة تنمية نفط عمان. كما نشكر الدكتورة فاليري سالفاتيكو (Agilent ، الولايات المتحدة الأمريكية) على التحليل النقدي للمخطوطة. نحن نعترف بمصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة / NCI CA263783 ووزارة الدفاع CDMRP CA220729P1 إلى KWT ؛ أبحاث السرطان في المملكة المتحدة ، سرطان البروستاتا في المملكة المتحدة ، مؤسسة سرطان البروستاتا ومجلس البحوث الطبية إلى JSdB. لم يكن للممولين أي دور في تصميم أو تحليل التجارب أو قرار النشر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 ملDot Scientific Inc1008113
15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
لوحة 96 بئرCorning Costar3596الدافئة مسبقا إلى 37 درجة ؛ لوحة
C 96-wellAgilent204626-100دافئة مسبقا إلى 37 درجة ؛ C
A83-01Tocris2939التركيز النهائي هو 500 نانومتر (مكون من وسائط الاستزراع العضوية)
مكون متقدم DMEM / F-12Gibco12634-010من وسائط الثقافة العضوية
B27 ملحقGibco17504044التركيز النهائي هو 1x (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
BioTek BioSpa 8 حاضنة آليةAgilentBIOSPAG-SNحاضنة منضدية يتواصل برنامج جدولة BioSpa OnDemand مع Gen5 لنقل اللوحات بين BioSpa و Cytation 5 للتصوير (يستخدم هذا البروتوكول الإصدار 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNPlate Reader ؛ يتم استخدام برنامج Gen5 لهذا الجهاز (يستخدم هذا البروتوكول الإصدار 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR & D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035أعيد تشكيلها في DMSO
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD2438
EDTA (0.5 م) ثيرموفيشر AM9260G
فورسكولينتوكريس1099التركيز النهائي هو 10 & مايكرو; M (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
GlutamaxGibco35050-061التركيز النهائي هو 1x (مكون من وسائط الثقافة العضوية) HEPES
Gibco15630-080التركيز النهائي هو 10 ملي مولار (مكون من وسائط الثقافة العضوية) EGF
البشري ، البروتين المؤتلف الخالي منGibcoAF-100-15-1MGالتركيز النهائي هو 0.5 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
بروتين مؤتلف FGF-10البشري Gibco100-26-1MGالتركيز النهائي هو 10 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
الإنسان R-Spondin 1 البروتين المؤتلفGibco120-38-5UGالتركيز النهائي هو 250 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية) محلول
مخزون الهيدروكورتيزونتقنيات الخلايا الجذعية7926التركيز النهائي هو 500 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
مكعب مرشح التصوير- مكعب مرشح التصوير GFPAgilent1225101
- TRITCAgilent1225125
Imaging LED GFP / CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Red DyeSartorius4641أعيد تشكيله في وسائط الثقافة العضوية
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633حل DMSO
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250التركيز النهائي هو 1.25 ملي مولار (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
Nexcelom Bioscience Via Stain AOPI StainStain Fisher-Scientific13366169أضف 1:50 حجم
نيكوتيناميدسيجما-ألدريتشN0636التركيز النهائي هو 10 ملي مولار (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
NogginR & D Systems6057-NGالتركيز النهائي هو 100 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140122التركيز النهائي هو 10 وحدات / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية) محلول
ملحي مخزن بالفوسفات (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05التركيز النهائي هو 100 & micro ؛ جم / مل (مكون من وسائط الاستزراع العضوية)
هيريجولين البشري المؤتلف بيتا ؛ -1بيبرو تك100-03التركيز النهائي هو 37.5 نانوغرام / مل (مكون من وسائط الثقافة العضوية)
محلول Staurosporine من Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632 ، CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000التركيز النهائي هو 5 & micro ؛ M (مكون من وسائط الاستزراع العضوية)
& بيتا ؛ - EstradiolSigma-AldrichE2758التركيز النهائي هو 100 نانومتر (مكون من وسط الثقافة العضوية)

المراجع

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Z Stack

مقالات ذات صلة