مقالة منهجية

تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66849

⸱

نوفمبر 8, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Division of Metabolic Health and Disease, Oregon National Primate Research Center, 3Human Metabolome Technologies (HMT) America, 4Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics, Vanderbilt University Medical Center, 5Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Veterans Affairs Tennessee Valley, 7Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل النوى عالية الجودة من جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية المجمدة لاستخدامها في تسلسل الحمض النووي الريبي المتزامن أحادي النواة وتسلسل ATAC مع الحفاظ على الجزء الخلوي الأكبر للتحليلات الأيضية من نفس العينات.

الملخص

يتمثل أحد التحديات في الدراسات التي تستخدم الأنسجة التي تم جمعها من مجموعات متعددة في تجنب تأثيرات الدفعات عند التحضير لتجارب متعددة الأوميك واسعة النطاق ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المشترك والأيض. تستخدم الطريقة في الدراسة الحالية جزر البنكرياس المجمدة بسرعة من الرئيسيات الجنينية غير البشرية التي تم جمعها على مدى عامين لإدخالها في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسات تسلسل ATAC. تم الاحتفاظ بالجزء الخلوي المتولد أثناء الاستخراج النووي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري في نهاية المطاف والقياس الكمي اللاحق للمستقلب. تسمح هذه الطريقة بالتحليل الجماعي للمستقلبات التي تساهم في تغيير المناظر الطبيعية النسخية وفوق الجينية في الظروف التجريبية. إنه قابل للتطبيق على العديد من أنواع الأنسجة ويزيد من كمية المعلومات التي يمكن استخراجها من العينات غير المتوفرة بسهولة. نظرا لأن مساهمة التمثيل الغذائي في إنشاء الهوية الخلوية عن طريق التعديلات اللاجينية تصبح أكثر تقديرا ، فإن التقنيات التي تسمح بتحديد مساهمة المستقلبات في أنواع معينة من الخلايا تأتي في الوقت المناسب وضرورية.

المقدمة

تعتبر جزر لانجرهانز البنكرياسية ضرورية لإدارة تحمل الجلوكوز طوال العمر. الفشل في ضبط مستويات الجلوكوز في الدم بشكل صحيح عن طريق هرمون خفض الجلوكوز أو الأنسولين أو هرمون رفع الجلوكوز ، يؤدي الجلوكاجون إلى مرض السكري1. تشمل عوامل الخطر القابلة للتعديل لتقليل مخاطر مرض السكري ممارسة الرياضة والنظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من الواضح أن النظام الغذائي للأم أثناء الحمل له أيضا تأثير على قابلية النسل للإصابة بمرض السكري في مرحلة البلوغ 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق لتحليل آثار النظام الغذائي للأم والتعرض الآخر ، مثل الأدوية المستخدمة أثناء الحمل ، على خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في الكائنات الحية النموذجية أثناء النمو. على سبيل المثال ، يمكن تقييم الجزر الصغيرة من نسل الرئيسيات الجنينية غير البشرية (NHP) لآثار التعرض التنموي. على غرار البشر ، عادة ما يكون لدى NHPs ولادات مفردة وتختلف في استجابتها الفسيولوجية لتغذية النظام الغذائي على النمط الغربي4. في حين أن الحمل وتطور الجنين في NHPs يشتركان في العديد من أوجه التشابه مع البشر ، مما يجعلهم من الأنواع ذات الصلة للغاية بدراسات البرمجة الأيضية ، فإن التحديات التي تواجه إجراء فحوصات المعلوماتية الحيوية المقارنة على نسل NHP تشمل موسم التزاوج المقيد وجمع العينات المتقطع. لذلك ، تعتبر الأساليب التي تسمح بالتخزين طويل الأجل قبل معالجة العينات وتحليلها مثالية. يصف هذا البروتوكول تحضير العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ، وتسلسل ATAC ، والأيض السيتوبلازمي السائب.

أظهرت الدراسات التي أجراها آخرون في مجال بيولوجيا الجزر تداخلا في التوقيعات الجينية التي لوحظت في العينات المحضرة عبر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة 5,6. تسمح كلتا الطريقتين بتحديد النصوص التي تساهم في تمييز السمات بين أنواع الخلايا المختلفة داخل سكان الجزر. من خلال استخدام المنظفات اللطيفة على الأنسجة المجمدة ، يمكن استخدام النوى السليمة في وقت واحد لتسلسل ATAC ، مما يسمح بتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها. يسمح الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة وتسلسل ATAC بتوصيف أفضل للشبكات التنظيمية الجينية7.

كان إعداد العينات لعلم الأيض محدودا تقليديا بسبب الحاجة إلى إدخال حجم عينة كبير للكروماتوغرافيا السائلة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر بعناية في المخازن المؤقتة المستخدمة أثناء تحضير العينة لتجنب قمم الرنين المغناطيسي النووي الخاطئة في بيانات قياس الطيف الكتلي. نظرا لانخفاض عدد العينات التي تمثل تحديا ومكلفة للحصول عليها في دراسات الرئيسيات ، فإن تخصيص الجزر من ذرية مختلفة نحو التجارب النسخية مقابل التجارب الأيضية قد يكون صعبا. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول الجزء الخلوي المهمل عادة المتولد أثناء التجزئة الخلوية لتجارب النواة الواحدة. تسمح هذه الطريقة بالتوصيف المتزامن للنصوص ومناطق الكروماتين المفتوحة التي تحدد المجموعات الفرعية الخلوية في جزر الجنين مع القياس الكمي للمستقلبات المنتجة داخل الجزر (الشكل 1). تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول مثبت نشرته 10x Genomics لعزل النوى من أنسجة دماغ الفأر الجنينية المجمدة (الإصدار CG000366 RevD 8)7.

البروتوكول

تم إجراء استرجاع الجزر وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) وجامعة أوريغون للصحة والعلوم وتمت الموافقة عليه من قبل ONPRC IACUC. يلتزم ONPRC بقانون ولوائح رعاية التي تفرضها وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبرات. تم تطبيق البروتوكول هنا على الجزر الصغيرة من المكاك Rhesus الجنينية التي تم تشريحها في يوم الحمل 145 (عادة ما يكون حمل المكاك الريسوس 173-175 يوما). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.

1. عزل الجزيرة

  1. استئصال البنكرياس الجنيني من الأنسجة المحيطة9 ووضعه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج.
  2. قم بإزالة البنكرياس من برنامج تلفزيوني ونفخه باستخدام كولاجيناز P (0.6 مجم / مل) عن طريق قنية قناة البنكرياس باستخدام حاقن قنية دماغ القوارض 33 جرام.
  3. قسم البنكرياس إلى ستة أقسام بمقص جراحي معقم واهضمه لمدة 27-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول كولاجيناز.
  4. قم بإعداد وسائط RT من خلال الجمع بين 10٪ FBS و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين في RPMI 1640.
  5. اسكب كولاجيناز وأضف 10 مل من وسائط RT.
  6. يهز بلطف لمدة 1 دقيقة لتعطيل النسيج الضام المتبقي.
  7. قم بإزالة المواد غير المهضومة عن طريق الإجهاد من خلال مرشح 500 ميكرومتر.
  8. اغسل الجزر مرتين باستخدام 50 مل من وسائط RT.
  9. احتضان الجزر في DNase I البقري (0.8 وحدة / مل) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  10. استزرع الجزر بين عشية وضحاها في وسط RT مع DNase I البقري (0.4 وحدة / مل) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  11. شحن الجزر في عبوات متخصصة في درجة الحرارة المحيطة مع عبوات جل للتحكم في درجة الحرارة.

2. عينة مصرفية للتخزين طويل الأجل

  1. قم بتقييم حجم الجزر الصغيرة باستخدام شبكاني متدرج ولاحظ درجة الأنسجة العنيبية والقنوية قيد التحضير.
  2. اختر الجزر الصغيرة يدويا باستخدام ماصة آلية في طبق 60 مم يحتوي على 5 مل من الجلوكوز 2.8 مللي متر DMEM.
    ملاحظة: من الضروري تقليل كمية الأنسجة العنيبية والأنسجة القنوية التي سيتم تخزينها في إعداد الجزيرة النهائي. تم الإبلاغ عن تفاصيل الجزر المثالية للاستخدام في البروتوكول السابق9.
  3. اختر الجزر الصغيرة في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتدويرها عند ~ 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. إعادة تعليق الجزر في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من 1x PBS.
  5. تدور لمدة 5 دقائق في ~ 300 × غرام في 4 °C. تخلص من المادة الطافية.
  6. كرر الخطوات 2.3-2.5 مرتين أخريين.
  7. قم بتجميد الجزر في أنبوب سعة 1.5 مل لمدة 10 ثوان في النيتروجين السائل.
  8. قم بتخزين الحبيبات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يوم العزل النووي.

3. التجزئة الخلوية لعزل النوى والكسر السيتوبلازمي

  1. تحضير المخازن المؤقتة لاستخراج النوى (الجدول 1).
    1. تأكد من أن المقعد والماصات والكواشف خالية من RNase.
    2. قم بإعداد الغسيل ، والتحلل المركز ، وتخفيف التحلل ، ومخازن النوى المخففة وفقا للجدول 1.
    3. قم بإعداد محلول تحلل 0.1x في أنبوب سعة 5 مل باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف التحلل لتخفيف المحلول المؤقت المركز.
  2. تجانس الأنسجة
    1. أخرج العينات من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها على الثلج على الفور.
    2. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل 0.1x إلى كريات الأنسجة واحتضانها لمدة 3 دقائق على الجليد.
    3. باستخدام مدقة بيليه خالية من RNase يمكن التخلص منها ، قم بتجانس الأنسجة برفق 15 مرة على الجليد.
    4. احتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق.
    5. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى المجانس وماصة بلطف على الثلج.
    6. قم بتجهيز مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر عن طريق إضافة 300 مل من المخزن المؤقت للغسيل إلى الفلتر فوق أنبوب سعة 5 مل.
    7. قم بتصفية التجانس الخلوي 1 مل باستخدام مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر في أنبوب 5 مل.
    8. قم بتدوير التجانس المرشح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
  3. جمع وتخزين المواد الطافية للأيض
    1. قم بإزالة 1 مل من المادة الطافية من الخطوة 3.2.8 باستخدام ماصة وأضفها إلى 1.5 مل كريوفيال على الجليد.
    2. قم بتجميد المادة الطافية على الفور عند -80 درجة مئوية. سيتم استخدام هذا الطافي في الأيض.
  4. تحضير النوى لنواة واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC
    1. أعد تعليق حبيبات النوى برفق عن طريق إضافة 1 مل من محلول الغسيل إلى الحبيبات بالتنقيط. ماصة ببطء 5 مرات.
    2. قم بتدوير الحبيبات المغسولة عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
    3. كرر الخطوتين 3.4.1 و3.4.2 مرة أخرى.
    4. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق النوى في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل. حافظ على التحضير النووي على الجليد.
    5. نضح 10 ميكرولتر من معلق النوى باستخدام ماصة واخلطها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق عن طريق السحب بلطف.
    6. أضف 10 ميكرولتر من النوى وخليط Trypan الأزرق إلى شريحة عداد خلية آلية باستخدام ماصة وضعها في الجهاز.
    7. تحديد تركيز النوى في النوى/ميكرولتر.
      ملاحظة: على عكس المستحضرات الخلوية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، ستكتشف عدادات الخلايا الآلية النوى كخلايا ميتة. لا ينبغي أن يكون أكثر من 95 ٪ من هذا التحضير على الهواء مباشرة على عدادات الخلايا الآلية. إذا كان أكثر من 5٪ من السكان النوويين على قيد الحياة ، فيمكن ترشيح معلق النوى مرة إضافية من خلال مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر وتدويره لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. يمكن بعد ذلك إعادة حساب تركيز النوى كما هو موضح في الخطوة 3.4.6.
    8. بناء على استعادة النوى المستهدفة المطلوبة ، أعد تعليق النوى إلى التركيز اللازم باستخدام محلول نوى 1x وانتقل إلى إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحاديالنواة 10.

4. تحضير الكسر الخلوي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري (CE-MS)

  1. اجمع بين 80 ميكرولتر من الكسر الخلوي الذي تم جمعه في الخطوة 3.3.1 مع 20 ميكرولتر من المياه النانو النقية التي تحتوي على معايير داخلية.
  2. تابع CE-MS والتحليل كما هو موضح سابقا11،12،13.

النتائج

تعتمد جودة مخرجات التسلسل اعتمادا كبيرا على جودة المدخلات النووية. سيؤدي التفجير النووي وتلف الغشاء النووي الخارجي إلى تلوث الحمض النووي الريبي والحمض النووي المحيط في التحليل ، مما سيؤدي إلى حدوث ضوضاء في البيانات. سيكون للمستخلص النووي النقي دليل ضئيل على وجود نوى مغلفة بمكونات سيتوبلازمية (الشكل 2 أ) أو فرط الهضم ، كما يتضح من انفجار النوى (الشكل 2 ب). سيحتوي المدخل النووي المثالي على نوى سليمة (الشكل 2C).

يتم توفير تفاصيل تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادية النواة على نطاق واسع في مكان آخر5،14. يتم توضيح مجموعات تمثيلية من المجموعات الخلوية من المستحضر النووي NHP الجنيني عبر UMAP في الشكل 3A. يتم تحليل بيانات الأيض بسهولة باستخدام برامج مفتوحة المصدر ، كما هو موضح سابقا15. يمكن تصور الأطياف المتولدة ، ويمكن مقارنة المستقلبات المخصبة في جزر الجنين من سد يتغذى على WSD بتلك الموجودة في سد يتم تغذيته بالأقراص المدمجة (الشكل 3B-F).

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول عزل النوى والكسر الخلوي. تم تخزين جزر البنكرياس الجنينية وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يوم الفحص. تم عزل النوى واستخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي النواة. تم الاحتفاظ بالجزء الخلوي بعد الغسل الأول لعزل النوى لقياس مطياف الكتلة الكهربائي الشعري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عرض توضيحي لمدخلات النوى المناسبة في مقايسة تعدد النواة المفردة. أمثلة على (أ) النواة المغلفة بالسيتوبلازم، (ب) النواة المتفجرة بغشاء نووي مخترق، (ج) النواة السليمة ذات التشكل المستدير. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: بيانات تمثيلية من تعدد النواة المفردة المركبة والأيض السائب. (أ) تجميع UMAP للأنواع الفرعية الخلوية داخل جزر NHP الجنينية المعزولة بناء على التعبير الجيني. التقدير الكمي لمستقلبات تحلل السكر ، (ب) فوسفات ثنائي هيدروكسي أسيتون و (ج) جليسرول-3-فوسفات في الجزء الخلوي من جزر NHP الجنينية المعزولة عندما تم تغذية السد ب WSD (mWSD) أو CD (mCD). قد ينظم النظام الغذائي للأم أيضا عملية التمثيل الغذائي بشكل تفاضلي عن طريق دورة حمض الستريك (2-oxoglutarate) ، (E) استقلاب الأحماض الأمينية (الكرياتين) ، وعن طريق تغيير (F) حالة الأكسدة والاختزال الخلوي (الجلوتاثيون) في جزر الجنين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تركيبات عازلة لعزل النوى. يتم عرض المكونات التفصيلية للنوى ، والتحلل ، وتخفيف التحلل ، ومخازن الغسيل. إذا لزم الأمر ، تمييع الكواشف لتركيز المخزون قبل إعداد المخزن المؤقت. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

تاريخيا ، استخدمت طرق العزل النووي لتسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي النواة مخازن تحتوي على منظفات لا تتوافق مع قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، وهي تقنية شائعة تستخدم لتحديد كمية الأيض16,17. يسمح البروتوكول الحالي بالجمع بين تقنيات النسخ والتمثيل الغذائي من نفس تحضير العينة باستخدام منظف لطيف للتجزئة الخلوية ، وبعد هذا التجزئة مع الرحلان الكهربائي الشعري ، وهي تقنية تتطلب إدخال عينة أصغر بالنسبة إلى الكروماتوغرافيا السائلة لفصل المستقلبات18.

الجانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الحفاظ على الغشاء النووي أثناء العزل النووي لتجنب تدهور المادة الوراثية وتقليل التلوث بالنيوكليوتيدات المحيطة والجزيئات الكبيرة. يمكن تعديل أوقات التعرض للعينة إلى المخزن المؤقت للتحلل لتجنب الإفراط في هضم الأنسجة وتلف النوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التجميد السريع للجزر أثناء تخزين العينات والمادة الطافية التي تحتوي على الجزء الخلوي أمر ضروري لتجنب تدهور المادة الوراثية والمستقلبات. يجب جمع جميع العينات من نفس تركيبة الوسائط (2.8 mM glucose DMEM في هذه الدراسة) لتجنب التأثير المربك لعملية التمثيل الغذائي المتغيرة بسبب توافر المغذيات في وسائط الاستزراع.

يتمثل أحد قيود هذا النهج الأيضي المشترك في أن بعض المستقلبات قد لا يتم التقاطها بسبب المنظف المستخدم لعزل النوى. لذلك ، من أجل تحليل مستقلب أكثر اكتمالا ، يمكن استكمال هذا النهج بتحليلات من الأنسجة المجمدة وعزل المستقلبات باستخدام مخازن الغسيل غير العضوية و LC-MS. النهج التكميلي الموصى به هو الأيض المكاني المستهدف عبر MALDI-MS لتوطين التغيرات الأيضية داخل الأعضاء19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التقنيات الحالية لتقييم تباين النص وإمكانية الوصول إلى الكروماتين داخل نفس النواة محدودة بسبب عمق التسلسل الضحل لتسلسل ATAC. في تحليلات البيانات ، سيتمكن الباحثون فقط من تقييم مناطق الكروماتين المفتوحة داخل مجموعات خلوية واسعة بدلا من مجموعات فرعية محددة داخل مجموعة البيانات.

نظرا لأن استخدام الأنسجة غير المتاحة بسهولة ، وخاصة تلك المأخوذة من البشر والرئيسيات غير البشرية ، أصبح أكثر تواترا ، فمن الضروري زيادة كمية المعلومات التي يمكن استخلاصها من النسخ البيولوجي إلى أقصى حد. يسمح النهج متعدد الأوميك الموصوف أعلاه للباحثين بربط التوقيعات الجينية بتوافر الذروة حول المحفزات الرئيسية للهوية الخلوية مع النظر أيضا في كيفية مساهمة التمثيل الغذائي الخلوي في مثل هذه التغييرات. إن تحديد المستقلبات الأكثر وفرة في المستحضرات الخلوية سيعطي أدلة على التعديلات اللاجينية المحددة التي من شأنها أن تدفع مواصفات الأنواع الفرعية الخلوية إلى سلالة معينة. في الواقع ، تم وضع بروتوكولات جديدة لدمج نتائج التجارب النسخية والأيضية ، وإن كان ذلك من مصادر الأنسجةالمختلفة 20. تكمن أهمية هذا البروتوكول في أنه يمكن تقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين والتغيرات النسخية وإثراء المستقلب من مدخل عينة واحدة. ستسمح التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية بتوصيف أفضل لحالات المرض في الأنسجة المكتسبة من مجموعات عينات متفرقة ، مثل الأنسجة من المرضى الذين يعانون من أمراض نادرة. في مجال بيولوجيا الجزيرة ، يمكن أن يوفر توصيف الشبكات التنظيمية الجينية والتوقيعات الأيضية التي ترتبط نظرة ثاقبة لآليات الحفاظ على هوية خلايا بيتا ووظيفتها لتجنب ظهور مرض السكري.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الفريق بأكمله في جامعة أوريغون للعلوم الصحية على رعاية مستعمرة الرئيسيات غير البشرية واكتساب الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت تقنيات فاندربيلت لعلم الجينوم المتقدم الخبرة الفنية ونصائح التصميم التجريبي. تم دعم DTC من خلال زمالة F31 لما قبل الدكتوراه من NIH / NIDK (1F31DK135164). تم دعم PK من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (1R01DK128187). تم دعم MG بجائزة VA Merit (I01 BX005399) ، و NIH / NIDDK (1R01DK135032 ، 1R01DK128187) ، و JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). تم دعم العمل في مركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) من قبل P51OD011092 للدعم التشغيلي للمركز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حاقن قنية دماغ الفئران 33 جرامProtech International8IC315IS5SPCلقنية القناة وتضخم البنكرياس
البنسلين / الستربتومايسينفيشر15-140-122لوسائط RT
FBSMillipore / SigmaF4135-500MLلوسائط RT
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11-875-135لوسائط RT
Collagenase Pسيجما ألدريتش11213865001لهضم البنكرياس
بقري دناسي Iسيجما ألدريتش11284932001لوسائط RT والعزل
سكر العنبفيشرD16-1سيكون التركيز النهائي 2.8 ملي
كلوريد الكالسيومفيشرC4901-500Gسيكون التركيز النهائي 0.5 ملي مولار
HEPESGibco15630-080نهائي سيكون التركيز 10 ملي مولار
ألبومين مصل البقر (BSA) جزء 5منتجات بحثية الدوليةA30075100سيكون التركيز النهائي 0.5 مجم / مل
11966025النسر المعدل المتوسط من Dulbeccoلقطف الجزر
20x Nuclei Buffer10X الجينوم2000153 / 2000207
Digitonin (5٪) ThermoFisher ScientificBN2006قد يحتاج الديجيتونين إلى التسخين إلى 65 درجة. C لإذابة
مصافي MACS SmartStrainers البيضاء (30 & micro; M)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10٪)Miltenyi Biotec130-091-376
IGEPAL CA-630Sigma Aldrichi8896قم بإعداد مخزون 10٪ باستخدام
محلول MilliQ Water Trizma Hydrochloride ، درجة الحموضة 7.5Sigma AldrichT2319-1L
محلول كلوريد الصوديوم ، 5 MSigma AldrichS6546-1L
محلول كلوريد المغنيسيوم ، 1 مسيجما ألدريتشM1028-100 مل
سيجما حامي مثبط رنازسيجما ألدريتش3335402001
DTT Research Products InternationalD11000-5.0
التخلصمنها فيشر ساينتفيك12-141-368
توين 20فيشر الكواشف الحيويةBP337-500قم بإعداد مخزون بنسبة 20٪ باستخدام أنابيب MilliQ
Water Free NucleasePromegaPR-P1193
DNA LoBind (5 مل)Eppendorf30108310
Cryovials (1.5 مل) VWR20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 مل) DenvilleC-2177
Trypan Blue (0.4٪)Thermo Fisher ScientificT-10282
شرائح عد الخلايا ذات الغرفة المزدوجةBio-Rad1450011
MiiliQ نظام المياه عالي النقاءMillipore / Sigma7003/05/10/15
مرشح القطع 5 كيلو دالتونHMT Metabolome Technologies
المعايير الداخلية HMTMetabolome Technologies
P10 و P20 و P200 و P1000 ماصاتEppendorf2231000602
أطراف الماصة ، 10 & micro ؛ LVWR76322-528
أطراف ماصة ، 1000 وميكرو ؛ Lثيرمو فيشر Scientific21-236-2A
أطراف ماصة ، 20 & ميكرو ؛ LGenesee Scientific23-404
أطراف ماصة ، 200 & micro ؛ Lالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-8810
مجهر تباين الطورأوليمبوسBX41-PH-B
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآليالحراري فيشر AMQAX1000
DPBS (1x) & nbsp ؛جيبكو14190-144
أليجرا X-30R جهاز طرد مركزيبيكمان كولترB06315
RNase-ZAPسيجما ألدريتشR2020
خالية من رناز خالية من الرناس بيليه بدوار يمكن

المراجع

  1. Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
  2. Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
  3. Salzberg, L. Risk factors and lifestyle interventions. Prim Care. 49 (2), 201-212 (2022).
  4. Pound, L. D., Kievit, P., Grove, K. L. The non-human primate as a model for type 2 diabetes. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 21 (2), 89-94 (2014).
  5. Kang, R. B., et al. Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  6. Basile, G., et al. Using single-nucleus RNA-sequencing to interrogate transcriptomic profiles of archived human pancreatic islets. Genome Med. 13 (1), 128(2021).
  7. Cabé, C. M., et al. High-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays. J Vis Exp. (202), e65715(2023).
  8. Nuclei from embryonic mouse brain for single cell multiome ATAC + gex sequencing. , Available from: https://www.10xgenomics.com (2022).
  9. Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. Analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption. J Vis Exp. (154), e60696(2019).
  10. Chromium next gem single cell multiome ATAC + gene expression reagent kits user guide. , Available from: https://www.10xgenomics.com (2022).
  11. Maruyama, A., et al. Extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry. J Vis Exp. (148), e59551(2019).
  12. Ooga, T., et al. Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia. Mol Biosyst. 7 (4), 1217-1223 (2011).
  13. Ohashi, Y., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS. Mol Biosyst. 4 (2), 135-147 (2008).
  14. Chiou, J., et al. Single-cell chromatin accessibility identifies pancreatic islet cell type– and state-specific regulatory programs of diabetes risk. Nat Genetics. 53 (4), 455-466 (2021).
  15. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. , 253(2024).
  16. Willency, J. A., Lin, Y., Pirro, V. Targeted metabolomics in human and animal biofluids and tissues using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. STAR Protoc. 5 (1), 102884(2024).
  17. Behnke, J. -S., Urner, L. H. Emergence of mass spectrometry detergents for membrane proteomics. Anal Bioanal Chem. 415 (18), 3897-3909 (2023).
  18. Ouimet, C. M., D'amico, C. I., Kennedy, R. T. Advances in capillary electrophoresis and the implications for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 213-224 (2017).
  19. Alexandrov, T. Spatial metabolomics and imaging mass spectrometry in the age of artificial intelligence. Annu Rev Biomed Data Sci. 3, 61-87 (2020).
  20. Ewald, J. D., et al. Web-based multi-omics integration using the analyst software suite. Nat Protoc. 19, 1467-1497 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جزر الرؤيسات في الرئيسيات غير البشريةجزر البنكرياسإمكانية الوصول إلى الكروماتينتقدير كمية المستقلباتالاستخلاص النوويقياس الطيف الكتلي بالرحلان الكهربائي الشعيريتحضير جزر الرؤيسات الجنينية
تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.