يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل النوى عالية الجودة من جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية المجمدة لاستخدامها في تسلسل الحمض النووي الريبي المتزامن أحادي النواة وتسلسل ATAC مع الحفاظ على الجزء الخلوي الأكبر للتحليلات الأيضية من نفس العينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتمثل أحد التحديات في الدراسات التي تستخدم الأنسجة التي تم جمعها من مجموعات متعددة في تجنب تأثيرات الدفعات عند التحضير لتجارب متعددة الأوميك واسعة النطاق ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المشترك والأيض. تستخدم الطريقة في الدراسة الحالية جزر البنكرياس المجمدة بسرعة من الرئيسيات الجنينية غير البشرية التي تم جمعها على مدى عامين لإدخالها في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسات تسلسل ATAC. تم الاحتفاظ بالجزء الخلوي المتولد أثناء الاستخراج النووي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري في نهاية المطاف والقياس الكمي اللاحق للمستقلب. تسمح هذه الطريقة بالتحليل الجماعي للمستقلبات التي تساهم في تغيير المناظر الطبيعية النسخية وفوق الجينية في الظروف التجريبية. إنه قابل للتطبيق على العديد من أنواع الأنسجة ويزيد من كمية المعلومات التي يمكن استخراجها من العينات غير المتوفرة بسهولة. نظرا لأن مساهمة التمثيل الغذائي في إنشاء الهوية الخلوية عن طريق التعديلات اللاجينية تصبح أكثر تقديرا ، فإن التقنيات التي تسمح بتحديد مساهمة المستقلبات في أنواع معينة من الخلايا تأتي في الوقت المناسب وضرورية.
المقدمة
تعتبر جزر لانجرهانز البنكرياسية ضرورية لإدارة تحمل الجلوكوز طوال العمر. الفشل في ضبط مستويات الجلوكوز في الدم بشكل صحيح عن طريق هرمون خفض الجلوكوز أو الأنسولين أو هرمون رفع الجلوكوز ، يؤدي الجلوكاجون إلى مرض السكري1. تشمل عوامل الخطر القابلة للتعديل لتقليل مخاطر مرض السكري ممارسة الرياضة والنظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من الواضح أن النظام الغذائي للأم أثناء الحمل له أيضا تأثير على قابلية النسل للإصابة بمرض السكري في مرحلة البلوغ 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق لتحليل آثار النظام الغذائي للأم والتعرض الآخر ، مثل الأدوية المستخدمة أثنا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء استرجاع الجزر وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) وجامعة أوريغون للصحة والعلوم وتمت الموافقة عليه من قبل ONPRC IACUC. يلتزم ONPRC بقانون ولوائح رعاية التي تفرضها وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبرات. تم تطبيق البروتوكول هنا على الجزر الصغيرة من المكاك Rhesus الجنينية التي تم تشريحها في يوم الحمل 145 (عادة ما يكون حمل المكاك الريسوس 173-175 يوما). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.
1. عزل الجزيرة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعتمد جودة مخرجات التسلسل اعتمادا كبيرا على جودة المدخلات النووية. سيؤدي التفجير النووي وتلف الغشاء النووي الخارجي إلى تلوث الحمض النووي الريبي والحمض النووي المحيط في التحليل ، مما سيؤدي إلى حدوث ضوضاء في البيانات. سيكون للمستخلص النووي النقي دليل ضئيل على وجود نوى مغلفة بمكونات سيتوبلازمية (الشكل 2 أ) أو فرط الهضم ، كما يتضح من انفجار النوى (الشكل 2 ب). سيحتوي المدخل النووي المثالي على نوى سليمة (الشكل 2C).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تاريخيا ، استخدمت طرق العزل النووي لتسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي النواة مخازن تحتوي على منظفات لا تتوافق مع قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، وهي تقنية شائعة تستخدم لتحديد كمية الأيض16,17. يسمح البروتوكول الحالي بالجمع بين تقنيات النسخ والتمثيل الغذائي من نفس تحضير العينة باستخدام منظف لطيف للتجزئة الخلوية ، وبعد هذا التجزئة مع الرحلان الكهربائي الشعري ، وهي تقنية تتطلب إدخال عينة أصغر بالنسبة إلى الكر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا الفريق بأكمله في جامعة أوريغون للعلوم الصحية على رعاية مستعمرة الرئيسيات غير البشرية واكتساب الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت تقنيات فاندربيلت لعلم الجينوم المتقدم الخبرة الفنية ونصائح التصميم التجريبي. تم دعم DTC من خلال زمالة F31 لما قبل الدكتوراه من NIH / NIDK (1F31DK135164). تم دعم PK من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (1R01DK128187). تم دعم MG بجائزة VA Merit (I01 BX005399) ، و NIH / NIDDK (1R01DK135032 ، 1R01DK128187) ، و JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). تم دعم العمل في مركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) من قبل P51OD011092 للدعم التشغيلي للمركز.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاقن قنية دماغ الفئران 33 جرام | Protech International | 8IC315IS5SPC | لقنية القناة وتضخم البنكرياس |
| البنسلين / الستربتومايسين | فيشر | 15-140-122 | لوسائط RT |
| FBS | Millipore / Sigma | F4135-500ML | لوسائط RT |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | لوسائط RT |
| Collagenase P | سيجما ألدريتش | 11213865001 | لهضم البنكرياس |
| بقري دناسي I | سيجما ألدريتش | 11284932001 | لوسائط RT والعزل |
| سكر العنب | فيشر | D16-1 | سيكون التركيز النهائي 2.8 ملي |
| كلوريد الكالسيوم | فيشر | C4901-500G | سيكون التركيز النهائي 0.5 ملي مولار |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | نهائي سيكون التركيز 10 ملي مولار |
| ألبومين مصل البقر (BSA) جزء 5 | منتجات بحثية الدولية | A30075100 | سيكون التركيز النهائي 0.5 مجم / مل |
| 11966025 | النسر المعدل المتوسط من Dulbecco | لقطف الجزر | |
| 20x Nuclei Buffer | 10X الجينوم | 2000153 / 2000207 | |
| Digitonin (5٪) Thermo | Fisher Scientific | BN2006 | قد يحتاج الديجيتونين إلى التسخين إلى 65 درجة. C لإذابة |
| مصافي MACS SmartStrainers البيضاء (30 & micro; M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Stock Solution (10٪) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | قم بإعداد مخزون 10٪ باستخدام |
| محلول MilliQ Water Trizma Hydrochloride ، درجة الحموضة 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| محلول كلوريد الصوديوم ، 5 M | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| محلول كلوريد المغنيسيوم ، 1 م | سيجما ألدريتش | M1028-100 مل | |
| سيجما حامي مثبط رناز | سيجما ألدريتش | 3335402001 | |
| DTT Research Products International | D11000-5.0 | ||
| التخلص | منها فيشر ساينتفيك | 12-141-368 | |
| توين 20 | فيشر الكواشف الحيوية | BP337-500 | قم بإعداد مخزون بنسبة 20٪ باستخدام أنابيب MilliQ |
| Water Free Nuclease | Promega | PR-P1193 | |
| DNA LoBind (5 مل) | Eppendorf | 30108310 | |
| Cryovials (1.5 مل) VWR | 20170-225 | ||
| Posi-Click Tubes (0.6 مل) Denville | C-2177 | ||
| Trypan Blue (0.4٪) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| شرائح عد الخلايا ذات الغرفة المزدوجة | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ نظام المياه عالي النقاء | Millipore / Sigma | 7003/05/10/15 | |
| مرشح القطع 5 كيلو دالتون | HMT Metabolome Technologies | ||
| المعايير الداخلية HMT | Metabolome Technologies | ||
| P10 و P20 و P200 و P1000 ماصات | Eppendorf | 2231000602 | |
| أطراف الماصة ، 10 & micro ؛ L | VWR | 76322-528 | |
| أطراف ماصة ، 1000 وميكرو ؛ L | ثيرمو فيشر Scientific | 21-236-2A | |
| أطراف ماصة ، 20 & ميكرو ؛ L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| أطراف ماصة ، 200 & micro ؛ L | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1120-8810 | |
| مجهر تباين الطور | أوليمبوس | BX41-PH-B | |
| الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآلي | الحراري فيشر AMQAX1000 | ||
| DPBS (1x) & nbsp ؛ | جيبكو | 14190-144 | |
| أليجرا X-30R جهاز طرد مركزي | بيكمان كولتر | B06315 | |
| RNase-ZAP | سيجما ألدريتش | R2020 |
المراجع
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
