مقالة منهجية

تحضير خراج الفطريات المدمج في حبة أجار لتلقيح الفئران ذات الكفاءة المناعية داخل القصبة الهوائية

1.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

أبريل 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقاوم الفئران بشكل عام العدوى بالمتفطرة الخراجية ، مما يعقد اكتشاف وتطوير المضادات الحيوية التي تشتد الحاجة إليها ضد الالتهابات الرئوية. هنا ، نصف طريقة تحضير اللقاح والعدوى داخل القصبة الهوائية التي ثبت أنها تسبب عدوى مستمرة في الفئران ذات الكفاءة المناعية.

الملخص

هناك حاجة ماسة إلى نماذج الفئران القوية للعدوى المزمنة بالمتفطرة الخراجية ، وهو عامل ممرض بيئي يفضل أن يصيب الرئتين. توفر العلاجات متعددة الأدوية لمدة عام معدلات شفاء ضعيفة بشكل غير مقبول لدى المرضى ، حوالي 50٪ ، ومن هنا تأتي الحاجة إلى أدوات تنبؤية قبل السريرية لتطوير مضادات حيوية أفضل. ومع ذلك ، فإن الفئران ذات الكفاءة المناعية تقاوم بشكل عام العدوى الرئوية بواسطة M. abscessus. تم الإبلاغ عن محاولات عديدة لإثبات عدوى مستمرة ب M. abscessus في الفئران ذات الكفاءة المناعية في الأدبيات. من بين هذه الطرق ، أثبتت الطرق التي تعتمد على البكتيريا المضمنة في حبة أجار التي تم تلقيحها في الفئران C57BL / 6 عبر الطريق داخل القصبة الهوائية أنها واعدة. يتمثل القيد الرئيسي لهذا النهج في التحدي التقني المرتبط بإعداد حبات أجار ذات حجم قابل للتكرار وأعداد بكتيرية ، يليها التلقيح داخل القصبة الهوائية. هنا ، نقدم أولا وصفا تفصيليا لبروتوكول محسن يوفر حبات أجار محملة ب M. abscessus ذات القطر الأمثل والعبء البكتيري القابل للتكاثر. بعد ذلك ، نقدم بروتوكولا مفصلا للتلقيح داخل القصبة الهوائية ، محسنا لتجنب فقدان الخرز والبكتيريا بسبب الالتصاق بأسطح أجهزة التلقيح ولتحقيق ترسب رئوي قابل للتكرار من M. abscessus المضمنة في أجار. الهدف هو ضمان سهولة التنفيذ وقابلية التكاثر الممتازة من مختبر إلى آخر.

المقدمة

خيارات علاج مرض المتفطرة الخراجية (Mab) محدودة وتتضمن أنظمة متعددة الأدوية لمدة عام مع المضادات الحيوية الفموية والحقن وأحيانا المستنشقة ، ومعظمها يفتقر إلى النشاط الأمثل للجراثيم ويرتبط بسمية كبيرة1،2،3،4،5. هناك حاجة ماسة إلى علاجات أقصر وأكثر أمانا وفعالية. كانت نماذج الفئران للعدوى الفطرية مفيدة في اكتشاف وتحسين الأدوية الفعالة وأنظمة الأدوية6،7. ومع ذلك ، فقد أثبت التقييم قبل السريري للمضادات الحيوية ضد عدوى Mab أنه يمثل تحديا بسبب صعوبة إنشاء التهابات رئوية تقدمية ومستمرة في الفئران8،9.

تؤدي إصابة سلالات الفئران ذات المناعة ب Mab إلى حد كبير إلى استعمار عابر متبوعا بإزالة سريعة من العامل الممرض10،11. لتحقيق العدوى المزمنة كما لوحظ سريريا ، تم استخدام عوامل تثبيت الحركة مثل الاغاروز أو الأجار لتعزيز استمرار مسببات الأمراض الانتهازية والاستجابات المناعية لها مثل Pseudomonas aeruginosa أو المستدمية النزلية في الفئران ذات الكفاءة المناعية12 ، 13 ، 14. تم تكييف هذا النموذج مؤخرا لتحقيق عدوى الجهاز التنفسي المزمنة بواسطة Mab ATCC 19977 في الفئران C57BL / 6N ذات الكفاءة المناعية15،16،17،18. تسببت الطريقة في حدوث عدوى مستمرة لمدة تصل إلى 45 يوما بعد التلقيح داخل القصبة الهوائية مع ~ 1 × 104 إلى 1 × 106 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) ، مع حدوث عدوى مزمنة بين الفئران المصابة بنسبة 90٪ -100٪ 19 وتشكيل أورام حبيبية منظمة حول حبة أجار المتحللة18. يبدو أن تضمين Mab في الخرز يحمي من التصفية السريعة من قبل الجهاز المناعي الفطري وأن الخرز المحمل بالبكتيريا يشكل بؤر لتجنيد الخلايا المناعية مما يؤدي إلى تكوين الأورام الحبيبية وإنشاء العدوىالمزمنة 18. تشكل حبات أجار / الاغاروز مادة حيوية خاملة نسبيا تحفز الحد الأدنى من الاستجابات الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، تتفكك الخرزات ببطء ، وتجنب مشاكل الحساسية في الجسم الغريب أو التليف المستحث. تضمن العدوى داخل القصبة الهوائية مع أو بدون جهاز الرش المجهري الترسب الفعال لللقاح في الرئتين8،20،21 وإعادة إنتاج التعرض السريري والعدوى بشكل أفضل من التلقيح الوريدي أو داخل الأنف.

لذلك ، يقدم النموذج العديد من المزايا. ومع ذلك ، فإنه يأتي أيضا مع بعض التحديات ذات الطبيعة الفنية ، وهي (أنا) تحقيق حجم حبة قابل للتكرار ، (2) الحصول على عبء بكتيري حبة قابل للتكرار ، و (3) ضمان توصيل اللقاح داخل القصبة الهوائية بشكل متسق. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتحقيق هذه الأهداف بشكل موثوق وضمان قابلية التكرار من مختبر إلى آخر.

البروتوكول

تم إجراء جميع الدراسات على وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة ل NIAID (NIH) ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها. أجريت جميع الدراسات التي شملت M. abscessus في مختبر بمستوى احتواء السلامة الأحيائية 2.

1. تحضير حبة أجار مدمجة M. abscessus لقاح

  1. قم بإعداد استزراع مسبق ل M. abscessus ATCC 19977 عن طريق تلقيح 1.5 مل من الكثافة الضوئية (OD600) 1 (باستخدام مقياس الطيف الضوئي) في 200 مل من وسط Middlebrook 7H9 مكمل بنسبة 0.05٪ (حجم / حجم) Tween 80 ، 0.5٪ (حجم / حجم) جلسرين ، و 10٪ (v / v) تخصيب ألبومين - سكر العنب - كاتالاز (ADC).
  2. احتضان الثقافات في زجاجة أسطوانية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة حتى تصل إلى مرحلة منتصف السجل (OD600 = 0.4-0.6).
  3. 1.2 جم من مرق الصويا Tryptic (TSB) في 40 مل من الماء عالي النقاء وأضف 0.6 جم من Difco Agar إلى تركيز نهائي قدره 1.5٪.
  4. انقل 60 مل من الزيت المعدني الثقيل إلى قارورة إرلينماير سعة 500 مل وقم بتعقيم كل من الزيت المعدني وأجار الصويا Tryptic (TSA) عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بالتوازن عند 50 درجة مئوية في الفرن.
  5. عينة 1 مل من الثقافة وقياس OD600.
  6. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3700 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 4 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco لتحقيق OD600 من حوالي 30.
  7. امزج 3 مل من المعلق البكتيري مع 27 مل من TSA المنصهر المتوازن مسبقا عند 50 درجة مئوية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. تخلط بسرعة عن طريق الدوامة أو سحب العينات.
  8. صب خليط البكتيريا أجار بحذر (30 مل) في 60 مل من الزيت المعدني وضع القارورة في وعاء ثانوي. اضبط الخليط بسرعة على الدوران بسرعة متوسطة (420 دورة في الدقيقة) على محرك مغناطيسي مضبوطة على 50 درجة مئوية ، باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي. تأكد من تشكل دوامة مرئية في مزيج أجار الزيت. يقلب لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. قم بتبريد الخليط عن طريق وضع الثلج في الوعاء الثانوي واستمر في التقليب لمدة 35 دقيقة.
  10. أوقف التقليب واترك ملاط حبة الأجار يرتاح لمدة 20 دقيقة (جدد الثلج حسب الضرورة).
  11. انقل خليط الملاط إلى أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مل واغسله 10 مرات بحجم واحد من DPBS لإزالة الزيت والبكتيريا الحرة (3700 جم ، 6 دقائق ، 4 درجات مئوية ، لأول 5 دورات).
    1. امزج معلقات حبة أجار في أنبوب واحد عند الغسيل الثالث. خلال أول 5 دورات غسيل ، استخدم ماصة مصلية لإعادة تعليق الخرز برفق.
    2. بالنسبة لدورات الغسيل الخمس اللاحقة ، استخدم معلمات الطرد المركزي التالية: 2000 جم لمدة 5 دقائق ، متبوعا ب 1000 جم لمدة 4 و 3 و 2 و 2 دقيقة على التوالي.
  12. أعد تعليق حبات الأجار في DPBS إلى حجم نهائي يبلغ 40 مل ، وانقلها إلى زجاجة معقمة سعة 125 مل ، وخفف 4 مرات بإضافة 120 مل من DPBS.
  13. مرر التعليق من خلال مصفاة خلية 200 ميكرومتر.
    1. قم بتوصيل المصفاة بأنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. ثم أضف عينة من المواد إلى المصفاة وقم بتصفية تعليق الخرزة.
    2. لتسهيل عملية الترشيح ، اجمع بين مصفاة خلية وقمع وحلقة موصل وأنبوب سعة 50 مل في وحدة. قم بتجميع الأجزاء بترتيب القمع ، ومصفاة الخلية ، وحلقة الموصل ، وأنبوب 50 مل ، واسحب ببطء مكبس حقنة 30 مل متصلة بحلقة الموصل.
  14. إذا لزم الأمر ، اشطف المصفاة من الجانب الآخر باستخدام DPBS لغسل أي حبات أكبر محتفظ بها. قم بتركيز المعلق المخفف عن طريق الدوران عند 1000 جم لمدة دقيقتين أو السماح للحبات بالاستقرار عن طريق الجاذبية. بعد الحصاد ، قم بتخزين حبات الأجار عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. يوصى بالتحضير الطازج لكل دفعة من التجارب.
  15. ماصة 5 ميكرولتر من تعليق الخرزة على شريحة زجاجية ، وقم بتغطيتها بقلة غطاء ، والتقط صورا في بعض المواضع العشوائية باستخدام مجهر ضوئي أو مضان بعدسة موضوعية 10×. احفظ الصور وقم بقياس قطر الخرزة باستخدام ImageJ (نطاق الحجم المطلوب: 200 ± 50 ميكرومتر).

2. معايرة حبة أجار مدمجة لقاح M. abscessus

  1. أضف 1 مل من تعليق الخرزة في أنبوب M وقم بتجانسها بشكل معقم لإطلاق البكتيريا المضمنة في الخرز باستخدام مفكك تم تعيينه على البرنامج المحدد مسبقا RNA.02.01.
  2. خذ 100 ميكرولتر من المتجانس وقم بتخفيف 1:10 إلى 1 × 10-5 تخفيف. نشر التخفيفات على أجار 7H10 مكملا بنسبة 10٪ حمض الأوليك - الألبومين - سكر العنب - الكاتلاز (OADC) و 2٪ جلسرين. تعداد CFU بعد 3 إلى 5 أيام من الحضانة.
  3. اضبط عيار اللقاح حسب الحاجة. على سبيل المثال ، إذا تلقى كل فأر 100 ميكرولتر من تعليق الخرزة يحتوي على 1 × 105 CFU إلى 10 فئران ، يتم تحضير ما مجموعه 2 مل معلق يحتوي على 1 × 106 CFU / مل بالإضافة إلى ~ 25٪ لحساب الخسائر في المحاقن.

3. اختبار توزيع الخرزة من خلال المحقنة والإبرة

ملاحظة: تم تضمين الخطوات التالية للتأكد من أن الخرزات لا تلتصق بأسطح المحقنة أو الإبرة. وجد أنه من المهم استخدام حقنة زجاجية وإبرة تغذية معدنية 24 جم لمنع فقدان الخرزات بسبب الالتصاق بالأسطح البلاستيكية.

  1. قم بإعداد PBST عن طريق إضافة 1.25 مل من Tween المعقم 80 إلى 500 مل من PBS المعقم.
  2. أضف 900 ميكرولتر من PBST إلى خمسة أنابيب M لاختبار حبات الأجار التي تمر عبر إبرة التغذية ، بالإضافة إلى 900 ميكرولتر من PBST في أنابيب معقمة سعة 2 مل لتحضير -2 إلى -6 تخفيفات لكل عينة دفع.
  3. امزج حبة أجار المضمنة في M. abscessus المحضرة مسبقا باستخدام ماصة P1000 لضمان تشتيت جميع الخرزات بالتساوي.
  4. قم بتوصيل إبرة تغذية معدنية 24 جم بالمحقنة الزجاجية وشفط تعليق حبة الأجار ، مع التأكد من تجنب تكوين فقاعات الهواء.
  5. بمجرد امتلاء المحقنة بدون فقاعات هواء ، ضع مشابك أو سدادات من النايلون على مكبس المحقنة ، مع عدم وجود مسافة بين المشابك. تسمح السدادات بالتوزيع الدقيق ل 50-100 ميكرولتر. من الممكن احتواء ما يصل إلى 6 مقاطع على طول المكبس.
  6. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخرز ("الدفع") في أنابيب M بترتيبها الخاص.
  7. بمجرد جمع 5 دفعات ، قم بتجانس الخرزات باستخدام مفكك الأنسجة المعدل وفقا لإعداد RNA.02.01 ، وهو مناسب لتحضير الحمض النووي الريبي من الأعضاء المجمدة والذي وجد أنه يطلق بشكل فعال M. abscessus من الخرز دون التأثير على بقاء الخلية.
  8. قم بإجراء التخفيف التسلسلي للمجانسات في حدود -1 إلى -6. قم بوضع التخفيفات على ألواح أجار 7H11 مكملة ب OADC. عد CFU بعد 5 أيام.

4. تلقيح الفئران داخل القصبة الهوائية

  1. تحضير الفئران CD-1 التي تتراوح أعمارها بين 6 و 8 أسابيع.
  2. تخدير الفئران باستخدام نظام التعرض للهباء الجوي الأيزوفلوران ، بمعدل تدفق 1-5٪ ، كما هو موضحسابقا 1.
  3. كبح جماح الفئران باستخدام حامل مائل مطبوع ثلاثي الأبعاد (3-D) (مصمم ومنتج خصيصا). يحتوي القضيب الموجود في وسط الحامل على خيط خياطة يحمل الماوس عموديا بواسطة القواطع ، مما يضع الفأر في وضع راقد بطني مع رفع رأسه.
  4. قم بتوصيل إبرة معدنية لتغذية 24 جم بحقنة زجاجية مملوءة بحبة أجار مدمجة في M. abscessus. ضع مشابك أو سدادات من النايلون على مكبس المحقنة لإصابة كل فأر ب 50 ميكرولتر من اللقاح.
  5. بمجرد تقييد الفأر المخدر على لدغة الخيط ، حرك اللسان إلى جانب الفم باستخدام قضيب مسحة قطنية.
  6. تخيل الجزء الخلفي من فم الفأر لتحديد الجزء الأبيض في الجزء الخلفي من الفم بوضوح واستهداف القصبة الهوائية للفأر.
  7. قم بزاوية إبرة التزقيم المعدنية عموديا فوق الماوس وأدخلها في الجزء العلوي من القصبة الهوائية. قد تكون هناك مقاومة طفيفة أثناء المرور عبر لسان المزمار.
  8. حرك إبرة التزقيم لأسفل في القصبة الهوائية ، وقم بإزالة مشبك النايلون أو السدادة ، وقم بتوزيع 50 ميكرولتر من حبة أجار مدمجة في M. abscessus.
  9. دع الماوس يرتاح لمدة 5 دقائق وكرر الخطوات 4.2 - 4.8 مرة ثانية. الغرض من إجراء التلقيح المكون من خطوتين هو ضمان ترسب عميق وقابل للتكاثر للتلقيح الكامل في الرئة.
  10. دع العدوى تتقدم لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك يتم القتل الرحيم للفأر لتعداد الترسب البكتيري في الرئتين.

النتائج

حجم الخرزة والعبء
لتصور حبات الأجار وعبئها البكتيري ، تم التعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry تحت المحفز التأسيسي Hsp60 في سلالة نوع Mab ATCC 19977 ودمج هذه السلالة في حبات الأجار كما هو موضح أعلاه. يوضح الشكل 1 أ نطاق حجم الخرزة (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). يوضح الشكل 1 ب عبء 6 مستحضرات حبة مستقلة ، مما يدل على قابلية تكرار الإجراء كما هو موضح.

طلاء الحقنة السريعة والزرع البكتيري بعد التلقيح داخل القصبة الهوائية
تم تحسين التلقيح داخل القصبة الهوائية في خطوتين. تم تعداد CFU / مل في اللقاح قبل وبعد المرور عبر المحقنة الزجاجية للتأكد من عدم تكبد أي خسائر في الخرزة أو البكتيريا أثناء مرور الخرزات عبر المحقنة والأنبوب المتصل. يوضح الجدول 1 العيار البكتيري الأولي لاثنين من مستحضرات الخرزة المستقلة (التجارب 1 و 2) وعدد CFU المستردة لكل 100 مل من عينات "دفعها من خلال" من حمولة حقنة واحدة. لتجنب الخسائر في الخرز والبكتيريا ، يلزم وجود حقنة زجاجية متصلة بأنبوب معدني. تميل حبات أجار إلى الالتصاق بالأسطح البلاستيكية.

أظهر تعداد CFU بمرور الوقت في تحضير الخرزة أن العبء البكتيري للخرز ظل مستقرا عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد ، مع فقدان ~ 2 ضعف العبء البكتيري كل أسبوعين ، وترسب الرئة غير المعوق. بعد ذلك ، أصيبت مجموعات من 5 إلى 8 فئران بثلاثة مستحضرات حبة مستقلة لاختبار قابلية تكرار إجراء التلقيح داخل القصبة الهوائية. يوضح الجدول 2 عدد CFUs الرئة لكل فأر, تعداد 24 ساعة بعد الإصابة كما هو موصوف.

أخيرا ، تم تقييم قابلية استنساخ العدوى بين المشغلين عن طريق إصابة ثلاث مجموعات من 10 فئران CD-1 ، يتم إجراء كل منها بواسطة مشغل مختلف. CFUs الرئة التي تم تعدادها بعد 24 ساعة تظهر في الشكل 2.

figure-results-1
الشكل 1: تجربة تجريبية لتقييم حجم الخرزة ، وتصور وقياس الحمل البكتيري M. abscessus . (أ) حبات أجار تحتوي على سلالة M. abscessus ATCC 19977 ، مصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry تحت محفز hsp60 التأسيسي. تم نشر خمسة ميكرولتر من تعليق الخرزة على شريحة زجاجية وتم تصويرها بمجهر فلوري مزود بكاميرا (هدف 10x). كل نقطة حمراء عبارة عن خلية بكتيرية فلورية ، محاطة بخرز أجار بأقطار تتراوح من ~ 70-250 ميكرومتر. (ب) العبء البكتيري ، في CFU / مل ، من 6 مستحضرات حبة فردية تظهر قابلية تكرار الطريقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: قابلية استنساخ العدوى بين المشغلين. أصيبت مجموعات من 10 إناث فئران CD-1 بالقصبة الهوائية من قبل ثلاثة مشغلين مستقلين كما هو موصوف ، باستخدام نفس مستحضر الخرزة. يتم عرض CFUs الرئة التي تم تعدادها بعد 24 ساعة من الإصابة. O1 وO2 وO3: عوامل التشغيل 1 و2 و3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

CFU / 100 ميكرولتر
تحضير حبةالتجربة 1التجربة 2
1.13 إ +052.40 إ +05
عينة دفع الحقنة
11.14 إ + 055.10 إ +05
21.36 إ +054.10 إ +05
39.30 إ +043.90 إ +05
49.80 مصريا +043.60 إ + 05
51.14 إ + 05
متوسط1.11ه + 054.18 إ +05
[سد]1.69E+04 (15٪)6.50E+04 (16٪)

الجدول 1: وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لكل عينة 100 ميكرولتر بعد المرور عبر المحقنة الزجاجية وإبرة التغذية المعدنية.

التجربة 1التجربة 2التجربة 3
معرف الماوسCFU / الماوسمعرف الماوسCFU / الماوسمعرف الماوسCFU / الماوس
م -16.50 إ +03م -62.20 إ +05م -116.80 إ + 04
م -21.10 إ +04إم -72.70 إ + 05م -121.70 إ + 05
م -31.40 إ +04م -88.10 إ + 04م -132.10 إ +05
م -43.20 إ +03م -91.40 إ +05م -144.40 إ +04
إم -54.50 إ + 03م -101.30 إ + 05م -157.50 إ +04
م -161.01 شرقي + 05
م -177.00 إ + 04
م -185.80 إ + 03
متوسط7.84 إ +03متوسط1.68 إ +05متوسط9.30 إ +04
[سد]4.54E+03 (58٪)[سد]7.57E+04 (45٪)[سد]6.67E+04 (72٪)

الجدول 2: زرع حبة أجار مدمجة في M. abscessus في رئتي الفأر بعد 24 ساعة من التلقيح

المناقشة

لضمان التوزيع المتساوي للبكتيريا في حبات الأجار ، من المهم تعليق خليط البكتيريا المنصهرة بشكل موحد قبل إضافته إلى مرحلة الزيت. تعتبر نسبة حجم الزيت إلى بكتيريا الأجار أمرا بالغ الأهمية في التحكم في حجم الخرزة. تؤدي نسبة الزيت إلى الأجار الأعلى إلى تكوين حبات أجار أصغر. عند خلط تعليق بكتيريا أجار مع مرحلة الزيت ، يعد التحكم في درجة الحرارة أمرا بالغ الأهمية. يجب أن يكون خليط الزيت وزيت أجار دافئا بدرجة كافية للسماح بتكوين الاستحلاب وتكوين القطرات ولكنه بارد بدرجة كافية حتى لا يضر البكتيريا. يسمح التقليب المستمر أثناء تبريد الخليط إلى درجة حرارة الغرفة أو أقل بتكوين قطرات أجار وتصلبها.

تعد المعايرة المناسبة للوحة التحريك وحجم قضيب التحريك وشكل وحجم القارورة من المحددات المهمة لدوامة موحدة. يخلق قضيب التحريك الموجود في وسط القارورة دوامة متماثلة ، مما يضمن خلطا موحدا. يمكن أن يؤدي شريط التحريك خارج المركز إلى دوامة غير مستقرة ، مما يؤدي إلى خرزات غير منتظمة الشكل وإدخال فقاعات هواء في الخرز. يوصى بالمراقبة في الوقت الفعلي وتعديل موضع شريط التقليب. يجب أن يكون حجم القارورة متناسبا مع حجم خليط أجار الزيت. تعتبر قارورة سعة 500 مل مثالية لتدوير خليط زيت أجار سعة 90 مل ، مما ينتج عنه دوامة مرئية. عند استخدام قوارير أكبر ، من المهم ضبط حجم خليط أجار الزيت ، وحجم النمام ، وسرعة الدوامة لتحقيق التوازن بين الخلط الفعال والدوامة المستقرة. يعد الحفاظ على سرعة دوامة ثابتة أثناء العملية وعبر تحضيرات الخرز أمرا بالغ الأهمية لقابلية التكاثر من دفعة إلى أخرى.

تم تكييف عملية تحضير حبة الأجار ، وتحديدا سرعة الدوامة ونسبة الزيت إلى الأجار ، من16،22 ، مع تعديلات طفيفة. تنتج قوى القص داخل دوامة الغزل بطبيعتها حبات بأحجام مختلفة. لتقليل هذا التباين في الحجم ، تم تعديل خطوة حصاد الخرزة عن طريق إدخال العديد من خطوات الغسيل ، باستخدام تدرج لتقليل سرعة الطرد المركزي والوقت لضمان إزالة الخرز صغير الحجم (والبكتيريا الحرة). تم استخدام مرشح شبكي صغير لإثراء الخرز بالحجم المطلوب ، وتصفية الخرز الأكبر حجما بشكل فعال وتلك التي قد تكون قد تشكلت من خلال الاندماج العشوائي. لتجنب خسائر الخرز أو البكتيريا أثناء مرور ملاط الخرزة عبر المحقنة والأنبوب المتصل لتلقيح الماوس داخل القصبة الهوائية ، من الأهمية بمكان استخدام حقنة زجاجية وإبر تغذية معدنية 24 جم وأنبوب متصل بالمعدن.

يتمثل القيد الرئيسي لهذه الطريقة في التعقيد التقني لتحضير الخرزة والتلقيح داخل القصبة الهوائية لتحقيق عبء الخرزة القابل للتكرار وزرع الرئة. مطلوب الاهتمام بالتفاصيل والقدرة على استكشاف الأخطاء وإصلاحها. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم التحقق من صحة النموذج بالكامل من خلال اختبار فعالية المضادات الحيوية القياسية للرعاية وتركيبات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا التي يتم إعطاؤها لمرضى Mab.

في الوقت الحالي ، لم يتم التحقق من صحة أي نموذج فأر لعدوى Mab المزمنة إلى الحد الذي يمكن التنبؤ به بشكل معقول من خلال النموذج9 بفعالية العوامل المفردة ومجموعات الأدوية في المرضى. تم استغلال نظام الفأر C57BL / 6 المضمن في حبة أجار لاختبار فعالية العلاجات المضادة للميكروبات15،19،23. أقرب بديل لنظام الماوس C57BL / 6 المضمن في حبة أجار هو نموذج الماوس C3HeB / FeJ ، والذي يعتمد على تثبيط المناعة ديكساميثازون لتحقيق عدوى مزمنةدائمة 24،25. تتمثل مزايا البروتوكول الموصوف هنا في أنه (1) يمكن استخدام الفئران C57BL / 6 ذات الكفاءة المناعية الكاملة وبأسعار معقولة ، (2) يمكن الحصول على عدوى منتجة ومزمنة باستخدام سلالة النوع ATCC 19977 المميزة جيدا ، و (ثالثا) لا توجد متطلبات لتثبيط المناعة المستحثة كيميائيا ، والتحايل على الحاجة إلى حقن الديكساميثازون اليومية ، وبالتالي تجنب التفاعلات الدوائية المحتملة والتأثير على أمراض المناعة الرئوية.

نظرا لعدم وجود نماذج فئران تم التحقق من صحتها لعدوى Mab المزمنة لتقييم الأدوية المرشحة الجديدة وأنظمة الأدوية8،9 ، فإن التقنية الموضحة هنا لديها القدرة على دفع المجال إلى الأمام ، وتحسين القيمة التنبؤية لبيانات الفعالية قبل السريرية ، والمساعدة في إعطاء الأولوية لأنظمة الأدوية ذات الإمكانات العالية لتوفير علاج دائم وتسريع اكتشاف الأدوية وتطويرها بشكل عام لمرض Mab الرئوي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مسببات الأمراض الرئوية الأخرى ولها سجل حافل بالمتصورة الزنجارية أو المستدمية النزلية. الهدف الرئيسي للبروتوكول الموصوف هنا هو توفير تفاصيل وتوصيات كافية لضمان سهولة التنفيذ وقابلية التكرار الممتازة من مختبر إلى آخر.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي ، DICK24XX0 الجائزة ، إلى TD و VD ، و R01-AI132374 من NIH-NIAID إلى TD و VD.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زجاجة 125 ملCorning8388معقمة
3 × 3 أنبوب عقد رففيشر5972-0030PKتطهير قبل استخدام
الماوس المطبوع ثلاثي الأبعادTransworld Marketing   ؛تم تصميمه وإنتاجه حسب الطلبمطهر قبل استخدام
48 بئر التخفيف لوحةCelltreat   ؛229192
أنابيب الطرد المركزي المعقمة سعة 50 ملGreiner Bio-One227261آلة
التخديرEZ-AF9000 SYSTEMN / A
Avanti J-15R & nbsp ؛بيكمان كولتر  B99517
ماصة حاجز الطرد المركزي في رف غطاء الرفع 1000GThermo Scientific ART  21-236-2A
حقيبة بيولوجيةفيشربراند22-044561
حلقة موصل   ؛pluriSelect41-50000-03
قضيب القطن ذو الرؤوسPuritan 22-029-571
حلقات التلقيح المعقمة التي يمكن التخلص منها صفراء معقمة 100 في حقيبة ziplockCole-Parmer Essentials 03-391-562
منشفة معقمة مبطنة بالبولي يمكن التخلصمنها Dynarex19-310-671معقم
Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفاتتوماس Scientific21-031-CM
قمعpluriSelect42-50000معقم
GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630مقياس الطيف
Gentlemacs مفكك الأنسجةMiltenyi Biotec130-096-427لا يتم تنشيط الحرارة
Hamilton حقنة  هاميلتون 80801مطهر قبل الاستخدام
زيت معدني ثقيلسيجما ألدريتش330760-1 لتر
محلول إيزوفلوران معقم زجاجة 250 ملكوفيتروس29405تآكل / تهيج الجلد: الفئة 2 ، تلف خطير في العين / تهيج العين: الفئة 2 أ ، السمية الجهازية للعضو المستهدف المحدد (تعرض واحد): الفئة 3
قد يسبب النعاس والدوخة ، ويسبب تهيجا خطيرا للعين ، ويسبب تهيج الجلد. لا تستنشق ، استخدمها في منطقة جيدة التهوية.
أنابيب M (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335معقم
MR Hei-Connect  هايدولف505-40000-13-1
شريط التحريك المغناطيسيتوماس العلمي  1181L08
ماصة ميكانيكية معقمة 100 &ndash ؛ 1000 & ميكرو; L Gilson PIPETMAN L FA10006Mتطهير قبل استخدام
الماصة الميكانيكية 20 &ndash ؛ 200 وميكرو ؛ L Gilson PIPETMAN L FA10003MGتطهير قبل الاستخدام
إبرة تغذية المعدنية 24 جراميجب تعقيم Braintree ScientificN-VP 24G-1S(تعقيمها)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500Gمعقم (معقم)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002معقم (معقم)
Middlebrook 7H9 متوسطبيكتون ديكنسون271310معقمة (معقمة)
أجزاء حامل الماوسTriMech Solutions SRV-AMS-FDMمطهر قبل الاستخدام
خياطة الحرير غير القابلة للامتصاصفيشر Scientific18020-50n / a
OADC Liquid Enrichment للاستخدام مع Middlebrook Media 500 ملThermo Scientific Remel   ؛R450605معقم
(10x) ، درجة الحموضة 7.4 معقمة مفلترة 500 ملGibco70-011-044
مناديل PeroxiguardPeroxigard29221n / a
أطباق بتري بغطاء شفاف دائري 100 مم × 15 ممFisherbrand   ؛FB0875712معقمة
PluriStrainer 200 ممpluriSelect43-50200-03معقمة ؛ مصفاة خلية
زجاجات أسطوانيةكورنينج430165
ماصة مصليةكورنينج4489
كوفيت مقياس الطيف الضوئي المعقمة 1.5 ملفيشر 14955127معقمة (معقمة )
سدادات حقنة أو مقاطع (نايلون)Trimech   ؛SRV-AMS-MJFمطهر قبل الاستخدام
مرق الصويا TrypticSigma-AldrichT8907-500GTween
معقم 80 & nbsp ؛فيشر170793فلتر معقم 
مفلتر ماصة أطراف رفع غطاء الرف 200G الحرارة العلمية ART21-236-1Aمعقمة
حامل المعقمة أنظمة أطراف معقمة ستارة معقم الضوئي محرك مغناطيسي PBS المعقمة معقمة تتحمل واسع

المراجع

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة