مقالة منهجية

وضع العلامات الفلورية لتصور البروتينات منخفضة التعبير في أسماك الزرد

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

يناير 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتسمية البروتينات بعلامة بروتين مضان في يرقات سمك الزرد ، وهو نظام تم تطويره وتعديله حديثا في الجسم الحي مفيد بشكل خاص لتصور البروتينات منخفضة الوفرة في أسماك الزرد.

الملخص

تسمح تقنية CRISPR / Cas9 بوساطة KNOCK-in (KI) بتسهيل وضع علامات على البروتين الفلوري في أسماك الزرد (Danio rerio) ، وهو كائن حي نموذجي مفضل للتصوير في الجسم الحي نظرا لشفافيته خلال مرحلة النمو المبكرة. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء جين التألق عالي الكفاءة KI ، والفحص السريع لمؤسسي KI ، وتتبع البروتين منخفض الوفرة في يرقات الزرد ، مما سيضع أساسا مهما للدراسات الفيزيائية المرضية اللاحقة في أسماك الزرد. يتضمن البروتوكول الحالي خطوات كاملة لتصميم sgRNA للجين محل الاهتمام ، و sgRNA في النسخ المختبري ، و Cas9 mRNA في النسخ المختبري ، وشاشة sgRNA في الجسم الحي للجين الذي يتمتع بأعلى كفاءة ، وتصميم وبناء البلازميد للمتبرع ، والحقن المجهري في يرقات الزرد ، وشاشة مؤسس KI والتصوير الحي لأسماك الزرد. يتم تضمين ومناقشة الخطوات الحاسمة ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها وطرق مراقبة الجودة ومزايا وتطبيقات هذا البروتوكول. يضمن هذا البروتوكول نتائج سريعة ودقيقة بتكلفة منخفضة وقد تم التحقق من صحته من خلال تجارب متعددة.

المقدمة

ككائن حي نموذجي مقبول جيدا ، يستخدم سمك الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع في البحث العلمي حول التطوير والتجديد وتكوين الأورام والعدوى والمناعة ، إلخ1،2،3،4،5. تعتبر أسماك الزرد مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي في الجسم الحي عند معالجتها باستخدام PTU (1-phenyl 2-thiourea) ، وهو مركب كيميائي سام يمنع تكوين الميلانين ويجعل يرقات سمك الزرد شفافة لفترة طويلة نسبيامن الزمن 6. تتوفر أيضا سلالات أسماك الزرد الشفافة المعدلة وراثيا ، مثل casper7 و crystal8 ، مما يسمح بالتصور المباشر وتتبع النسب حتى مرحلة البلوغ. إلى جانب هذه الجهود للتغلب على التصبغ من أجل تصور حي أفضل في الأسماك البالغة ، يركز بحثنا أيضا على تطوير استراتيجيات قوية لتحرير الجينات لجعل علامات البروتين الفلوري أكثر كفاءة وأقل اصطناعية.

يتم الآن تطبيق تقنية KI القائمة على الانضمام النهائي بوساطة CRISPR / Cas9 بوساطة CRISPR / Cas9 على نطاق واسع في التعديلات الجينية في كائنات حية متعددة ، بما في ذلك أسماك الزرد ، نظرا لكفاءتها العالية نسبيا في KI9،10،11،12. لتحقيق التصوير الناجح في الجسم الحي ، يجب معالجة تحديين. أحدهما هو الندلات أو الندوب التي أدخلتها عملية إعادة التركيب. والآخر هو أن بعض الجينات المستهدفة يتم التعبير عنها داخليا عند مستوى منخفض ، مما يؤدي إلى إشارات ضعيفة لعلامة التألق المعبر عنها بشكل مشترك وفشل الكشف في الجسم الحي . بهدف وضع علامات فعالة ودقيقة على البروتين وتقليل تداخل مستويات التعبير الجيني الداخلي ، أبلغ عمل حديث عن استراتيجية محسنة تجمع بين طريقة وضع العلامات "VH" لتضخيم الإشارة الفلورية وسير عمل شاشة السلالة الجرثوميةالمكرر 13 ، وهو أكثر ملاءمة لوضع العلامات على الجينات منخفضة التعبير عنها وأكثر كفاءة من الطرق السابقة عن طريق تحسين العمود الفقري للمتبرع والجمع بين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتحقق من التألق لتنفيذ فحص السلالة الجرثومية بأقل تكلفة من الوقت والجهد. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة للطريقة المبلغ عنها ، بما في ذلك خطوات تحضير الأجنة وتربية أسماك الزرد ، وتصميم sgRNA ، والنسخ المختبري ل sgRNAs ، والنسخ المختبري ل Cas9 mRNA ، والحقن المجهري لجنين الزرد ، والشاشة في الجسم الحي ل sgRNAs بأعلى كفاءة ، وتصميم وبناء البلازميد المتبرع ، والتنميط الجيني لأسماك الزرد KI ، وشاشة الخط الجرثومي KI ، وتصوير أسماك الزرد KI والتنميط الظاهري. لا شك أن هذا البروتوكول الشامل ، الذي يوفر طريقة حديثة لوضع العلامات على التألق ، سيعزز الدراسات التي تستخدم أسماك الزرد في مختلف المجالات العلمية ويفيد القراء من خلفيات أكاديمية مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع تربية وتجارب أسماك الزرد والموافقة عليها من قبل لجنة إدارة المختبر والأخلاقيات بجامعة شيامن وكانت متوافقة بدقة مع الممارسات الحيوانية الجيدة على النحو المحدد من قبل مركز المختبر بجامعة شيامن. امتثلت الدراسة لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة باستخدام.

ملاحظة: تم الحفاظ على جميع أسماك الزرد البالغة واليرقات باتباع البروتوكولات القياسية عند 28.5 درجة مئوية مع دورة ضوء / ظلام 13/11 ساعة في نظام حوض الزرد بجامعة شيامن. تم الاحتفاظ بالأجنة في المخزن المؤقت للجنين (الجدول 1) في حاضنة خاضعة للرقابة (درجة الحرارة ، 28 ± 0.5 درجة مئوية ؛ ضوء ، 13 ساعة ضوء / 11 ساعة دورة مظلمة). تم إجراء التغذية والمراقبة العامة لجميع أسماك الزرد مرتين يوميا (9 صباحا و 4 مساء). كانت سلالة النوع البري (WT) المستخدمة في هذا البحث هي Tübingen (Tü).

1. اختيار الجينات ذات الأهمية وتصميم دليل الحمض النووي الريبي

  1. تعرف على معلومات الجين محل الاهتمام. ابحث في قاعدة البيانات (https://zfin.org/) وتأكد من معرفة عدد المتغيرات الجينية. حدد المتغير الذي تريد معالجته وتنزيل معلومات الجينات المستهدفة من Ensembl (https://www.ensembl.org/) ، بما في ذلك تسلسل الجينوم وتسلسل (كدنا) وتسلسل الترميز (CDS). ضع علامة على exons و introns و UTRs ، وبدء الكودونات ، وإيقاف الكودونات في التسلسلات.
  2. اختر ما لا يزيد عن 200 نقطة أساس من CDS في المنبع من كودون التوقف (TAA أو TAG أو TGA) للجين المستهدف كمنطقة مستهدفة sgRNA.
    ملاحظة: من الأفضل التأكد من أن هذه المنطقة لا تحتوي على تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) عن طريق تسلسل الحمض النووي.
  3. استخدم موقع CRISPRscan على الويب (https://www.crisprscan.org/) لتصميم sgRNAs المرشحة داخل المنطقة المستهدفة المختارة والتنبؤ بكفاءات sgRNA.
    1. أدخل تسلسل الحمض النووي في إطار التصميم.
    2. حدد المعلومات المقابلة ، بما في ذلك الأنواع ، والحد الأقصى لعدم التطابق في خارج الأهداف ، والنوكلياز الداخلي ، والمروج. في هذه الحالة ، اختر الزرد- Danio rerio ، لا يوجد عدم تطابق ، Cas9-NGG ، ومروج T7 في المختبر.
    3. انقر فوق الحصول على sgRNAs للحصول على بعض sgRNAs. حدد 5-7 sgRNAs بدرجة CRISPRscan عالية ودرجة منخفضة خارج الهدف لشاشة in vivo .
  4. صمم بادئات PCR تحيط بالمواقع المستهدفة sgRNA التي يبلغ منتجها حوالي 500 نقطة أساس لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق ، واختبار الهضم الأنزيمي ، والتسلسل للتحقق من كفاءة خروج المغلوب بعد الحقن المجهري sgRNA / Cas9. حدد تسلسلا يبلغ حوالي 20 نقطة أساس في مناطق المنبع والمصب وتأكد من أن محتوى GC الخاص به يبلغ حوالي 50٪ وأن قيمة Tm تتراوح من 50-55 درجة مئوية.
    ملاحظة: صمم اثنين من البادئات الأولية واثنين من البادئات النهائية إذا كانت هناك حاجة للقيام بمجموعات.

2. تحضير sgRNAs

ملاحظة: تم استنساخ تسلسل سقالة sgRNA الشائع (الشكل 1) في بلازميد (جدول المواد).

  1. يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم التسلسل المترافق T7 المحفز - sgRNA باستخدام البادئات ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح في الجدول 2 والجدول 3 ، على التوالي. قم بتشغيل برنامج PCR في الجدول 4. تشغيل الرحلان الكهربائي للهلام (هلام الاغاروز ، 1.2٪ agarose في عازلة TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 5 دقائق) مع 2 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتأكد من صحة المنتجات (ميغاواط حوالي 150 نقطة أساس).
  2. قم بتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية (جدول المواد) أو غيرها من المجموعات المتوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا ، يجب استخدام الكواشف والمواد الخالية من RNase ، ويجب اتخاذ الإجراءات بحذر خاص لتجنب تلوث RNase (انظر المناقشة).
    1. أضف المخزن المؤقت الملزم إلى منتجات PCR بنسبة حجم 5: 1 واخلطها. ضع الخليط على العمود الموجود في أنبوب تجميع سعة 2 مل. جهاز طرد مركزي عند 17,900 × جم لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية. تخلص من التدفق وضع العمود مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    2. أضف 750 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية. تخلص من التدفق وضع العمود مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. جهاز طرد مركزي عند 17,900 × جم لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية. ضع العمود في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل.
    3. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية ، لتصفية الحمض النووي وقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  3. استخدم نظام إنتاج الحمض النووي الريبي T7 في جدول المواد أو مجموعات مكافئة لنسخ 250 نانوغرام من الحمض النووي المنقى في المختبر . مطلوب عمليات وشروط خالية من RNase.
    1. قم بإعداد التفاعل في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (خالية من RNase) وفقا للجدول 3 ، واخلطها برفق. احتضان عند 37 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 2 ساعة.
    2. أضف 0.5 ميكرولتر من DNase I (خال من RNase) ، واخلطه برفق. احتضن عند 37 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 15-20 دقيقة.
    3. ترسيب الإيثانول
      1. أضف الماء الخالي من RNase إلى كل تفاعل لجعل الحجم النهائي يصل إلى 20 ميكرولتر ، وانقل العينات إلى أنابيب 1.5 مل.
      2. أضف 50 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ (2.5 فولت ، خالي من RNase) ، واخلطه جيدا ، ووضع المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق ، وجهاز الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      3. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من 75٪ إيثانول (خال من RNase) ، وجهاز الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. تخلص من المادة الطافية ، وجفف الحبيبات عند 45 درجة مئوية في حمام معدني ، وقم بإذابتها ب 40 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
        ملاحظة: بالنسبة ل KI ، يجب أن تكون sgRNAs مترسبة ب LiCl (انظر أدناه) ، ولكن بالنسبة ل KO ، فهي ليست ضرورية.
    4. تشغيل المواد الهلامية الاغاروز (هلام الاغاروز: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 5 دقائق) مع 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لتقدير الجودة ثم قياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: يمكن تخزين sgRNAs عند -20 درجة Cor -80 °C لمزيد من الاستخدام.

3. تحضير Cas9 mRNA

  1. قم بإجراء الهضم الأنزيمي لبلازميد Cas9 (جدول المواد) لأكثر من 1.5 ساعة باستخدام XbaI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (لمزيج التفاعل ، انظر الجدول 3). الاختبار عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (هلام الاغاروز: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 10 دقائق) مع 1 ميكرولتر للتحقق من أن الهضم شامل.
  2. قم بتنقية المنتجات بنفس طريقة تنقية منتجات sgRNA PCR (الخطوات 2.2.1-2.2.3). من الآن فصاعدا ، هناك حاجة إلى مواد وعمليات خالية من RNase.
  3. استخدم مجموعة النسخ T3 (جدول المواد) أو مجموعات ما يعادلها للنسخ المختبري ل Cas9 mRNA.
    1. قم بإعداد التفاعل في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل الخالية من RNase وفقا للجدول 3 واخلطها برفق. احتضان عند 37 درجة مئوية لأكثر من 2.5 ساعة.
    2. أضف 1 ميكرولتر من Turbo DNase الخالي من RNase واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
    3. هطول الأمطار LiCl
      1. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل ، وأضف 30 ميكرولتر من LiCl (1.5 فولت) ، واخلطها برفق.
      2. ضعي المزيج على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 21,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      3. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من 75٪ إيثانول (خال من RNase) ، وجهاز الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. تخلص من المادة الطافية ، وجفف الحبيبات عند 45 درجة مئوية ، ثم قم بإذابتها في 40 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  4. قم بقياس تركيز Cas9 mRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تشغيل المواد الهلامية الاغاروز (هلام الاغاروز: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 10 دقائق) مع 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي للتحقق من التركيز والجودة.
    ملاحظة: يجب أن يكون OD 260/280 أعلى من 2.0 ، ويجب أن يكون التركيز حوالي أو أعلى من 1000 نانوغرام / ميكرولتر. يمكن تخزين Cas9 mRNA عند -20 درجة Cor -80 °C لمزيد من الاستخدام.

4. التحضير للحقن المجهري

  1. تحضير سمك الزرد: في الليلة التي تسبق الحقن المجهري ، ضع أنثى سمكة زرد صحية واثنين من ذكور الزرد الأصحاء في حوض التزاوج ، باستخدام مقسم لفصل الذكور والإناث لإعدادهم للتزاوج.
  2. تحضير 4٪ من الاغاروز ، ومحلول التحلل ، ومخزن الجنين (الرقم الهيدروجيني 8.0) (الجدول 1).
  3. تحضير الإبر الزجاجية الشعرية للحقن المجهري (جدول المواد).
  4. تحضير ألواح الحقن المجهري: صب 35 مل من 4٪ agarose المذاب في طبق بتري مقاس 10 سم وضع قالب بلاستيكي برفق لإنشاء أحواض على شكل إسفين. تجنب فقاعات الهواء عن طريق النقر برفق على القالب. بعد أن تصلب ، أضف بعض الماء المقطر المزدوج (ddw) إليها وضع اللوحة على حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.

5. اختبار كفاءة sgRNA من خلال الحقن المجهري

  1. في يوم الحقن المجهري ، قم بإعداد مزيج الحقن المجهري كما هو موضح في الجدول 5 على الجليد في بيئة خالية من RNase.
  2. قم بتحميل محلول الحقن المجهري في الإبرة باستخدام طرف ماصة خال من RNase (جدول المواد). احرص على عدم إحضار الفقاعات.
  3. ضع الإبرة المحملة في معالج دقيق متصل بحاقن دقيق. اقطع طرف إبرة الحقن تحت المجهر باستخدام الملقط المدبب ، واضغط برفق على طرف الإبرة لكسرها. بعد ذلك ، اضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة باستمرار قطرة 1 nL ، والتي يتم قياسها كميا باستخدام ميكرومتر المرحلة والشعيرات الدموية.
  4. قم بإزالة الحاجز واترك السمك يتكاثر لمدة 6 دقائق. جمع ونقل الأجنة المكونة من خلية واحدة إلى طبق بتري يحتوي على عازلة الجنين.
    1. افحص صحة الأجنة تحت المجهر الضوئي وقم بإزالة أي بويضات أو حطام غير مخصب. ضع جانبا 20 جنينا سليما كعناصر تحكم غير محقونة في طبق بتري منفصل وملصق منفصل.
  5. قم بنقل الأجنة السليمة المكونة من خلية واحدة واصطفها برفق على أخاديد لوحة الحقن المجهري التي تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام فرشاة صغيرة. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد.
  6. قم بإجراء جميع العمليات اللاحقة تحت مجهر ستيريو. استخدم طرف الإبرة لضبط موضع الجنين برفق بحيث يواجه عمود الإبرة. حقن 1 نانولتر من المحلول المختلط في عمود.
  7. ما يقرب من حقن 100 جنين كاف ل [سغرنا] واحدة. بعد الحقن ، اشطف الأجنة برفق في صفيحة من ستة آبار مع عازلة للجنين. ضع الطبق في حاضنة درجة حرارة ثابتة 28.5 درجة مئوية. في حوالي 10 ساعات بعد الإخصاب (HPF) ، افحص التطور الجنيني تحت مجهر ستيريو وقم بإزالة الأجنة الميتة.
  8. عند 24 hpf ، اجمع الأجنة في أنابيب 1.5 مل للتنميط الجيني (3 أنابيب لكل sgRNA و 5 أجنة لكل أنبوب). تخلص من الماء الزائد بعناية باستخدام ماصة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل المحتوي على البروتيناز K (بتركيز نهائي قدره 0.5 مجم / مل) في كل أنبوب ، واحتضانه عند 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  9. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول (2 فولت) ، واخلطه جيدا ، وجهاز الطرد المركزي عند 19,000 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
  10. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول ، وجهاز طرد مركزي عند 19,000 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
  11. تخلص من المادة الطافية ، وجفف الحبيبات في RT ، وقم بإذابتها ب 50 ميكرولتر من ddw. بعد ذلك ، استخدم 1 ميكرولتر من المستخلصات لتحضير مزيج التفاعل ل PCR (الجدول 3) (بالنسبة لبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انظر الخطوة 1.4).
  12. تشغيل المواد الهلامية الاغاروز (هلام الاغاروز: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 10 دقائق) مع 2 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتأكد من نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم إجراء عمليات الهضم الأنزيمية (الجدول 3) لتحديد كفاءة sgRNAs. اخلطي مزيج الهضم الأنزيمي برفق. احتضان في درجة الحرارة للفترة الزمنية التي اقترحتها الشركة المصنعة.
  13. قم بتشغيل المواد الهلامية الاغاروز للمنتجات المهضومة (هلام الاغاروز: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE ؛ عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 10 دقائق) مع منتجات PCR غير المهضومة كعناصر تحكم لتأكيد ما إذا كان الهضم يحدث.
    ملاحظة: يقع موقع انقسام Cas9 على بعد حوالي 3 نقاط أساس من PAM ، لذا فإن موقع التعرف على إنزيم التقييد هو الأفضل لتغطية 6 نقاط أساس في المنبع من PAM. إذا كانت كفاءة sgRNA عالية ، فإن القطع والإصلاح الخاطئ سيؤدي إلى indels ، لذلك هناك احتمال كبير أن إنزيم التقييد لم يعد قادرا على التعرف على موقع القطع. إذا كان sgRNA غير فعال وكان موقع التعرف على إنزيم التقييد سليما ، يمكن أن يحدث الهضم الأنزيمي بشكل طبيعي. من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، يمكن للمرء أن يميز ما إذا كان الهضم الأنزيمي قد حدث.
  14. إذا لم يكن هناك موقع مناسب للتعرف على إنزيم التقييد ، فقم بتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وحلل كفاءة sgRNA بواسطة TIDE (https://tide.nki.nl/). تذكر أن تفعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وأيضا تسلسل الحمض النووي الجيني WT كعنصر تحكم.
    1. افتح موقع الويب وانقر فوق بدء TIDE. أدخل تسلسل التوجيه ل sgRNA في الإطار ضمن تسلسل الدليل.
    2. انقر فوق استعراض ضمن مخطط اللوني لنموذج التحكم (.ab1 أو .scf) لإدخال نتيجة التسلسل لعنصر تحكم WT وانقر فوق استعراض ضمن نموذج اختبار اللوني (.ab1 أو .scf) لإدخال نتيجة التسلسل للعينة التي تم تحريرها.
    3. انقر فوق تحديث طريقة العرض. سيعطي موقع الويب نسبة مئوية من الفرق بين التسلسلين. تشير النسبة المئوية الأكبر إلى كفاءة أعلى من sgRNA. يعتبر sgRNA بكفاءة خروج المغلوب أعلى من 80٪ مناسبا لإجراءات KI اللاحقة.

6. بناء البلازميد المتبرع لوضع علامات البروتين الفلوري

  1. تسلسلات التصميم التي سيتم استنساخها أولا في البلازميد ثم إدخالها في جينوم الأسماك كما هو موضح الشكل 2: تم تصميم تسلسل 25 نقطة أساس في المنبع من موقع انقسام Cas9 المتوقع كذراع التماثل الأيسر ، وتسلسل 25 نقطة أساس في اتجاه مجرى موقع انقسام Cas9 المتوقع هو ذراع التماثل الأيمن. أدخل CDS بين الموقع المستهدف sgRNA وكودون التوقف في المتبرع للحفاظ على سلامة الجين الداخلي.
    ملاحظة: يجب أن يكون 5 'من CDS المكملة (العنصر 4 في الشكل 2) مترادفا لتجنب الانقسام الثانوي للجينوم المؤتلف بواسطة مركب sgRNA / Cas9.
  2. استخدم الاستنساخ المستقل عن الربط (LIC) 14 باستخدام نوكلياز خارجي III (جدول المواد) لبناء البلازميد المانح. طرق أخرى ، مثل تجميع جيبسون ، ممكنة أيضا. يتم توضيح الاشعال للاستنساخ في الشكل 2. يتم حمل العناصر "1" و "2" و "3" و "4" بواسطة البادئات:
    1. تصميم التمهيدي F1 ، الذي يتكون من تسلسل متداخل مع المتجه ، العنصر "1" وجزء من العنصر "2".
    2. Design Primer R2 ، والذي يتكون من جزء من العنصر "1" والعنصر "2" والعنصر "3".
    3. Design Primer F2 ، الذي يتكون من العناصر "3" و "4" وتسلسل 5 'من CDS بعد الموقع المستهدف sgRNA.
    4. تصميم التمهيدي R1 ، والذي يتكون من تسلسل 3 بوصات من CDS للجين وتسلسل متداخل مع المتجه.
    5. استخدم (كدنا) لسمك الزرد كقالب وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال.
      ملاحظة: التداخل الموصى به بين البادئات أو بين التمهيدي والمتجه هو 15-20 نقطة أساس. هذه الاشعال خاصة بالجين المستهدف ، ويرد مثال على الاشعال ل cx39.9 و cx44.1 في الجدول 2. تم تطبيق هذا التصميم بنجاح كما هو موضحسابقا 13. يتم توفير خرائط البلازميد التفصيلية في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2. يتم توفير تسلسل الحمض النووي والبروتين المصمم ل cx39.9 و cx44.1 في الملف التكميلي 3.
    6. قم بتنقية منتجات PCR بنفس طريقة تنقية منتجات sgRNA PCR (الخطوات 2.2.1-2.2.3).
  3. هضم ناقل المتبرع (الشكل 3 والجدول 6) بواسطة إنزيمات التقييد المناسبة. في هذا المثال ، الإنزيمات هي PciI و Acc65I (جدول المواد). قم بإجراء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الجدول 3). قم بتنقية الناقل المتبرع المهضوم بنفس طريقة منتجات sgRNA PCR (الخطوات 2.2.1-2.2.3).
  4. تحديد شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى وناقل المتبرع المهضوم بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي (هلام الحمض النووي: 1.2٪ agarose في المخزن المؤقت TAE; عازل TAE [الجدول 1]؛ 200 فولت ؛ حوالي 10 دقائق). قم بإعداد مزيج التفاعل ل LIC وفقا للجدول 3.
    ملاحظة: يجب وضع جميع أنابيب ومكونات التفاعل على الجليد ، ويجب إجراء التفاعل وجميع التلاعبات على الجليد. أضف 1 ميكرولتر من Exo III (20 وحدة) إلى التفاعل كمكون أخير ثم قم بتدوير الماصة على الفور لأعلى ولأسفل لخلط جميع المكونات جيدا. تذكر تضمين مزيج تفاعل واحد بدون شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل كعنصر تحكم لإظهار إمكانية التلدين الذاتي للناقل المهضوم.
  5. ضع مزيج التفاعل على الفور على الثلج واحتضنه لمدة 60 دقيقة.
  6. أضف 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0) لإيقاف التفاعل، ثم قم بتسخين الماصة لأعلى ولأسفل لخلط جيدا، ثم احتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم على الجليد لمدة 5 دقائق.
  7. قم بتحويل الخلايا المختصة ، مثل DH5α ، باستخدام منتجات LIC وقم بزراعة البكتيريا على ألواح LB (جدول المواد والجدول 1) باستخدام المضادات الحيوية المناسبة (الأمبيسلين في هذه الحالة) لمدة 16 ساعة.
  8. تأكد من وجود اختلافات في الحجم بين عدد المستعمرات الموجودة على الألواح المحتوية على شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل وتلك الموجودة على لوحة التحكم. اختر مستعمرات مفردة من ألواح LIC لتحليل الهضم الأنزيمي وتسلسل الحمض النووي.
  9. استخرج وتنقية البلازميدات المانحة الصحيحة باستخدام مجموعة تنقية بنفس طريقة منتجات sgRNA PCR (الخطوات 2.2.1-2.2.3). تأكد من أن التركيز النهائي أعلى من 300 نانوغرام / ميكرولتر.

7. الحقن المجهري لأجنة الزرد للجين KI

  1. إجراء جميع عمليات التلاعب بالحقن المجهري الموضحة أعلاه ، باستثناء تحضير محلول الحقن المجهري وفقا للجدول 7.

8. فحص وتحديد النسل المسمى بالبروتين الفلوري

  1. راقب التألق تحت مجهر مضان ستيريو بعد 12-48 ساعة من الحقن المجهري.
  2. تطبيق طريقة شاشة تم إنشاؤهاحديثا 13. إذا لوحظ تأمل واضح ، فاختر يرقات الفلورسنت وقم بتربيتها. إذا لوحظ فقط أثر للتألق أو حتى عدم وجود مضان ، فقم بدعم جميع اليرقات المحقونة.
  3. في عمر شهر واحد ، قم بتخدير سمك الزرد المحقون بالحقن الدقيق بنسبة 0.02٪ ثلاثيين (الجدول 1). لكل سمكة زرد ، اجمع قطعة صغيرة من الزعنفة الذيلية في أنبوب PCR مسمى واحتفظ بأسماك الزرد المخدرة المقابلة في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار تحتوي على ماء مفلتر معقم بالأشعة فوق البنفسجية (درجة الحموضة 7.2) بنفس الملصق.
  4. استخدم طريقة التحلل القلوي (المخزن المؤقت للتحلل في الجدول 1) 15 لاستخراج الحمض النووي الجيني ، متبوعا ب 5'-junction PCR. صمم التمهيدي الأمامي في أعلى ذراع التماثل الأيسر والتمهيدي العكسي على الملحق (الشكل 4). يبلغ حجم منتج PCR حوالي 500 نقطة أساس. للحصول على أمثلة على البادئات ، انظر الجدول 2.
    ملاحظة: بالنسبة لأسماك الزرد الفلورية ، يتم استخدام PCR هذا للتحقق من دقة KI ، لذلك يخضع منتج PCR بعد ذلك للتسلسل. بالنسبة لأسماك الزرد بدون تألق ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل هذا للتحقق مما إذا كان KI يحدث. اختر الأسماك الإيجابية ل PCR وقم بتربيتها حتى مرحلة البلوغ على أنهاF 0.
  5. افحص أجنة F1 التي تم الحصول عليها من تزاوج F0 الذي تم فحصه مع WT لأنماط تعبير GFP والتنميط الجيني بواسطة تقاطع تفاعل البوليميراز المتسلسل
    ملاحظة: إذا حدث الإدراج المستهدف في F1 (سواء كان مثاليا أم لا) ، تعريف F0 المقابل على أنه F0 وراثي ، ثم يتم تسلسل منتج PCR الخاص به. إذا كان الإدراج دقيقا ، يتم تعريف F0 المقابل على أنه F0 المطلوب.
  6. عند الحصول على F0 المطلوب ، استخدم النسل للتصوير لمراقبة البروتين المستهدف وتتبعه.

9. التصوير ومعالجة البيانات

  1. تحديد مرحلة النمو المراد تصويرها. تحضير السمك مقدما. أضف 1-فينيل 2-ثيوريا المخفف (PTU ؛ 0.003٪ ، جدول المواد) إلى الأسماك لإزالة الأصباغ إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: ستكون PTU أقل فعالية إذا تم تطبيقها بعد 24 حصان. في هذا المثال ، تمت إضافة PTU إلى المخزن المؤقت للجنين قبل 24 hpf والاحتفاظ بها في المخزن المؤقت حتى 48 hpf عندما تمت معالجة يرقات الزرد للتصوير.
  2. أضف 2 مل من الاغاروز المذاب بنسبة 4٪ (الجدول 1) إلى طبق 35 مم واتركه جانبا حتى يتصلب. انقل السمكة إلى مخزن الجنين الذي يحتوي على 0.02٪ ثلاثاء (الجدول 1).
  3. خفف 200 ميكرولتر من 4٪ agarose المذاب في 1 مل من ddw. انقل الأسماك المخدرة إلى الاغاروز المخفف باستخدام ماصة سعة 1 مل عندما يبرد الاغاروز. اخلطي وانقلي الاغاروز المثبت على السمك برفق إلى الطبق الذي يحتوي على جل الاغاروز المتصلب بنسبة 4٪ المحضر في الخطوة 9.2.
  4. ضع السمكة بحيث يكون الجزء محل الاهتمام في الأعلى.
  5. استخدم مجهر مضان متحد البؤر عمودي للتصوير ومعالجة البيانات باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعتبر تقاطعات الفجوة التي تتكون من بروتينات بوليمرية تسمى connexins ضرورية لتبادل المستقلبات والأيونات ذات الوزن الجزيئي المنخفض بين الخلايا المتلامسة. تم استخدام طريقة وضع علامات على البروتين الفلوري الموضحة أعلاه لتسمية connexin 39.9 (الشكل 5 أ) و connexin 44.1 (الشكل 5 ب) ، على التوالي. تم التحقق من KI الصحيح عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 6). بالاتفاق مع البيانات المنشورة16 ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لإجراء هذه التجربة بسلاسة ونجاح ، يجب على المرء أن يولي مزيدا من الاهتمام لبعض الجوانب المهمة. يجب أن تكون المرحلة المثلى لنمو أسماك الزرد للحقن هي مرحلة الخلية الواحدة. يمكن أن يضمن إكمال الحقن خلال هذه المرحلة أن جميع الخلايا التي يتم إنتاجها من خلال الانقسام اللاحق تحتوي على المكونات الضرورية ل KI ، وبالتالي زيادة احتمالية حدوث KI في وقت واحد في جميع الخلايا وتحسين معدل النجاح الإجمالي ل KI. سيؤدي خفض درجة الحرارة المحيطة إلى إبطاء التطور الجنيني لسمك الزرد18. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين عن عدم وجود مصالح متضاربة في هذه الورقة.

شكر وتقدير

نشكر لو تشو (جامعة شيامن) على التدقيق اللغوي لهذه المخطوطة وتحريرها. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة 82388201 إلى JH ؛ منحة 31801158 إلى YZ) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFA0803500 إلى JH) ، وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (CIFMS) (2019-I2M-5-062 إلى JH) ، والبرنامج الخاص لمقاطعة فوجيان المركزية لتطوير العلوم والتكنولوجيا المحلية (2022L3079 إلى JH) ، وبرنامج التعاون في منطقة FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 إلى JH). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرارات النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1000 & ميكرو; L  نصائحأي علامة تجاريةغيرلجميع التلاعب
أنابيب 1.5 ملأي علامة تجاريةغيرللتخزين والطرد المركزي لحلول مختلفة
1.5 مل (خالية من RNase)أي علامة تجاريةغيرللتخزين والطرد المركزي للحلول الخالية من RNase
10 & micro ؛ نصائحL أي علامة تجاريةغير متوفرةلجميع التلاعب
10 & نصائح L (خالية من RNase)أي علامة تجاريةغيرللتلاعب الخالي من RNase
1000 & micro ؛ L  نصائح (خالية من RNase)أي علامة تجاريةغير / أللتلاعب الخالي من RNase
1-phenyl 2-thiourea (PTU)SigmaP7629لتثبيط تكوين الميلانين والحفاظ على اليرقات شفافة
200 & نصائح Lأي علامة تجاريةغير متوفرةلجميع التلاعب
200 & نصائح L (خالية من RNase)أي علامة تجاريةغيرللتلاعب الخالي من RNase
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR لاختبارات كفاءة sgRNA
أطباق 35 ممCorning430165لتصوير
لوحات 6 آبارأي علامة تجاريةغيرلتربية أسماك الزرد بشكل فردي ومؤقت
Acc65INEBR0599Sل الهضم الأنزيمي
حمض الخليكسيجما695092لإعداد العازلة TAE
AgarBiofroxx8211GR500لألواح LB
أمبيسلين ، ملح الصوديومسانجونA610028لألواح LB
CaCl 2< / sub>SigmaC5080لتحضير العازلة للأجنة
أنابيب شعرية جهازهارفارد30-0016لتوليد الإبر للحقن
أنابيب الشعيرات الدمويةأي معرف علامة تجارية(القطر الداخلي) = 0.1 مملتحديد قطرة 1 نانولتر
CRISPRscanCRISPRscan &nbsp ؛ http://www.crisprscan.org/لتصميم sgRNA
DH5 & alpha ؛TIANGENCB101للتحول
EDTASigmaE6758للعازلة للتحلل وإعداد المخزن المؤقت
TAEEnsembl Ensembl& nbsp ؛ https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Indexللعثور على معلومات الجينات
الإيثانولHUSHI64-17-5لتنقية الحمض النووي واستخراجه
Exonuclease IIITakara2170ALIC
حاقن دقيق يعمل بالغازWarner InstrumentsPLI-100Aللهلام بالحقن المجهري
WIXWIX-EP3000للهلام قفازات الرحلان الكهربائي
أي علامة تجاريةN / Aلجميع التلاعب
الجلوكوزsgdbio10010518لألواح LB
الجلسرينسانجونA501745لألواح LB
gRNA-pMD19-Tمركز موارد أسماك الزرد الصيني (CZRC)CZP3sgRNA البلازميد الذي يحتوي على سقالة sgRNA
KClSigmaP5405للأجنة تحضير العازلة
محلول ترسيب كلوريد الليثيومThermofisherAM9480ترسيب sgRNAs ، خالي من RNase
انصهار منخفضة الاغاروزسانجونA600015لتحضير 4٪ من المواد الهلامية agarose
كبريتات المغنيسيومsgdbio20025118 لألواح LB
حمام معدنيأي علامة تجاريةN / Aلحضانة درجة حرارة ثابتة
الميثيلين الأزرقسيجماM9140لإعداد العازلة للأجنة
Microinectionمحلي الصنعN / Aلتوليد الأخاديد لحمل الأجنة أثناء الحقن المجهري
Microloader ، طرف لملء Femtotips والشعيرات الدموية الزجاجية الأخرى ، معقمة ، 0.5 & ndash ؛ 20 & micro ؛ L ، 100 مم ، رمادي فاتح ، 192 قطعة. (2 رفوف وأوقات ؛ 96 قطعة.)Eppendorf5242956003لتحميل محلول الحقن الدقيق في إبرة الحقن ،
مجتذب الماصات الدقيقةأداة SutterP-97لتوليد إبر للحقن
الماصاتالدقيقة EppendorfN / Aلجميع التلاعب
الميكروويفأي علامة تجاريةغيرمتوفرة لصب لوحة الحقن وجل الاغاروز
MinElute PCR طقم تنقية (50)QIAGEN28004لتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ومنتجات الهضم ،
نسخ mMESSAGE mMACHINE T3InvitrogenAM1348النسخ في المختبر ل Cas9 mRNA ، خالية من RNase
N2< / sub>أي علامة تجاريةغيرللحقن المجهري
NaClSigmaS5886لتحضير المخزن المؤقت للأجنة والتحلل
NaHCO3< / sub>SigmaS5761لتحضير العازلة للأجنة
NaOHSangonA100173لتحضير العازلة TAE
بالمياه الخالية من النوكليازThermofisherR0581RNA RNA ، خالية من RNase
PciINEBR0655Sلآلة PCR للهضم الأنزيمي
أي علامة تجاريةN / Aأنابيب شريط PCR تضخيم
PCR أي علامة تجاريةN / Aلأنابيب
PCR PCRFEITONGKANGblp-200لطبق PCR
Petriأي علامة تجاريةN / Aلتربية يرقات الزرد وما إلى ذلك.
الفينول الأحمرسيجماP0290للحقن المجهري ، حامل الماصة الخالي من RNase
Warner InstrumentsPLI-PH1للحقن الدقيق
PrimeStar (Premix) TakaraDR040Aللاستنساخ الجزيئي
Proteinase KMerck539480لاستخراج الحمض النووي الجيني
pT3TS (T3: zCas9-UTRglobin) مركزموارد أسماك الزرد الصيني (CZRC)قالب البلازميد CZP11Cas9
جهاز طرد مركزي مبردأي علامة تجاريةغير / ألمقياس الطرد المركزي ذي الصلة بالحمض النووي الريبي
SartoriusBCE124-1CCNلصب لوحة الحقن والمواد الهلامية المقص
أي علامة تجاريةغيرلقص ذيول الأسماك البالغة
SDSSangonA600485لتحضير
عازلة التحللفرش صغيرةأي علامة تجاريةغير متوفرةلتحريك الأجنة برفق على ألواح الحقن المجهري
مقياس الطيفالضوئي ThermofisherNanoDrop 2000لقياسات تركيز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي
ميكرومتر المرحلةأي علامة تجاريةDIV (قسم) = 0.01 مملتحديد كمية قطرة 1 نانولتر
مجهر مضان ستيريوأوليمبوسSZX16لمراقبة التعبير الجيني
مجهر ستيريوMoticSMZ-168للمراقبة والحقن المجهري
T7 RiboMAX Express نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاقPromegaP1320النسخ المختبري ل sgRNAs ، حاضنة خالية من RNase
يتم التحكم في درجة حرارتهاأي علامة تجاريةN / Aلحضانة الأجنة
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/لتحليل كفاءة sgRNA 
تريكايين ميثان سولفوناتسيجماA5040لتحضير محلول التريكيين
تريسسانجونA600194لمحلول التريكيين ، عازلة التحلل وإعداد العازلة
TAE TryptoneOXOIDLP0042لألواح LB
ملاقطأي علامة تجاريةغيرمتوفرة لقطع إبر الحقن
XbaINEBR0145Sللإنزيمات مستخلص
الخميرةOXOIDLP0021لألواح LB نظام
حوض السمك الزردESENESEN-AW-S1لتربية الأسماك البالغة
خزانات تزاوج أسماك الزرد (مع مقسم)أي علامة تجاريةغيرلتزاوج الأسماك
Zeiss LSM 900 + Airyscan2ZEISSZeiss LSM900للتصوير متحد البؤر للأسماك ذات العلامات المضان وتحليل البيانات
موقع ZFINالويب ZFINhttp://zfin.org/للعثور على معلومات الجينات
متوفرة متوفرة أنابيب متوفرة متوفرة متوفرة متوفرة لنظام الرحلان الكهربائي نقطة قالب الخالي من RNase مجموعة الخالية من RNase متوفرة التلاعب متوفرة واسع الهضمية متوفرة على

المراجع

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

single guide RNA

مقالات ذات صلة