يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز عن طريق التروية من خلال الأوعية الدموية للفئران مع البنكرياس السليم

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67701

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  , 
1Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم تفاصيل حول إجراء إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) عن طريق التروية من خلال الأوعية الدموية للفئران مع بنكرياس سليم كتقنية إضافية لتقييم وظيفة البنكرياس الغدد الصماء مع تقليل العوامل المربكة المحتملة.

الملخص

تتضمن الطرق الحالية لإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) في القوارض ضخ الجوب خارج الجسم الحي أو الحضانة الساكنة لجزر البنكرياس وشرائح البنكرياس. يسمح التروية خارج الجسم الحي والحضانة الثابتة بأخذ عينات متعددة بسرعة وكفاءة. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات تعرض الجزر الصغيرة للصدمات ، ونقص الأكسجة المتقطع ، وانخفاض إشارات الأنسولين الباراكرين ، وكلها يمكن أن تؤثر على GSIS. يمكن تقليل هذه الآثار السلبية عن طريق التروية من خلال الأوعية الدموية للفئران مع بنكرياس سليم ، مما يوفر طريقة مقارنة أخرى لنماذج GSIS المختلفة. تضمن العمود الفقري لإجراء التروية هذا أنا) ربط الأوعية الدموية لعزل البنكرياس و ب) قنية الأوعية الدموية في البنكرياس. تضمن هذا النموذج سبع نقاط ربط واثنين من القنيات. تضمنت الأوعية الدموية الناتجة الشريان الأورطي السفلي البطني ، والشريان البطني والشريان المساريقي العلوي ، والروافد المتفرعة ، والوريد البابي.

تم إدخال الإنفوز إلى الأوعية الدموية عند ~ 2 مل / دقيقة عبر مضخة تمعجية إلى أنبوب PE-50 الذي يقلب الشريان الأورطي السفلي للبطن. مرت النفحات عبر الأوعية الدموية المعزولة وتم جمعها من خلال الوريد البابي عبر قنية بأنبوب PE-30. تم جمع الريشة على فترات 3 دقائق في جولات مدتها 30 دقيقة لكل محلول خريد من 2.6 ملي مولار جلوكوز ، 16.8 ملي مولار جلوكوز ، و 2.6 ملي مولار جلوكوز مع 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) في عازلة بيكربونات كريبس رينجر (KRB ، 16 ملي مولار HEPES و 0.1٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4). سبق محلول IBMX محلول جلوكوز طبيعي 2.6 ملي مولار كدورة غسيل. كان الوقت الإجمالي ~ 1 ساعة للإجراء الجراحي و 2 ساعة لجمع الانحطار. تم تجميد النفحات حتى تم إجراء ELISA لقياس إفراز الأنسولين.

تأمل قائمة الطرق هذه في توفير أساس إجرائي مفصل لقياس إفراز الأنسولين من خلال نضح البنكرياس من خلال الأوعية الدموية ، مما سيسمح للباحثين بإجراء نضح البنكرياس السليم بنجاح في مختبراتهم.

المقدمة

تم تحديد وفهم وظيفة خلايا بيتا بشكل أساسي عن طريق تحية الدم خارج الجسم الحي ، والحضانة الساكنة ، ومؤخرا ، عبر شرائح البنكرياس. في حين أن هذه الإجراءات تسمح بتقييم الجزر المعزولة ، فإن الجزيرتين السابقتين قد تضعان الجزر في ضغوطات تؤثر على قدرتها على العمل. في دراسة أجراها روزنبرغ وآخرون ، أظهرت جزر المعزولة باستخدام الطرق القياسية زيادة في موت الخلايا المبرمج لخلايا بيتا ، والذي يتضح من فقدان الغشاء القاعدي ، وظهور النوى البائنة ، والأجسام موت الخلاياالمبرمج 1. تتزامن هذه الدراسة مع تقرير آخر عن عزل جزر البنكرياس البشرية حيث تم إظهار التغيرات المورفولوجية التي تصور موت الخلايا المبرمج بعد فترة وجيزة من عزل الجزيرة2،3. أدت زيادة موت الخلايا المبرمج لخلايا بيتا إلى انخفاض إفراز الأنسولين من هذه الجزر ، مما يدعم مفهوم أن عزل الججزر يعرضها للتلف والضعف الوظيفي.

بالإضافة إلى موت الخلايا المبرمج ، تفقد الأوعية الدموية مع عزل الجزيرة ، مما يؤدي إلى ضعف نقل العناصر الغذائية والمستقلبات والهرمونات4،5. أدى هذا القيد إلى بدائل مثل زرع خلايا الجزيرة في العين للحفاظ على شكل من أشكال الأوعية الدموية والتعصيب6. يؤدي التغيير في بنية الأوعية الدموية أثناء عزل الجزيرة أيضا إلى إنشاء جزيرة أكثر إحكاما ، تختلف عما هو متوقع في الجسم الحي7،8.

للإضافة إلى الاختلافات التشريحية ، يختلف سلوك الجزر الصغيرة المحتضنة بشكل ثابت عن البنكرياس المعزول. بالنسبة للجزر الصغيرة المحتضنة بشكل ثابت عند نسبة منخفضة من الجلوكوز ، يبدو أن 77٪ من إجمالي الأنسولين المنبعث (3.31 نانوغرام من إجمالي 4.34 نانوغرام) موجودة خلال أول 30 دقيقة وقليلة في الفترة الزمنية التالية. هذا يتناقض بشكل صارخ مع البنكرياس المعزول المنفوخ بتركيزات منخفضة من الجلوكوز ، حيث كان هناك أي إفراز للأنسولين تقريبا في جميع النقاط الزمنية (إجمالي <1.8 نانوغرام)9. بينما يجب إجراء مزيد من البحث لتوضيح هذا الاختلاف بشكل كامل عند تركيزات الجلوكوز المنخفضة ، فإن هذا الاختلاف في البيانات قد يمثل تسربا من الخلايا المحتضرة الناقصة للأكسجين ، والذي تم فحصه بشكل أكبر عن طريق الحضانة الثابتة للطبقات الأحادية لخلايا الجزر. ومع ذلك ، فإن هذه الاختلافات بين الطرق الحالية والبيئات في الجسم الحي يمكن أن تتسبب في ضعف الصلاحية الخارجية (الجدول 1).

بالإضافة إلى التسبب في نقص الأكسجة ، يتضمن كل من تحية الدم خارج الجسم الحي والحضانة الساكنة زراعة وفصل الجزر الصغيرة عن البنكرياس إلى أطباق زراعة الأنسجة لإبقائها في حالة تعليق. خلال هذه العملية ، عادة ما يتم نفخ الكولاجيناز من خلال قناة البنكرياس للسماح بتفكك أنسجة البنكرياس. يرتبط الكولاجيناز بألياف الكولاجين ويفككها بمساعدة البروتياز المحايد والجيلاتيناز وبروتياز البنكرياس الداخلي. معا ، تستمر هذه البروتياز في الهضم حتى يتم إطلاق الجزر من مصفوفة خارج الخلية ومرفقات الخلايا الأسينارية. ينتج عن موازنة هذا المزيج من البروتياز نتائج متفاوتة في كل من نقاء ووظائف الجزر المعزولة10. تعتمد فعالية الكولاجيناز أيضا على الخصائص الحيوانية مثل الإجهاد والعمر والوزن وحالة مرض السكري. يمكن أن يؤدي استخدام هذه البروتياز جنبا إلى جنب مع السمات الخاصة بالحيوان إلى الإضرار بجزر البنكرياس أثناء عملية العزل. عند إعطاء الكولاجيناز ، تنشط هذه البروتياز أيضا الإنزيمات المحللة للبنكرياس الذاتية التي تساعد على هضم الغشاء القاعدي. ومع ذلك ، فإن التحكم في تنشيط إنزيم البنكرياس الداخلي غير ممكن بعد. وبالتالي ، قد يلعب هذا دورا في ضرر الجزر أثناء عملية الزراعة11،12،13. أظهر تقرير واحد من إدمونتون نشاط البروتياز الداخلي الذي يؤثر على إنتاجية عزل الجزر بمجرد الوصول إلى مستوى نشاط إنزيم كاف للعزل14،15.

ثبت أن تقنيات التسريب الحالية للكولاجيناز (داخل القناة) تخترق أيضا الجزء الداخلي من الجزيرة ، مما يؤدي إلى تجزئة محتملة للجزيرة ، وبالتالي ، غلة جزرية منخفضة16. في دراسة أجراها Balamurugan et al. ، شوهد أن الكولاجيناز يتوضع في الجزر الصغيرة والأنسجة الأسينار داخل بنكرياس الفأر المنقوع ، مما يؤدي إلى التهاب شديد وتنشيط مسارات موت الخلاياالمبرمج 17. أظهرت الجزر التي نجت من مرحلة العزل قدرة منخفضة على إطلاق الأنسولين أيضا.

بالإضافة إلى ذلك ، تلعب عوامل أخرى مثل الإجهاد الميكانيكي أثناء تحضير الجزيرة والنخر الناجم عن نقص الأكسجة أثناء الثقافة دورا في عمل الجزيرة18. يمكن أن تؤثر هذه السمات على جدوى الجزيرة عند عزل البنكرياس ، وبالتالي على الوظيفة الناتجة.

بصرف النظر عن عزل الجزر الصغيرة وتقييمها عن طريق الحقن خارج الجسم الحي والحضانة الساكنة ، فإن الجزر الصغيرة في شرائح البنكرياس الحية هي طريقة أخرى خارج الجسم الحي تستخدم لقياس استجابات خلايا الغددالصماء 19. في هذا النظام ، يتم تجنب الإجهاد الكيميائي من إجراءات عزل الجزر. بالإضافة إلى ذلك ، تظل البيئة المكروية للجزيرة سليمة ، مما يسمح بدراسة فسيولوجيا الجزيرة الأقرب إلى حالتها في الجسم الحي 20. على غرار انضهار الدم خارج الجسم الحي والحضانة الساكنة ، هذه طريقة ستستمر في لعب دور مهم في اكتساب المعرفة بالبنكرياس. ومع ذلك ، تشمل بعض القيود الإجهاد الميكانيكي أثناء توليد الشرائح ، فضلا عن الافتقار إلى نظرة شاملة شاملة للبنكرياس السليم لعلم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء. تمثل الشريحة منطقة معينة داخل البنكرياس ، مما يقلل من قابليتها للتعميم بسبب انخفاض حجم العينة والعرض المحدود21.

يصاحب عزل الجزيرة هذه وطرق أخرى نقاط مختلفة من الضغوطات التي قد تفرض على الجزر. يلعب الإجهاد الميكانيكي ونقص الأكسجة وفرط نشاط البروتياز والرؤية المحدودة دورا في إنتاجية الجزيرة الناتجة والصلاحية الخارجية الإجمالية. يمكن تقليل هذه العوامل من خلال نضح البنكرياس عن طريق الأوعية الدموية للفئران ، مما يقلل من جميع الضغوطات المذكورة أعلاه مع السماح أيضا بفحص تأثيرات الإفرازات الأخرى والعوامل الدوائية الموجودة في الجسم بسبب الحفاظ على السلامة الخلوية22. أظهرت الدراسات السابقة تأثير تدفق الدم في الجزيرة على مستويات الأنسولين في البلازما23. في المقابل ، فإن الجزيئات النشطة للأوعية مثل ببتيدات الأنجيوتنسين والناهضات الودية ، التي تغير تدفق الدم في الجزيرة ، ستغير وظيفة الجزيرة وتطلق الأنسولين24،25. سيسمح نضح البنكرياس بمزيد من التقييم لكيفية تأثير هذه الجزيئات وغيرها من الجزيئات المختلفة على استجابة خلايا الغدد الصماء. يأمل هذا النظام في السماح بمزيد من التقدم المفاهيمي لفهمنا لبيولوجيا البنكرياس الغدد الصماء في وجود الحديث المتبادل في بيئته المكروية الطبيعية مع الأوعية الدموية والتعصيب السليمة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نضح البنكرياس السليم في هذا البروتوكول بعزل العضو ، مما يقلل من العوامل المربكة المحتملة من الأعضاء الأخرى مثل الكبد ، الذي يزيل الأنسولين من الدورة الدموية ، عند مقارنته بنضح الفأر بأكمله. سيسمح نضح الفأر كله بتقليل التقنية الجراحية. ومع ذلك ، فإنه لا يزال يتطلب جمع البرفوز من خلال وعاء بعد البنكرياس وقبل الوصول إلى الكبد - على الأرجح الوريد البابي. سيستمر جمع الوريد البوابي في استلزام القنية. في حين أن نضح الفأر الكامل سيوفر فائدة الخطوات الجراحية المخفضة ، ستكون هناك قيود بسبب العوامل المربكة الناتجة عن أعضاء مثل الكلى والرئتين التي تنتج ببتيدات الأنجيوتنسين. ومع ذلك ، سيكون هذا نهجا جديدا يمكن أن يكون مفيدا عند فحص تأثيرات الجزيئات النشطة للأوعية الدموية المنتجة من أعضاء أخرى على جزر البنكرياس ، وهي الأولوية الأساسية.

تم إجراء نضح البنكرياس الكامل بنجاح في الماضي من قبل آخرين7،22،26. في هذا البروتوكول المحدث ، يشكل استخدام الفئران تحديا تقنيا متزايدا بسبب تشريحها الأصغر مقارنة بالفئران. ومع ذلك ، يوضح هذا الإجراء بنجاح جدوى هذا البروتوكول من خلال إظهار ملف تعريف إفراز الأنسولين المميز جيدا من البنكرياس السليم ل 3 فئران مستقلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الأبحاث التي أجريت على القوارض متوافقة مع إرشادات مركز جوسلين لأبحاث السكري (رقم الموافقة 22-01).

1. البداية

  1. إدارة التخدير.
    1. حقن الفئران الصائمة والسكريات الطبيعية (فلوكس / كري 53-74 أسبوعا M / F المستخدمة في التجارب) بمزيج الكيتامين / الزيلازين (~ 75 مجم / كجم من خليط الكيتامين حمض الهيدروكلوريد) الذي يتم إعطاؤه في العضل من خلال أحد الفخذين الخلفيين عبر إبرة 28 جم للقتل الرحيم.
      ملاحظة: استخدام الفئران الصائمة ذات السكر في الدم المهم لتقليل آثار الكيتامين. ومع ذلك ، يمكن استبدال التخدير.
    2. تأكد من تخدير الماوس بشكل صحيح عن طريق الضغط على القدم الخلفية بالملقط للتحقق من رد الفعل.
      ملاحظة: يشار إلى عدم وجود رد فعل من خلال قلة حركة الساق المقروصة.
    3. يمري مرهم العيون المعقم للعينين لمنع الجفاف أثناء التخدير ومنع تقرحات القرنية.
  2. تأمين الموضوع.
    1. تأكد من أن الماوس آمن وسيظل في مكانه أثناء الإجراء ، والذي تكتمل هذه التجربة عبر مغناطيسات متصلة بأربطة مطاطية تتصل بالأطراف مع وجود مغناطيس متصل بلوحة مغناطيسية.
  3. نظف موقع الشق.
    1. تأكد من رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث من شعر الفأر ،
      ملاحظة: حلاقة الماوس ستسمح بفرصة أقل للتلوث من الفراء.
  4. إجراء شق.
    1. باستخدام ملقط / ملاقط ، اضغط على بعد 2-3 سم من فتحة الشرج واقطعها لأعلى أثناء ثقب الصفاق بمقص منحني.
    2. قم بإنشاء شق قطري من خط الوسط إلى الأضلاع والجزء الجانبي من الماوس.
    3. قم بإنشاء شق متطابق على الجانب الآخر.
      ملاحظة: الهدف هو إنشاء رؤية كافية لتجويف البطن من بالقرب من المستقيم إلى الحجاب الحاجز

2. الربط

  1. ربط الشريان المعدي.
    1. حرك الأمعاء إلى يمين باستخدام ملقط / أصابع حادة. ارفع المعدة لتحديد موقع الشريان والوريد المعدي.
      ملاحظة: تم تحديد الشريان والوريد المعدي من خلال تصور الأوعية الدموية التي تمتد من المريء السفلي إلى أعلى المعدة.
    2. خذ خياطة 7-0 (بدون إبرة) وضعها تحت الشريان المعدي باستخدام ملقط غير حاد استعدادا للربط.
    3. قم بإنشاء عقدة الجراح وتأكد من الربط المناسب عبر عقدة ثابتة.
      ملاحظة: نوع العقدة ليس مهما. يمكن تحديد منع تدفق الدم عن طريق تغيير لون العضو المرتبط إلى مظهر شاحب أو إزالة العضو ومراقبة طرد الدم من نقطة الربط. يضمن ربط الشريان المعدي عدم وجود تأثير من محتويات المعدة. هذا يقلل أيضا من التسرب إلى الأوعية المعدية ويوجه التخريد عبر الشريان البطني.
  2. ربط الأوعية الكلوية اليسرى.
    1. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3 للأوعية الكلوية اليسرى.
      1. تحديد الأوعية الكلوية اليسرى من خلال تصور الأوعية ذات اللون الأحمر الفاتح والأرجواني الداكن المتصلة بالكلية اليسرى. تمنع هذه الخطوة التسرب إلى الأوعية الكلوية وتعيد توجيه التعقيم إلى الشريان البطني.
  3. اربط الشريان الأورطي العلوي للبطن.
    1. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3.
      1. تحديد الشريان الأورطي العلوي البطني من خلال تصور الوعاء الأحمر اللامع لخط الوسط مع الأوعية المتفرعة للشريان البطني والشريان المساريقي العلوي والأوعية الكلوية اليسرى. إجراء ربط متفوق على الشريان البطني لتقليل التسرب عبر الشريان الأورطي العلوي للبطن وضمان التدفق إلى الشريان البطني وفي النهاية البنكرياس.
  4. ربط الأوعية الكلوية اليمنى.
    1. انقل الأمعاء إلى يسار. اضغط على الأنسجة / الدهون المحيطة بالكلية اليمنى كرافعة لتحديد الأوعية الكلوية اليمنى.
    2. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3.
      1. تحديد الأوعية الكلوية اليمنى عن طريق تصور الأوعية الأرجوانية / الحمراء الداكنة (كلا الأوردة الكلوية اليمنى مع شريان غير مرئي تحتها) متصلة بالكلية اليمنى مع اتصال بكل من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي البطني. هذه الخطوة توازي الخطوة 2.2 مع الأوعية الكلوية اليسرى ، مما يسمح بمزيد من عزل البنكرياس. ومع ذلك ، كن حذرا من قرب هذا الوعاء من الوريد الأجوف السفلي.
  5. اربط الجزء البطني من الوريد الأجوف السفلي.
    1. تحديد الجزء البطني من الوريد الأجوف السفلي من خلال تصور وعاء أرجواني أكبر مع اتصال متفرع بالوريد الكلوي الأيمن.
    2. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3.
      ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من العوامل المربكة المحتملة من الدم الذي يمر عبر الوريد البابي ، حيث سيتم جمع الإنتشاء.
  6. اربط الشريان الأورطي السفلي للبطن قبل التشعب (الشكل 1)
    1. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3.
    2. بعد الربط قبل التشعب مباشرة ، ضع خيطا خياطة تحت الشريان الأورطي 0.5 سم أو نحو ذلك فوق العقدة الأولى. استخدم خيط الخياطة هذا لربط القنية في مكانها.
    3. استخدم المسافة بين خيط الخياطة والخياطة المربوطة لإدخال الأنبوب للقنية. يضمن هذا الربط أن يمتد الريشات عبر الشريان الأورطي السفلي للبطن باتجاه الشريان البطني.
  7. ربط الوريد البابي (الشكل 2)
    1. انقل الأمعاء إلى يسار للسماح بالتصور الصحيح للوريد البابي.
    2. قم بإنشاء شق في الحجاب الحاجز والأضلاع لتوفير مساحة أكبر ، حسب الحاجة ، لعرض الوريد البابي وللجر المناسب للربط والقنية.
    3. اربط الوعاء قدر الإمكان (أقرب إلى الكبد) لضمان مساحة للقنية لاحقا.
    4. ضع خياطة ثانية أدنى من الأولى ولكن فوق البنكرياس. الخطوة 2.7.2 ستؤدي إلى وفاة الموضوع. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الخطوة مهمة للسماح بجمع التعريج ومنع التدفق العكسي المحتمل المتفوق على نقطة القنية.

3. القنية

  1. قنية الشريان الأورطي السفلي من البطن.
    1. قم بعمل شق 0.5-1.5 مم بمقص في الشريان الأورطي السفلي للبطن بين العقدة السفلية والخياطة العلوية.
    2. باستخدام أدنى عقدة كرافعة ، أدخل الأنبوب في الشريان الأورطي عبر الشق حتى يصل إلى الخيط الأكثر تفوقا ؛ احرص على عدم التمزق.
    3. اربط الخيط الأكثر تفوقا في عقدة لتثبيت الأنبوب في مكانه.
      ملاحظة: تسمح هذه الخطوة للنفيد بالدخول إلى النظام المغلق. مع وضع الربط في مكانه ، يجب أن ينتقل الإنشاب من نقطة الدخول في الشريان الأورطي السفلي للبطن إلى الشريان البطني ، ثم الأوعية البطنية ، وتنتهي بالوريد البابي الكبدي حيث يمكن جمع النفيوم.
  2. قنية الوريد البابي.
    1. قم بإنشاء شق 0.5-1 مم في الوريد البابي بعد خروج الوريد البابي من البنكرياس.
    2. أمسك العقدة العلوية كرافعة باستخدام ملقط حاد في يد واحدة ، أدخل الأنبوب في الوريد البابي باستخدام ملقط لإمساك الأنبوب باليد الأخرى.
    3. استخدم الخيط الثاني لربط الأنبوب في مكانه ، إن أمكن.
      ملاحظة: هذه الخطوة هي نقطة نهاية النظام المغلق حيث يجب أن يخرج الإنفوز مع تأثير البنكرياس على السائل الموجود.

4. المجموعة

  1. أداء التروية.
    1. قبل وضع أنبوب الشريان الأورطي السفلي للبطن ، تأكد من أن نظام التروية قد بدأ مع تدفق الإنفوز بالسرعة المطلوبة (~ 2 مل / دقيقة).
      ملاحظة: يجب تصريف الريشات من قنية الوريد البابي إلى أنبوب التجميع. يمكن استخدام أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتسهيل التخزين. محاليل التعقيد المستخدمة هنا هي 2.6 ملي مولار جلوكوز مع 1.2 ملي مولار 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) ، 16.8 ملي مولار جلوكوز ، و 2.6 ملي مولار جلوكوز مع 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين (IBMX) في مخزن كربس رينجر البيكربونات (KRB ، 16 ملي مولار HEPES و 0.1٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4). بدأ محلول التعطير بمحلول منخفض الجلوكوز لنسبة عالية من الجلوكوز ، والعودة إلى نسبة الجلوكوز المنخفضة ، وانتهى بمحلول IBX للتحكم.
  2. اجمع الريحة.
    1. اجمع الريشات على فترات 30 دقيقة في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (تم استبدال الأنابيب كل 3 دقائق).
    2. بعد كل فاصل زمني مدته 30 دقيقة، قم بتبديل الحل.
    3. إجراء فحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مع العينات. يمكن القيام بذلك في وقت لاحق إذا تم تخزينه بشكل مناسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يجب أن تظهر النتائج بعد ELISA إفراز الأنسولين من البنكرياس الفأر إلى حد يعتمد على مستويات الجلوكوز في البريفوز. نظرا لحداثة هذا الإجراء في الفئران ، فإن تحليل النتيجة ونجاحها يعتمد على المقارنة مع العديد من التجارب الأخرى لبنكرياس الفئران المصابة. تعتبر استجابة الأنسولين ثنائية الطور لتركيز الجلوكوز المرتفع فسيولوجية ، كما تم تقييمها في البشر وبطرق تحجيج الجزر. النتائج المقدمة مشابهة لنضح البنكرياس السابق في الفئران22. يظهر متوسط مستويات الأنسولين من ثلاث تجارب مست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يهدف البروتوكول الموضح أعلاه إلى إنشاء نظام مغلق يتكون من البنكرياس السليم ، ومدخلين (الاضطرابات الهضمية والشريان المساريقي العلوي) ، ومخرج واحد (الوريد البابي الكبدي). جميع الأوعية الأخرى مربوطة لمنع التسرب عند نقل الريشات ، وكذلك لضمان عزل البنكرياس نفسه ببيئته المكروية. تسمح خطوات الربط في هذا البروتوكول أيضا بتدفق النتوء عبر البنكرياس دون الانتقال إلى أعضاء أخرى قد تربك النتائج ، مثل الكلى أو الكبد أو الرئتين ، والتي قد تفرز ببتيدات الأنجيوتنسين أو تزيل الأنسولين بسرعة من الدورة الدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون كريستوفر كاهيل وجنيفر هوليستر لوك والدكتورات سوزان بونر وير وكاناكو إيواساكي وفرانشيسكو هيلا وبريسيلا كارابيتو على الاستشارات المفيدة والمساعدة الفنية والتوجيه طوال هذا المشروع. تم دعم هذا البحث من خلال منحة NIDDK R01 DK132535.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأكسجين غشاء الأليافجهاز هارفارد73-3757يسمح للأكسجين بدخول البرفوزيت
وسادة التدفئةبرينتري العلمية39 أوم
الكيتامين / الزيلازينباترسون البيطرية78908598
لوحة مغناطيسيةبرينتري العلمية39 أوم
مغناطيس مع أربطة مطاطيةبرينتري العلمية39 أوم
مجهريهغير متاحغير متاحلا توجد شركة محددة
خزان الأكسجينغير متاحغير متاحلا توجد شركة محددة
أنابيب PCRThermoFisher / InvitrogenAM12225تستخدم لجمع البرفوزيت
أنبوب PE-30برينتري العلميةبي30
أنبوب PE-50برينتري العلميةبي50
مضخة تمعجيةغير متاحغير متاحلا توجد شركة محددة
الأدوات الجراحيةغير متاحغير متاحلا توجد شركة محددة
خياطهغير متاحغير متاحلا توجد شركة محددة

المراجع

  1. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  2. Paraskevas, S., et al. Apoptosis occurs in freshly isolated human islets under standard culture conditions. Transplant Proc. 29 (1-2), 750-752 (1997).
  3. Bottino, R., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol. 12, 667170(2021).
  5. Jansson, L., Carlsson, P. -O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  6. Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  7. Weir, G. C., Atkins, R. F., Martin, D. B. Glucagon secretion from the perfused rat pancreas following acute and chronic streptozotocin. Metabolism. 25 (11 Suppl), 1519-1521 (1976).
  8. Pisania, A., et al. Quantitative analysis of cell composition and purity of human pancreatic islet preparations. Lab Invest. 90 (11), 1661-1675 (2010).
  9. Weir, G. C., Leahy, J. L., Braunstein, L. P. Characteristics of insulin and glucagon release from the perfused pancreas, intact isolated islets, and dispersed islet cells. Horm Res. 24 (1), 62-72 (1986).
  10. Fathi, I., Goto, M. Collagenases in Pancreatic Islet Isolation. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , Elsevier Academic Press. (2019).
  11. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. J Clin Lab Anal. 8 (6), 407-411 (1994).
  12. Basir, I., et al. Improved outcome of pig islet isolation by Pefabloc inhibition of trypsin. Transplant Proc. 29 (4), 1939-1941 (1997).
  13. White, S. A., et al. A preliminary study of the activation of endogenous pancreatic exocrine enzymes during automated porcine islet isolation. Cell Transplant. 8 (3), 265-276 (1999).
  14. Lakey, J. R. T., et al. Serine-protease inhibition during islet isolation increases islet yield from human pancreases with prolonged ischemia. Transplantation. 72 (4), 565-570 (2001).
  15. Rose, N. L., Palcic, M. M., Helms, L. M. H., Lakey, J. R. T. Evaluation of Pefabloc as a serine protease inhibitor during human-islet isolation. Transplantation. 75 (4), 462-466 (2003).
  16. Cross, S. E., et al. Collagenase penetrates human pancreatic islets following standard intraductal administration. Transplantation. 86 (7), 907-911 (2008).
  17. Balamurugan, A. N., et al. Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant. 5 (11), 2671-2681 (2005).
  18. Li, W. Functional analysis of islet cells in vitro, in situ, and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 103, 14-19 (2020).
  19. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  20. Cohrs, C. M., et al. Bridging the gap: pancreas tissue slices from organ and tissue donors for the study of diabetes pathogenesis. Diabetes. 73 (1), 11-22 (2024).
  21. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  22. Wargent, E. T. Measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent. Methods Mol Biol. 2076, 281-297 (2020).
  23. Tamayo, A., et al. Pericyte control of blood flow in intraocular islet grafts impacts glucose homeostasis in mice. Diabetes. 71 (8), 1679-1693 (2022).
  24. Yuan, L., Li, Y., Li, G., Song, Y., Gong, X. Ang(1-7) treatment attenuates β-cell dysfunction by improving pancreatic microcirculation in a rat model of type 2 diabetes. J Endocrinol Invest. 36 (11), 931-937 (2013).
  25. Carlsson, P. -O., Berne, C., Jansson, L. Angiotensin II and the endocrine pancreas: effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia. 41 (2), 127-133 (1998).
  26. Penhos, J. C., et al. A rat pancreas-small gut preparation for the study of intestinal factor(s) and insulin release. Diabetes. 18 (11), 733-738 (1969).
  27. Ma, Y. H., et al. Differences in insulin secretion between the rat and mouse: role of cAMP. Eur J Endocrinol. 132 (3), 370-376 (1995).
  28. Aynsley-Green, A., Biebuyck, J. F., Alberti, K. G. Anaesthesia and insulin secretion: the effects of diethyl ether, halothane, pentobarbitone sodium and ketamine hydrochloride on intravenous glucose tolerance and insulin secretion in the rat. Diabetologia. 9 (4), 274-281 (1973).
  29. Chen, H., Li, L., Xia, H. Diabetes alters the blood glucose response to ketamine in streptozotocin-diabetic rats. Int J Clin Exp Med. 8 (7), 11347-11351 (2015).
  30. Lehmann, R., et al. Effects of ketamine sedation on glucose clearance, insulin secretion and counterregulatory hormone production in baboons (Papio hamadryas). J Med Primatol. 26 (6), 312-321 (1997).
  31. Sharif, S. I., Abouazra, H. A. Effect of intravenous ketamine administration on blood glucose levels in conscious rabbits. Am J Pharm Toxicol. 4 (2), 38-45 (2009).
  32. Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H., Sato, Y. Glucose-stimulated insulin secretion: a newer perspective. J Diabetes Investig. 4 (6), 511-516 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ELISA
إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز عن طريق التروية من خلال الأوعية الدموية للفئران مع البنكرياس السليم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.