يمتد التبييض التكراري من التعددية باستخدام أتمتة التلوين للمرافق الأساسية

Anna E. Tseng; Aoife O'Connell; Aaron Benhamou; Shivraj Yabaji; Igor Kramnik; Nicholas A. Crossland; Emily Speranza

doi:10.3791/67853

مقالة منهجية

يمتد التبييض التكراري من التعددية باستخدام أتمتة التلوين للمرافق الأساسية

DOI:

10.3791/67853

⸱

أغسطس 6, 2025

Anna E. Tseng¹^,² , Aoife O'Connell¹ , Aaron Benhamou¹^,³ , Shivraj Yabaji¹^,² , Igor Kramnik¹^,² , Nicholas A. Crossland¹^,²^,³ , Emily Speranza⁴

¹National Emerging Infectious Diseases Laboratories (NEIDL), Boston University, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ³Department of Virology, Immunology and Microbiology, Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, ⁴Florida Research and Innovation Center, Cleveland Clinic Foundation

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف تطبيق طريقة التبييض التكراري يمتد التعددية (IBEX) باستخدام ملطخات الأنسجة الآلية المتاحة تجاريا واعتبارات التحسين لاستخدام الكواشف القائمة على تضخيم إشارة التيراميد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التبييض التكراري يمتد التعددية (IBEX) عبارة عن تقنية تصوير مضان متعددة الأدوار تعتمد على تضخيم إشارة التيراميد (TSA) عالية الحساسية تتيح فحصا مفصلا للعديد من الجزيئات الحيوية للبروتين في عينة نسيج واحدة من خلال التبييض المتكرر وإعادة التلوين والتسجيل المشترك للصورة. على الرغم من اعتماده المتزايد لتوليد تلطيخ مناعي متعدد الإرسال بدرجة عالية ، فإن تنفيذ IBEX بطريقة آلية من خلال النشر في المرافق الأساسية يوفر العديد من الفوائد ، بما في ذلك زيادة الإنتاجية وقابلية التكرار والكفاءة الإجمالية لموظفي المختبر. هنا ، نوضح التطبيق الناجح ل IBEX على نظامين أساسيين للطلاء التلقائي مستخدمان على نطاق واسع ونناقش اعتبارات التحسين المهمة لتصميم اللوحة باستخدام التفاعلات المستندة إلى TSA لعينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين (FFPE). يتضمن ذلك منهجية اختبار حساسية استرجاع الأجسام المضادة والمستضد ، وهو اعتبار مهم لتصميم لوحة IBEX عند تحديد تسلسل تطور الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض أساليب التصوير النهائية باستخدام الماسحات الضوئية الكاملة المتوفرة تجاريا وتوضيح محاذاة الجودة وتحليلها باستخدام برنامج التنميط الظاهري للخلايا المتاح تجاريا. من خلال الأوصاف التفصيلية لهذه المنهجيات ومقاطع الفيديو المصاحبة ، نهدف إلى تسليط الضوء على تعدد استخدامات وسهولة IBEX ، وتقديم إرشادات عملية لمرافق علم الأمراض الأساسية لدمج IBEX في منصات التلوين الآلية الحالية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التبييض التكراري يمتد التعددية (IBEX) تقدما كبيرا في الكيمياء المناعية الفلورية متعددة الأدوار عالية الحساسية القائمة على TSA ، مما يسمح بالتصور التفصيلي والقياس الكمي للعديد من الجزيئات الحيوية داخل عينة واحدة من الأنسجة. من خلال استخدام دورات متكررة من التبييض وإعادة التلوين ، يتيح IBEX فحص البيئات الخلوية المعقدة بعمق ووضوح لا مثيل لهما ، مما يجعله أداة قوية في مجال التلوين المناعي والتصوير المتعدد¹^،².

تستضيف العديد من الكيانات الأكاديمية والحكومية والصناعية مرافق علم الأمراض الأساسية المخصصة لدعم مجموعة متنوعة من منهجيات البحث القائمة على الأنسجة التي تهدف إلى إنشاء مجموعات بيانات جزيئية مورفوجزيئية نوعية وكمية. هذه النوى هي موارد مهمة ، حيث توفر خدمات متخصصة قائمة على الأنسجة تسمح لمختبرات الأبحاث بالاستعانة بمصادر خارجية لعمليات علم الأمراض الجزيئية المعقدة وكثيفة العمالة والتشاور مباشرة مع علماء الأمراض في تصميم الدراسة وتطوير الفحص وتفسير البيانات. لضمان الاتساق وتقليل التباين عبر التجارب ، تعتمد هذه المرافق الأساسية بشكل روتيني على الأدوات الآلية المتوفرة تجاريا والمصممة لأداء بروتوكولات تلطيخ موحدة مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة³.

في حين أن الصبغة التلقائية أصبحت العمود الفقري للتلطيخ المناعي في المرافق الأساسية ، مما يتيح إنتاجية عالية ونتائج متسقة ، إلا أنها لم يتم تكييفها بعد لاستيعاب التطورات الحديثة مثل IBEX. علاوة على ذلك ، فإن الحاجة إلى معرفة متخصصة في تصميم اللوحة ، لا سيما عند استخدام الكواشف القائمة على تضخيم إشارة التيراميد^{(TSA) 4} ، تضيف طبقة إضافية من التعقيد ، مما يحد من الاعتماد الأوسع ل IBEX في تدفقات عمل البحث الروتينية. نتيجة لذلك ، غالبا ما يكون الباحثون الذين يرغبون في الاستفادة من قدرات التصوير عالية الدقة والمتعددة الإرسال من IBEX مقيدين بالمعدات الحالية لمنشآتهم الأساسية. تسلط هذه الفجوة بين تقنيات التصوير المبتكرة والحقائق العملية لعمليات المنشأة الأساسية الضوء على عائق أمام التبني الأوسع ل IBEX في البحث الأكاديمي. يهدف هذا العمل إلى معالجة هذا الحاجز من خلال إظهار التطبيق الناجح ل IBEX على منصات التصبغ التلقائي الشائعة ، مع التركيز على استخدام الكواشف القائمة على TSA باستخدام أنسجة مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين (FFPE). نناقش أولا الخطوات اللازمة لبناء لوحة IBEX باستخدام الأصباغ القائمة على TSA ، وتطبيق غطاء هذه الألواح على اثنين من أدوات الطلاء التلقائي المختلفة المتوفرة تجاريا. يقدم هذا معا إرشادات عملية حول اختبار حساسية استرجاع الأجسام المضادة والمستضد ، ومناقشة الاعتبارات الرئيسية لتحسين تصميم اللوحة ، وتوفير طريقة بديلة لمحاذاة اللوحة باستخدام البرامج التجارية التي قد تكون متاحة ومن خلال مختبرات علم الأمراض الأساسية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء ألواح IBEX بأصباغ قائمة على TSA

ملاحظة: استخدم دائما مستحضرا جديدا من الأجسام المضادة والأصباغ واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.

اختبار حساسية استرجاع المستضد
1. تحضير الشرائح
  1. استخدم ميكروتوم لجمع ثلاثة أقسام تسلسلية لكل جسم مضاد للاختبار من نفس الأنسجة المضمنة في FFPE على ثلاث شرائح منفصلة موجبة الشحنة.
  2. قم بتسمية الشرائح مع الجسم المضاد المراد اختباره ، جنبا إلى جنب مع عدد دورات استرجاع المستضد المراد اختبارها: دورة واحدة ، و 3 دورات ، و 6 دورات.
  3. جفف الشرائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. إذا كنت تعمل باستخدام علامات السطح فقط ، اخبز الشرائح على حرارة 60 ^درجةمئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتليين الشمع. إذا كنت تعمل باستخدام علامات نووية ، اخبز الشرائح على حرارة 60 ^درجةمئوية طوال الليل.
2. قم بإعداد البرنامج على autostainer لعدد مختلف من الدورات ، مع التأكد من وجود ثلاث خطوات غسيل بين كل خطوة. انظر الجدول 1 على سبيل المثال البروتوكولات لاختبارات الدورة 1 و 3 و 6.
  ملاحظة: لكل جسم مضاد فردي ، تأكد من وقت ثابت لخطوة الجسم المضاد وتطبيق صبغة TSA.
  بالنسبة لتطبيق الصبغة المستندة إلى TSA ، فإن البديل للسماح للصبغة بالجلوس لمدة 3-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة هو السماح للصبغة بالتحضين لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتحميل العينات على autostainer وقم بتشغيل البروتوكول لعدد الدورات المرتبط.
4. كرر هذه العملية من الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3 لكل جسم مضاد فردي يتم التحقق من صحته واختباره.
5. قم بإزالة الشرائح من autostainer وضعها في PBS.
6. قم بتركيب الشرائح بوسائط تركيب مائية (كما هو الحال في جولة IBEX) وغطاء # 1.5 للتصوير الأمثل.
7. استخدم مجهر epifluorescence لتصوير شريحة الدورة 1 لصبغة TSA و DAPI ، مع ملاحظة وقت التعرض اللازم لتصور الإشارة.
8. كرر هذا مع 3 دورات و 6 دورات الشرائح ، مع ملاحظة وقت التعرض اللازم لتصور صبغة TSA.
9. قارن أوقات التعرض عبر أرقام الدورات المختلفة. انظر الشكل 1 للحصول على أمثلة. تأكد من ثلاث دورات غسيل بين جميع الخطوات.
  1. إذا انخفض وقت التعرض مع زيادة الدورات ، فضع هذا الجسم المضاد والبقعة في خطوة لاحقة.
  2. إذا زاد وقت التعرض مع زيادة الدورات ، فضع هذا الجسم المضاد في خطوة سابقة.
  3. إذا لم يكن هناك تغيير كبير في وقت التعرض ، فضع هذا الجسم المضاد في أي خطوة.
  4. تجميع الأجسام المضادة بناء على متطلبات الدورة للتمرير الأولي في لوحات IBEX.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بإجراء هذا التحقق من الصحة على جميع العلامات المطلوبة للوحة IBEX معينة. قم بإجراء هذا التحقق في كل مرة يتم فيها تغيير أنواع الأنسجة أو عند العمل مع الأجسام المضادة الأولية متعددة النسيلة بأرقام دفعة فريدة.
معالجة نزيف الإشارة من صبغة قريبة طيفيا عن طريق تقييم قوة الإشارة.
1. قم بتجميع الأجسام المضادة في لوحات IBEX المحتملة بناء على العدد الأمثل لدورات الاسترجاع ، كما تم تحديده من الأعلى إلى 1 أو 3 أو 6 مجموعات دورة.
2. تحضير الشرائح
  1. استخدم ميكروتوم لإنشاء أقسام تسلسلية من عينة FFPE ، واحدة لكل جسم مضاد لاستخدامها في لوحة IBEX واحدة.
  2. قم بتسمية كل شريحة بأحد الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها في لوحة IBEX.
  3. دع الشرائح تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. إذا كنت تعمل باستخدام علامات السطح فقط ، اترك الشرائح تخبز على حرارة 60 ^درجةمئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتليين الشمع. إذا كنت تعمل باستخدام علامات نووية ، اترك الشرائح تخبز في درجة حرارة 60 ^درجةمئوية طوال الليل.
3. بالنسبة لمجموعة الدورات 1 و 3 و 6 ، استخدم إعداد الدورة الواحدة من الجدول 1. تأكد من ثلاث غسلات بين جميع الخطوات
  1. قم بتعديل البروتوكول لكل جسم مضاد لاستخدامه مع وقت التلوين الأمثل.
  2. استخدم نفس وقت TSA لجميع الأجسام المضادة.
4. تلطخ العينات على autostainer.
5. قم بإزالة العينات وضع الشرائح في PBS.
6. قم بتركيب الشرائح بوسائط تركيب مائية (كما هو الحال في جولة IBEX) وغطاء # 1.5 للتصوير الأمثل.
7. قم بتصوير الشرائح على مجهر epifluorescence باستخدام وقت التعرض الأمثل لكل صورة.
8. تحديد قوة الإشارة. تتمتع الشرائح ذات أوقات التعريض الضوئي القصيرة بقوة إشارة عالية جدا ، بينما تتمتع الشرائح ذات وقت التعريض الطويل بقوة إشارة منخفضة.
9. استخدم قوة الإشارة جنبا إلى جنب مع رقم الدورة لتطوير لوحات IBEX.
  1. تجميع الأجسام المضادة بناء على رقم الدورة.
  2. بالنسبة لمجموعة معينة من الأجسام المضادة ذات رقم دورة محدد ، تأكد من أن الإشارة القوية ليست قريبة بصريا من إشارة ضعيفة لتقليل امتداد الإشارة.
تحقق من صحة لوحات IBEX الفردية للتأكد من أن كل لوحة يمكنها تحقيق النتيجة المرجوة.
1. تحضير الشرائح.
  1. استخدم مقطعا صغيرا لإنشاء أقسام تسلسلية ، واحدة لكل لوحة IBEX متعددة الإرسال ، وتسمية بترتيب لوحة IBEX لاستخدامها.
  2. دع الشرائح تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. إذا كنت تعمل باستخدام علامات السطح فقط ، اترك الشرائح تخبز على حرارة 60 ^درجةمئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتليين الشمع. إذا كنت تعمل باستخدام علامات نووية ، اترك الشرائح تخبز في درجة حرارة 60 ^درجةمئوية طوال الليل.
2. قم بإعداد أداة التصبغ التلقائي.
  1. بالنسبة للوحة الأولى ، قم بإعداد برنامج autostainer بدون خطوات إضافية لاسترداد المستضد.
  2. بالنسبة للوحة الثانية ، أدخل خطوات تمسخ إضافية قبل الجسم المضاد الأول تساوي عدد خطوات التمسخ في اللوحة الأولى. انظر الجدول 2 للحصول على مثال على اللوحة 1 مع خمسة أجسام مضادة ، والجدول 3 للحصول على مثال لوحة 2 مع أربعة أجسام مضادة. تأكد من ثلاث خطوات غسيل بين جميع الخطوات.
  3. كرر حسب الحاجة للوحات IBEX الإضافية ، مع إضافة المزيد من خطوات التمسخ.
3. قم بإزالة الشرائح من آلة التصبغ التلقائي وضعها في PBS حتى تصبح جاهزة للتركيب.
4. قم بتركيب الشرائح بوسائط تركيب مائية (كما هو الحال في جولة IBEX) وغطاء # 1.5 للتصوير الأمثل.
5. قم بتصوير الشرائح على مجهر التألق باستخدام وقت التعرض الأمثل لكل صورة وكل صبغة TSA.
6. قم بتقييم ما إذا كانت جميع اللوحات معروضة بشكل صحيح. إذا كان الأمر كذلك ، فانتقل إلى تصوير IBEX. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فأعد معالجة موازنة الإشارات ودورات الاسترجاع.
  ملاحظة: يمكن إجراء بعض التعديلات داخل لوحة واحدة لتحسين الإشارة ومنع "تأثير المظلة". يمكن لبعض الإشارات الوفيرة للغاية أن تمنع تلطيخ إشارات المصب. انظر داخل لوحة معينة لاستخدام البقع الموجودة بشكل ضئيل أولا (انظر الشكل 2).

2. تكيف IBEX مع الصبغات التلقائية باستخدام كواشف TSA ومنصات تصوير الشرائح الكاملة (الشكل 3)

ملاحظة: للمقارنة بين اثنين من الصبغات التلقائية التي تم التحقق من صحتها واستخدامها ومناقشتها في هذا البروتوكول ، انظر الجدول 4.

قم بإعداد جميع الشرائح لتشغيل IBEX.
1. استخدم ميكروتوم لإنشاء أقسام FFPE على شريحة موجبة الشحنة. تأكد من تضمين شريحة واحدة لكل عينة تجريبية ، وشرائح تحكم إيجابية لأقسام الأنسجة المعروفة باحتوائها على المستضدات المراد تصويرها ، وشريحة تحكم سلبية يتم فيها استخدام PBS بدلا من جميع الأجسام المضادة الأولية.
  ملاحظة: إذا كنت تعمل على دفعات، فقم بتضمين عينة تحكم الدفعات. عينة التحكم في الدفعات عبارة عن كتلة أنسجة FFPE واحدة يتم تقسيمها وإدراجها في كل دفعة من العينات التجريبية لاستخدامها في التطبيع والتحكم في التباين التجريبي بين دفعات عينات التلوين. هذا ضروري فقط إذا لم تتم معالجة جميع العينات معا.
2. دع الشرائح تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. إذا كنت تعمل باستخدام علامات السطح فقط ، اترك الشرائح تخبز على حرارة 60 ^درجةمئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتليين الشمع. إذا كنت تعمل باستخدام علامات نووية ، اترك الشرائح تخبز في درجة حرارة 60 ^درجةمئوية طوال الليل.
قم بإعداد الأجسام المضادة والأصباغ لأول لوحة IBEX ليتم تصويرها.
قم بإعداد برنامج التلوين التلقائي. انظر الجدول 2 للحصول على مثال على لوحة مكونة من 5 علامات. تأكد من ثلاث غسلات بين كل خطوة.
قم بتحميل العينات والأجسام المضادة في آلة التصبغ التلقائي وقم بتشغيل البرنامج لتلطيخ العينات.
قم بإزالة الشرائح من الصبغة التلقائية وقم بتطبيق غطاء باستخدام وسائط تركيب مائية مناسبة للتصوير متعدد الأطياف وغطاء # 1.5.
صور الشرائح في غضون يومين من التلوين
التصوير الفلوري على الماسح الضوئي للشرائح الفلورية أو الفلورية
1. بدءا من عينة التحكم الإيجابية التي يتم التحكم فيها جيدا ، قم بتحميل عينة التحكم الإيجابية في المجهر.
  1. حدد موقع إشارة موجبة في العينة لكل من المستضدات المختلفة المراد تصويرها.
  2. اضبط وقت التعرض لضمان التقاط النطاق الديناميكي للبقعة مع تقليل الخلفية عن طريق البدء من التعريض الضوئي المنخفض وزيادة وقت التعريض تدريجيا حتى تكون الإشارة موجودة. افعل ذلك لكل صبغة على حدة.
    ملاحظة: اختبر وجود تعبير مرتفع ومنخفض للعلامات لضمان التقاط النطاق الديناميكي الكامل.
2. احفظ الإعدادات المستخدمة لعينة التحكم الإيجابي واستخدمها لجميع خطوات التصوير الإضافية.
3. قم بتحميل وتصوير عينة التحكم السالبة وجميع العينات التجريبية باستخدام الإعدادات التي تحددها عينة التحكم الموجبة.
4. تحقق من أن الصور ذات جودة مثالية قبل المتابعة إلى الخطوات اللاحقة.
إزالة الغطاء
1. اغمر الشرائح في برطمان كوبلين بماء DI. ضع برطمان كوبلين في حمام مائي مضبوطة على 65 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة لتسهيل الإزالة الطبيعية للغطاء. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام وسيط تركيب قائم على الماء أو تصلب وسط التركيب تماما ، فقم بإزالة الغطاء عن طريق النقع في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو ماء DI طوال الليل للسماح للغطاء بالسقوط بشكل طبيعي.
التبييض باستخدام LiBH₄
1. في غطاء الدخان ، قم بإعداد محلول طازج من LiBH₄ بتركيز 1 مجم / مل في ماء DI. اصنع ما يكفي لتغطية كل عينة 3 مرات.
  ملاحظة: لا تحضر أكثر من 10 مل في المرة الواحدة بسبب تفاعل LiBH₄ مع الماء. استخدم ماء DI وليس ماء Millipore / nanopure لنشاط التبييض الأمثل.
2. دع المحلول يرتاح لمدة 20 دقيقة. سوف تتشكل الفقاعات.
3. ماصة 1 مل من محلول LiBH₄ على كل شريحة في حجرة تلطيخ في غطاء الدخان. دع المحلول يستقر على الشريحة لمدة 10-15 دقيقة.
4. قم بإزالة LiBH₄ عن طريق سحب العينة من الشريحة واستبدلها ب 1 مل من LiBH_{4 جديدة.}دع المحلول يرتاح لمدة 10-15 دقيقة.
5. قم بإزالة LiBH₄ عن طريق سحب العينة من الشريحة واستبدلها ب 1 مل من LiBH_{4 جديدة.}دع المحلول يرتاح لمدة 10-15 دقيقة.
6. قم بإزالة LiBH₄ من الشرائح عن طريق سحب الشرائح وغمرها في ماء DI أو PBS للتخزين قصير الأجل (لا يزيد عن يوم واحد).
7. في غضون يوم ، انتقل إلى جولة تلطيخ IBEX التالية.
8. اختياري: شرائح التثبيت الرطبة وإجراء تصور سريع على نطاق التألق للتحقق من نجاح التبييض.
جبل رطب من الانزلاق في autostainer وتشغيل تلطيخ IBEX الثاني
1. تحضير جميع الأجسام المضادة ومحاليل صبغ TSA للصبغة التلقائية.
2. لتحضير جهاز Ventana autostainer:
  1. عندما تكون جاهزا لبدء التلوين التلقائي، ضع الماصة حوالي 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل التلقائي على الشريحة لمنع جفاف الحامل الرطب.
  2. قم بتحميل الشرائح المثبتة على الرطب في آلة التصبغ التلقائي.
3. بالنسبة إلى Bond Rx:
  1. ضع بلاط الغطاء على الشرائح.
  2. في الجزء العلوي من الغطاء ، قم بتعبئة 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت للسماح للمحلول بالتدفق إلى الفراغ بين العينة والغطاء.
  3. قم بتحميل العينات على autostainer.
4. قم بإعداد برنامج autostainer باتباع المثال الوارد في الجدول 2 مع تعيين N على عدد الأجسام المضادة في اللوحة.
5. قم بإزالة الشرائح من الصبغة التلقائية وقم بتطبيق غطاء باستخدام وسائط تركيب مائية مناسبة للتصوير متعدد الأطياف وغطاء # 1.5.
6. قم بتصوير الشرائح في غضون يومين من التلوين باتباع إجراء العينة الموضح في الخطوة 2.7 لإعداد جلسة التصوير وجمع الصور.
7. بعد التصوير ، عينات التبييض كما هو موضح في الخطوات 2.8-2.9.
كرر مع جميع لوحات IBEX المطلوبة.

3. تحليل العينات باستخدام البرامج المتاحة تجاريا

أكمل عمليات مسح الشرائح الكاملة للشرائح الملطخة قبل الشروع في المحاذاة.
إذا سمح البرنامج ، فقم بإجراء فك الخلط الطيفي من خلال وظيفة فك الخلط الآلي المضمنة في وظائف المسح ، بما في ذلك إزالة أطياف التألق الذاتي. إذا كانت هذه وظيفة للبرنامج المستخدم ، فحدد خيار إلغاء الخلط وقم بتشغيله باستخدام الإعدادات القياسية والأصباغ المحددة مسبقا
ملاحظة: يمكن إنشاء إلغاء خلط مخصص في معظم البرامج التي تسمح بفك الخلط. لإنشاء مكتبة ، تتم إضافة أقسام الأنسجة الفردية الملطخة بفلوروفور واحد إلى قياسات البرنامج. يتم أيضا فحص منطقة من الأنسجة غير الملوثة أو ذاتية الفلورسنت لتوصيف طيف التألق الذاتي ، ويتم تحديد ذلك باستخدام أداة التألق الذاتي. يتم تجميع هذه الأطياف داخل البرنامج عن طريق الضغط على "إعداد الصورة" ثم تصديرها إلى مكتبة فك خلط خاصة بالمشروع. ثم يتم تحديد هذه المكتبة كمكتبة فك الخلط في خيار إلغاء الخلط.
قم باستيراد الشرائح الممسوحة ضوئيا إلى برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا للمحاذاة.
تسجيل شرائح لجولات IBEX متعددة
1. حدد تكرارين لجولات IBEX ليتم تسجيلها.
2. انقر بزر الماوس الأيمن على الاثنين وحدد خيار التسجيل .
3. حدد التسجيل الافتراضي مع التسجيل عالي الدقة لمحاولة أولية للتسجيل.
4. بدلا من ذلك، حدد تسجيل قناة واحدة من الخيارات وحدد قناة واحدة كانت متسقة عبر جميع عمليات تشغيل IBEX.
  ملاحظة: هذا الخيار مفيد للأصباغ المقاومة للتبييض (انظر المواد التي لا تبيض الأصباغ لها).
محاذاة الصورة
1. افتح إحدى الصور المسجلة.
2. في علامة التبويب أدوات ، ضمن تسجيل الصور، حدد أدوات التسجيل لفتح كافة الصور المسجلة.
3. في علامة التبويب أدوات التسجيل ، حدد دالة المعلم.
4. استخدم وظيفة المعلم لضبط محاذاة الشرائح بأكملها.
  1. ضع علامة على المعالم على صورة شريحة واحدة يدويا.
  2. في صور IBEX الأخرى ، ضع علامة على نفس المعلم التاريخي. سيقوم البرنامج بتحسين المحاذاة باستخدام المعلم المحدد. كرر لضبط المحاذاة بدقة.
5. بمجرد الرضا عن المحاذاة ، قم بدمج الشرائح باستخدام Fuse | وظيفة وصمة عار تسلسلية.
6. كرر هذه العملية مع أي جولات تصوير IBEX إضافية حتى يكتمل مركب نهائي لجميع الصور.
تحليل الصور
1. تجزئة الخلايا
  1. ضمن علامة التبويب تحليل ، حدد وحدة HighPlex وافتحها، ثم حدد وحدة التنميط الظاهري لتحديد الخلية.
    1. قم بتحميل جميع العلامات وابدأ بالعثور على جميع النوى باستخدام علامة التبويب Nuclear Detection في وحدة Highplex . قم بتحميل علامات التحديد في علامة التبويب تحديد الصبغة . تحديد الخلايا باستخدام صبغة DAPI.
    2. في علامة التبويب تحليل ، قم بتشغيل أداة الضبط في الوقت الفعلي باستخدام المعلمات الرئيسية التالية: تعيين الحد الأدنى للكثافة النووية لتصفية إشارة الخلفية. ضبط الحد الأقصى لسطوع الصورة للتحكم في الرؤية الإجمالية للإشارة ؛ تم تعيين العدوانية للتجزئة النووية لتحسين حدود النوى المكتشفة.
    3. قم بضبط كل معلمة بعناية لضمان التجزئة الدقيقة.
2. كشف السيتوبلازم وعلامات الغشاء.
  1. انتقل إلى علامة التبويب اكتشاف الغشاء والسيتوبلازم .
  2. اضبط الحد الأدنى لنصف قطر السيتوبلازم على قيمة مناسبة للعينة للحجم المتوقع للخلايا.
  3. ضمن خيار Membrane Dyes ، حدد القنوات التي تكون علامات غشائية.
    ملاحظة: يجب أن يؤدي هذا إلى تجزئة أفضل للخلايا الفردية لمزيد من التحليل.
3. عتبة العلامة وتعيين النمط الظاهري
  1. لكل علامة، قم بتعيين عتبات الإشارات الإيجابية مقابل الإشارات السلبية. قم بذلك ضمن علامات التبويب التي تم إنشاؤها لكل علامة.
  2. قم بإجراء العتبة اليدوية لكل علامة لتحديد السكان.
  3. بدلا من ذلك ، استخدم نهجا آليا قائما على المعلوماتية الحيوية للعتبة. في خيارات متقدمة | تخزين بيانات الكائن (الخلية) ، قم بتبديل الخيار إلى True. قيد التصدير | بيانات الكائن، قم بتصدير مجموعة البيانات للحصول على معلومات تعبير العلامة لكل خلية محددة.
  4. قم باستيراد هذه البيانات إلى برامج إضافية لمزيد من التحليل المخصص. وترد في الجدول 5 خيارات للبرمجيات لمزيد من التحليل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم مثالا على لوحة IBEX التي تستخدم الكواشف المستندة إلى TSA على Autostainer 2 (الشكل 4). يمكن تحديد كل علامة بوضوح ، وهناك حد أدنى من النزيف بين العلامات. تم جمع الصورة عبر جولتين من التلوين. العينة هي أنسجة الرئة بعد الإصابة بالمتفطرة السلية. تمت محاذاة لوحتي تلطيخ IBEX باستخدام مثال على البرامج المتاحة تجاريا. باستخدام نهج IBEX مع كواشف TSA المحسنة (كما هو موضح هنا) ، يمكن رؤية وتقدير التنظيم المكاني للخلايا المناعية والعلامات الالتهابية وخلايا الرئة المتخصصة. يسمح التحسين المناسب للعلامات بالظهور بسهولة مع الحد الأدنى من الخلفية.

figure-results-1
الشكل 1: اختبار استرجاع المستضد باستخدام فلوروفور بانبعاث 520 نانومتر من مستضدين مختلفين. تم تصوير RAGE و CD3e باستخدام أوقات التعرض المحفوظة. حاتمة الجسم المضاد RAGE هذه حساسة للغاية وعرضة لاسترجاع المستضد المتكرر مع انخفاض سريع لحساسية الفحص مع استرجاع المستضد اللاحق. على العكس من ذلك ، تتحسن حساسية فحص CD3e مع جولات متعددة من استرجاع المستضد. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: RAGE = مستقبلات للمنتجات النهائية المتقدمة للجليكوشن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مثال على أهمية تطوير التسلسل فيما يتعلق بالتأثير الشامل. RAGE هي علامة معبور عنها بدرجة عالية في خلايا AT1 ، وبالاشتراك مع CD31 ، تمنع بشكل فعال النشاط المناعي ل SARS-CoV-2. ومع ذلك ، عندما يتم إجراء SARS-CoV-2 IHC أولا ، يمكن تصور جميع الإشارات. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: RAGE = مستقبلات للمنتجات النهائية المتقدمة للجليكاسیون ؛ AT1 = النوع السنخي 1 ؛ SARS-CoV-2 = فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2; IHC = الكيمياء المناعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: نظرة عامة على العملية باستخدام معدات التلوين الآلي لبروتوكول IBEX. التركيب الرطب للجولة 2 أو أعلى من عملية التلوين لمنع جفاف الأنسجة. اختصار: IBEX = التبييض التكراري يمتد إلى التعدد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مثال على IBEX مع الأصباغ القائمة على TSA من autostainer 2 على رئة مصابة بالمتفطرة السلية. تحتوي اللوحة 1 على جميع الأصباغ ، وتحتوي اللوحة 2 على أصباغ قابلة للتبييض. يتم تقديم صورة مدمجة لجميع القنوات عبر IBEX الكامل لصورة الرئة. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: IBEX = التبييض التكراري يمتد التعدد. TSA = تضخيم إشارة التيراميد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مثال على بروتوكول للتحقق من صحة تأثيرات رقم الدورة على الأجسام المضادة لاختبارات الدورة 1 و 3 و 6. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مثال على اللوحة 1 مع خمسة أجسام مضادة ل IBEX autostainer للتحقق من صحة اللوحة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مثال على اللوحة 2 مع أربعة أجسام مضادة ل IBEX autostainer للتحقق من صحة اللوحة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: مقارنة بين اثنين من autostainers. جدول يلخص إيجابيات وسلبيات Ventana Autostainer و Bond Rx. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: ملخص البرمجيات لتحليل الصور. جدول يلخص بعض مناهج التحليل وأدوات البرامج المتاحة لتحليل الصور بعد التجزئة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم اعتبارات لتكييف بروتوكول IBEX في مرافق علم الأمراض الأساسية مع تطبيق معدات التلوين الآلي وتحسين الكواشف القائمة على TSA في بروتوكول IBEX. نوضح أفضل طريقة لتحسين الجولات المتكررة لاسترجاع المستضد والتحميل المناسب في الجولة 2 أو أعلى على المعدات الآلية. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض طريقة إضافية لإجراء المحاذاة باستخدام برنامج Halo الذي قد يكون متاحا في المرافق الأساسية. وقد ثبت أن هذه الأساليب مفيدة في تحديد الاختلافات في بيئات الرئة في أنسجة الرئيسيات غير البشرية بعد عدوى SARS-CoV-2⁵.

يتمثل أحد المكونات الرئيسية لهذا العمل في تسليط الضوء على الحاجة إلى تحسين شامل لتصميم لوحة IBEX قبل تلطيخ الأنسجة التجريبية. وعلى وجه الخصوص، يجب أن تؤخذ في الاعتبار بعض الاعتبارات غير المرئية في طرائق IBEX الأساسية. الأول هو تأثير جولات متعددة من استرجاع المستضد على حساسية الأجسام المضادة. مع الكواشف القائمة على TSA ، يسبق كل تطور جديد للأجسام المضادة تمسخ الأجسام المضادة. ستكون بعض أزواج الأجسام المضادة / المستضدات عرضة لجولات إضافية من استرجاع المستضد وتقلل من حساسية الفحص ، في حين أن بعضها سيحصل على حساسية معززة مع التمسخ المتكرر / استرجاع المستضد. يعد الاختبار الدقيق لكل جسم مضاد في الأنسجة المستهدفة قبل تصميم الألواح أمرا مهما لضمان أفضل ممارسات التلوين وإبلاغ ترتيب تسلسل كل من الأجسام المضادة والأصباغ الفلورية. يتم اختبار المخازن المؤقتة ، بما في ذلك كل من السترات القائمة على السترات (درجة الحموضة 6.0) والقائمة على Tris-EDTA (الرقم الهيدروجيني 9.0) ، لجميع الأجسام المضادة لتحديد الظروف المثلى لاسترجاع المستضد. يتضمن ذلك تقييما منهجيا لكل مخزن مؤقت لتحديد أيهما يزيد من التعرض للمستضد لجسم مضاد معين. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين درجة الحرارة (على سبيل المثال ، 20-37 درجة مئوية) ، ووقت الحضانة (عادة 30-60 دقيقة) ، وظروف الحجب لتقليل تلطيخ الخلفية غير المحدد وضمان ارتباط محدد للأجسام المضادة الأولية والثانوية ، إذا لزم الأمر. قد يشمل الحجب قبل الأجسام المضادة الأولية والثانوية استخدام الكواشف الحاسرة المتاحة تجاريا لحساب التألق الذاتي الخاص بالأنسجة أو التفاعلات غير المحددة. تشمل الاعتبارات المهمة الأخرى التي يجب تحسينها قبل وضع اللمسات الأخيرة على لوحات IBEX تأثير المظلة ، حيث يمكن أن يحدث تدريع الحواتم إذا لم يتم تلبية الطلب لسؤال البحث المحدد الذي يتم^{طرحه 6}. لتجنب نزيف الفلورسنت ، من المعتاد وضع أهداف مستضد عالية التعبير في قنوات حمراء بعيدة تحتوي على أقل نزيف وعلامات أضعف في نطاق 480-520 نانومتر ، والتي سيكون لها أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء نظرا لأن هذه الأصباغ الفلورية هي الأكثر سطوعا⁷. ومع ذلك ، يجب إيلاء الرعاية لعينات الأنسجة عالية الفلور الذاتي التي قد تكون أكثر سطوعا في هذا النطاق. نوصي بمعالجة هذه المشكلة عن طريق تصوير الأنسجة بدون أي أصباغ لمعالجة المستويات المحتملة من الفلور الذاتي. معا ، يمكن لخطوات التحسين هذه ، التي يتم اتخاذها مع جميع التحسينات العادية وعناصر التحكم التي يتم إجراؤها عادة باستخدام IBEX ، أن تعلم تصميم اللوحة المناسب ل IBEX مع كواشف TSA.

في هذه الطريقة ، أظهرنا استخدام اثنين من autostainers الشائعة. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه الأساليب على طرق autostainer الأخرى أيضا. الجزء الرئيسي هنا هو الإزالة المثلى للأغطية والحمل الرطب لجولات تلطيخ إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، لا نحدد أي إعداد مجهر محدد. على الرغم من أن المجموعات قد توصي باستخدامها مع أنظمة تصوير معينة لمسح الشرائح الأمثل ، إلا أن أي إعداد مجهر ، لا سيما مجهر التألق مع مكعبات مرشح متوافقة ومصدر ضوء LED واسع الطيف. تتطلب بعض الأصباغ كاشفات متعددة الأطياف أو مكعبات ترشيح متخصصة ، والتي قد لا تكون متوفرة في جميع المختبرات ويمكن أن تمثل تحديات عند استخدامها مع مكعبات الترشيح القياسية بسبب تداخلها الطيفي. يتم فصل هذه الأصباغ بشكل أفضل باستخدام أنظمة التصوير متعددة الأطياف أو مرشحات محددة للغاية. تقع بعض الفلوروفورات خارج نطاق المرشحات التقليدية ذات اللون الأحمر البعيد (عادة ~ 700 نانومتر) وتتطلب مكعب مرشح متخصص أو كاشف قادر على التقاط إشارات الأشعة تحت الحمراء القريبة. تم تصميم المجاهر المتخصصة باستخدام هذه المرشحات ، ولكن البدائل متاحة. سيتطلب ذلك تحسينا إضافيا لتحديد كيفية أداء الأصباغ في تكوين مجهر معين.

يوصى بشدة بفك الخلط متعدد الأطياف ل IHC الفلوري متعدد الإرسال ، خاصة عند العمل مع الأنسجة المعرضة للتألق الذاتي ، لأنه يفصل بشكل فعال الإشارة الحقيقية عن ضوضاء الخلفية. يمكن للتألق الذاتي ، الذي غالبا ما يتداخل مع أطياف الانبعاث للفلوروفورات شائعة الاستخدام (خاصة في قنوات الطول الموجي عالي الطاقة) ، أن يحجب أو يتداخل مع إشارات معينة ، مما يقلل من الدقة. يؤدي فك الخلط الطيفي رياضيا إلى فك تشابكات أطياف الانبعاث المتداخلة ، مما يؤدي إلى عزل إشارات الفلورسنت الحقيقية أثناء "تنظيف" التألق الذاتي غير المرغوب فيه. يعد فك الخلط الطيفي ذا قيمة خاصة في سير عمل IBEX ، حيث يعد تحقيق أنظف الإشارات الممكنة أمرا بالغ الأهمية بسبب الطبيعة التكرارية لعملية التلوين والتصوير. في IBEX ، يتم تصوير الإشارات من جولات متعددة من التلوين وتبييضها وتكديسها فوق بعضها البعض لإنشاء صورة مركبة. يمكن أن ينتشر أي تألق ذاتي أو نزيف لا يزال دون حل في جولة واحدة من خلال الصور المكدسة ، مما يعقد التحليل النهائي ويقلل من الثقة في توطين العلامات. يعمل فك الخلط الطيفي على عزل إشارات التألق الحقيقي بشكل فعال عن التألق الذاتي في الخلفية ، مما يضمن اكتشافا أنظف وأكثر دقة للإشارة في كل جولة على حدة. يعد وضوح الإشارة هذا ضروريا لإنشاء صور مركبة موثوقة حيث يتم تحليل علامات متعددة معا عبر الجولات ، مما يتيح الأنماط المظهرية والتحليل المكاني الواثق. تتميز منصة التصوير المستخدمة لهذا البروتوكول بإمكانيات فك الخلط المدمجة ، ولكن هناك حاجة إلى المزيد من خيارات فك الخلط للتوافق مع منصات التصوير الأخرى ذات الشرائح الكاملة الفلورية.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد قيود هذا العمل هو الطبيعة المملوكة للقوالب التلقائية ، حيث تم تحسين الكواشف المرتبطة بها ومخازن الغسيل لهذه الأنظمة ، لكن التركيبات المحددة لا تزال غير معلنة. علاوة على ذلك ، فقد ركزنا حصريا على برنامج واحد متاح تجاريا لتحليل صور الشرائح الكاملة ونعترف بأن تكلفة تراخيص البرامج قد تشكل عائقا ماليا لبعض المختبرات. برنامج تحليل إضافي ^8,9 والخيارات في R تبدو واعدة; على وجه الخصوص ، Bodenmiller Group¹⁰ ، التي أنشأت مجموعة حزم تبدو مثالية للنوى ، حيث تم تصميم IMCDataAnalysis¹¹ لسير العمل القابل للتكرار على تحليل المصب للصور المتعددة في R. ومع ذلك، هناك حاجة إلى بذل جهود مستقبلية لتطوير وتوصيف بدائل ميسرة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل IBEX للشرائح بأكملها لضمان اعتماد أوسع عبر البيئات المحدودة الموارد. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النهج مع استخدام الصبغات الذاتية ل IBEX مع تلطيخ أكثر تقليدية في IBEX ، بما في ذلك الأجسام المضادة الأولية المترافقة الفلورية ، أو مع الأجسام المضادة الثانوية القياسية بدون الأصباغ القائمة على TSA إذا كانت الأنسجة ذات جودة عالية بما يكفي ووقت تثبيت مثالي للسماح بإشارة جيدة.

بشكل عام ، نأمل أن يساعد هذا العمل في تطبيق IHC الفلوري متعدد الإرسال القائم على TSA باستخدام معدات المرافق الأساسية لعلم الأمراض المستخدمة بشكل روتيني لتكييف IBEX على نطاق أوسع في هذه البيئات. يسلط هذا النوع من التطبيقات الضوء حقا على تعدد استخدامات بروتوكول IBEX ويوضح فائدته حتى في عينات الأنسجة الصعبة أو في مناهج الدفعات الكبيرة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم إميلي سبيرانزا من خلال صناديق بدء التشغيل من مؤسسة كليفلاند كلينك. استخدم هذا العمل الأدوات المكتسبة من منح SIG من المعاهد الوطنية للصحة (S10OD026983 و S10OD030269 إلى NAC).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كاشف التلوين مجموعات Alexa TSA	ثيرموفيشر		أصباغ TSA البديلة إذا لم تتوفر مرشحات المجهر من أوبال. تشمل هذه القنوات Alexa Fluor 488 (قناة زرقاء/خضراء)، Alexa Fluor 555 أو 568 (قناة حمراء)، Alexa Fluor 647 (قناة حمراء بعيدة)، Alexa Fluor 750 (قناة قريبة من الأشعة تحت الحمراء، إذا كانت مزودة بفلاتر مناسبة).
الأجسام المضادة Arg1	الإشارات الخلوية	93668	استخدم في الشكل 4 عند 1:100
Material Blades	لايكا بيوسيستمز		أو مشابه، الملف العالي أو المنخفض يعتمد على نوع الأنسجة
الأجسام المضادة CD11b	أبكام	ab133357	المستخدم في الشكل 4 عند 1:2000
الأجسام المضادة CD163	أبكام	ab182422	مستخدم في الشكل 4 عند 1:500
الأجسام المضادة CD31	الإشارات الخلوية	77699S	المستخدم في الشكل 2 عند 1:100
الأجسام المضادة CD3e	داكو	A045201-2	استخدم في الشكل 1 عند 1:100
أداة <بر/> جرة كوبلن	فيشر ساينتيفك	01-816-21	أو شيء مشابه
أغطية Material	VWR	v48393-026	أو شيء مشابه
الأجسام المضادة CX3CR1	أبكام	AB308613	مستخدم في الشكل 4 عند 1:450
Stain DAPI	أكويا	FP1490
برمجيات فيجي			يستخدم لقياس شدة الإشارة
سلايد سلايد<بر/> فيشر سوبرفرونت	فيشر ساينتيفك	22-037-246	أو ما شابه
Software HALO	مختبرات إنديكا		مثال على برامج تحليل الصور المتوفرة تجاريا. يستخدم لمحاذاة وتحليل الصور.
الأجسام المضادة Iba1	الإشارات الخلوية	17191	مستخدم في الشكل 4 عند 1:800
Software inForm	أكويا		يستخدم لقياس شدة الإشارة
الأجسام المضادة iNOS	أبكام	ab283655	استخدم في الشكل 4 عند 1:400
Instrument لايكا بوند RX (أو RXm)	لايكا بيوسيستمز	21.2201	يشار إليه في النص باسم "أوتوستينر 1". تأكد من توفر جميع المواد الكيميائية المرتبطة بها بما في ذلك صناديق التلوين والحلول السائبة.
Reagent LiBH4	سيغما-ألدرتش	62460-5G-F	ابق في بيئة خالية من الماء
Instrument Mantra Snap	أكويا		هناك حاجة إلى مجهر متعدد الأطياف برائحة الفلور لاكتشاف الأصباغ. مثال على المجهر الذي يمكن استخدامه للكشف عن أصباغ الأوبال.
Tool Microtome	لايكا بيوسيستمز		أو مشابها مع الإكسسوارات المفضلة مثل الفرش
مادة الصبغ مجموعة أوبال IHC 480	أكويا	FP1500001KT	المستخدم في الشكل 4
مادة الصبغ Opal IHC 6-plex Plex Plex	أكويا	NEL821001KT	520 و620 لا يبيثان، واستخدمت في الشكل 1 و2 و4
مادة الصبغ مجموعة أوبال IHC 780	أكويا	FP1501001KT	المستخدم في الشكل 4
فرن Tool	ميليبور سيغما	Z683329	أو شيء مشابه، يمكن أيضا القيام به على الأوتوستينر
الأجسام المضادة بانسيتوكيراتين	أبكام	ab9377	مستخدم في الشكل 4 عند 1:50
PBS (اختياري)	فيشر ساينتيفك	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	أكويا		تصوير شرائح كاملة متعددة الأطياف مع فك الخلط الطيفي المدمج في البرنامج
Reagent ProLong Gold Antifade	فيشر ساينتيفك	P36961	أو وسائط تثبيت مائية مماثلة
الأجسام المضادة ProSP-C n-terminal (ProSPC)	الكواشف الحيوية لسيفن هيلز	WRAB-9337	استخدم في الشكل 4 عند 1:250
غضب الأجسام المضادة	R& D	MAB1179	مستخدم في الشكل 1 و2 عند 1:50
مخزن تفاعل الكاشف	روش	NC1895692	للاستخدام مع فينتانا أوتوستينر
الأجسام المضادة SARS-CoV-2-N	الإشارات الخلوية	68344	مستخدم في الشكل 2 عند 1:1000
شرائح مجهر CC الالتصاق TOMO - WH	أفانتيك	SKUSL6519-1	إذا كان التصاق الأنسجة مصدر قلق
إنسترومنت<بر/> فينتانا ديسكفري ألترا	روش		يشار إليه في النص باسم "أوتوستينر 2". تأكد من توفر جميع المواد الكيميائية المرتبطة بها بما في ذلك صناديق التلوين والحلول السائبة.
مخزن الغسيل	لايكا بيوسيستمز	AR9590	للاستخدام مع جهاز لايكا بوند الأوتوستينر
ماء الكاشف	فيشر ساينتيفك	15-230-147	DI هو الأفضل، وليس الملي بور
Tool حمام مائي	لايكا بيوسيستمز	140607020C1	أو شيء مشابه

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nature Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
Prichard, J. W. Overview of automated immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med. 138, 1578-1582 (2014).
Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, 46-58 (2014).
Speranza, E., et al. Age-related differences in immune dynamics during SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques. Life Sci Alliance. 5, 4(2022).
Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers (Basel). 12 (2), 255(2020).
Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the Basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
Feng, Y., et al. Spatial analysis with SPIAT and spaSim to characterize and simulate tissue microenvironments. Nat Commun. 14, 2697(2023).
Meyer, L., Eling, N., Bodenmiller, B. cytoviewer: an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of highly multiplexed imaging data. BMC Bioinformatics. 25, 9(2024).
Windhager, J., et al. An end-to-end workflow for multiplexed image processing and analysis. Nat Protoc. 18 (11), 3565-3613 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

يمتد التبييض التكراري من التعددية باستخدام أتمتة التلوين للمرافق الأساسية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة