تتبع البروتينات المفردة في طبقات الدهون الثنائية باستخدام المجهر الفلوري

Summary

تقدم هذه المقالة وصفا مفصلا لكيفية إنشاء عينات لتتبع البروتين الواحد في طبقات الدهون الثنائية المدعومة بالمواد الصلبة. كما يشرح المجهر الفلوري البسيط بحساسية جزيء واحد ومعدل إطارات سريع. وأخيرا، نستعرض الإجراء لاستخراج مسارات البروتين الواحد.

Abstract

الملاحظة المباشرة هي طريقة أساسية للاكتشاف والفهم العلمي. يتيح تصوير الفلورة أحادية الجزيئات بتقنية التايم لابس مراقبة البروتينات الفردية أثناء حركتها وتفاعلها مع محيطها، مما يجعل الحالات التي عادة ما تكون مخفية في قياسات المجموعة مرئية. تتبع البروتين الواحد مناسب بشكل خاص لدراسة بروتينات الغشاء، حيث تمكن طبيعته ثنائية الأبعاد من التصوير السريع والواسع النطاق مع حساسية للفلوروفور الأحادي. استخدام طبقات دهنية اصطناعية تحاكي الأغشية التي توجد فيها بروتينات عبر الأغشية أو الغشاء المحيطي (مثل أغشية البلازما أو أغشية العضيات داخل الخلية من أنواع خلايا مختلفة) يسمح بقياس تفاعلات محددة في البيئات القريبة من الطبيعي. كما يسمح بإضافة التعقيد تدريجيا، مكونا تلو الآخر، مع كبح التداخل الخلفي الناتج عن الفلورة وتشتت رامان. من خلال إضافة التحكم في درجة الحرارة، يصبح من الممكن تحديد الخصائص الديناميكية الحرارية لتفاعلات الجسيمات الفردية أيضا. في هذا العمل، نصف بروتوكولا لتحضير العينات، وجمع البيانات، وتتبع الفلورة الجزيء الواحد، وتحليل مسارات بروتين الغشاء في طبقات الدهون الثنائية باستخدام أكوابورين-4. يعد هذا العمل مثالا أساسيا ويمكن تكييفه لتناسب البروتينات المختلفة وتركيبات الطبقات الثنائية.

Introduction

في الظروف البيولوجية الطبيعية، تحيط بروتينات الغشاء بشبكة واسعة من التفاعلات، تشمل بروتينات غشائية أخرى، وبروتينات في السوائل داخل وخارج الخلية، وأنواع مختلفة من الدهون والكوليسترول، والركائز أو الليجند، والتفاعلات مع المحلول، والتفاعلات بين المصفوفات خارج الخلية وداخل الخلية. النهج الفيزيائي الحيوي الكلاسيكي لفهم التفاعلات المحددة والجماعية بشكل أفضل يبدأ بمكون واحد، ثم يدخل مكونات إضافية تدريجيا واحدا تلو الآخر حتى يعكس التعقيد البيئة الأصلية - وهو نهج "فرق تسد" في الفيزياء الحيوية. طريقة حديثة على المستوى الجزيئي لدراسة هذه التفاعلات هي من خلال الملاحظة المباشرة باستخدام تصوير فلوري جزيء واحد بتقنية التايم لابس لتتبع البروتينات الفردية أثناء تحركها وتفاعلها مع بيئتها. في هذه الورقة، نصف الخطوات الأساسية لهذا النهج، بما في ذلك تكوين طبقات ثنائية الدهون على طبقات الكوارتز وإدخال بروتين غشائي كبير في هذه الطبقات الثنائية الجاهزة بطريقة مناسبة للتصوير ببروتين واحد. وسيتبع ذلك بروتوكول 'حصان عمل' لتتبع البروتينات الفردية في طبقات ثنائية مدعومة.

تصف هذه المقالة كيفية إنشاء طبقات دهنية ثنائية مدعومة بالصلب باستخدام الحويصلات الأحادية السطح الصغيرة (SUVs) التي تتمزق على انزلاقات الكوارتز المحبة للماء. يتم تحضير أسطح الكوارتز إما بغسل حمضي أو بتنظيف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية (UV). يجب أن يتطابق الدهون المستخدمة لصنع سيارات الدفع الرباعي، عندما يكون ذلك ممكنا، مع التركيب الكيميائي الرئيسي للغشاء البيولوجي المعني (على سبيل المثال، يوجد أكوابورين-4 (AQP4) في غشاء البلازما للخلايا النجمية، والمكونات الرئيسية هي POPC (46.4٪)، POPE (8.5٪)، PS (5.6٪)، الكوليسترول (30٪)، PI (2.5٪)، وSM (5.6٪^))1,2. لمنع التفاعل مع الركيزة الصلبة، تقوم الإضافات مثل البولي إيثيلين غليكول (PEG) المزروعة بالدهون برفع الطبقة الثنائية عن السطح^3،4. يجب ضبط كمية كل إضافة بعناية لضمان عدم انسداد انتشار البروتين، مع توفير الدعم الكافي لرفع الغشاء عن سطح الركيزة. عادة ما تظهر الإضافات مثل الدهون المصنوعة من PEGylated مرحلتين: 'طور الفرشاة' و'طور الفطر'. تحدث مرحلة الفرشاة عندما يكون PEG بتركيز عال، مما يجعل البوليمر يقف بشكل مستقيم لتقليل العوائق الفضائية. يحدث طور الفطر عند تركيزات منخفضة، عندما تكون البوليمرات مفصولة بما يكفي لتكون لفافات عشوائية. بشكل عام، تعيق مرحلة الفرشاة الانتشار، لكن مرحلة الفطر لا توفر دعما كبيرا. التركيز بين طور الفرشاة والفطر هو الأمثل، حيث يوفر دعما مع تأثير طفيف على الانتشار ^3,4.

بعض البروتينات الغشائية تدخل تلقائيا في أغشية دهنية مدعومة بصلب، مثل P450s وإناز السيتوكروم P450 ريدوكتاز⁵، بينما ستحتاج أخرى إلى إدخال باستخدام المغسفات، وهي عملية دقيقة. الغسل الدقيق ضروري لإزالة هذه المنظفات، وكذلك أي بروتينات غير مدمجة قد تتداخل مع تتبع البروتين الواحد - وهي عملية سيتم وصفها بالتفصيل. التركيز الرئيسي لهذا المقال هو إعداد عينة لتتبع جزيء واحد (SMT) باستخدام التصوير الفلوري المؤقت (time-lapse fluorescence). يتطلب ذلك هدفا بتكبر عالي وفتحة عدسة رقمية (NA) — عادة هدف غمر الزيت 100x و1.45 NA ^6,7. كما يتطلب كاميرا سريعة وحساسة للغاية (كاميرا EMCCD، CMOS، أو ICCD) وإثارة ليزرية. يجب أن يغطي الإثارة بالليزر مجال رؤية واسع بما يكفي لقياس مسارات البروتين الطويلة، وغالبا ما يتم ذلك باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي لإنشاء مجال متلاشي حوالي 50 ميكرومتر × 100 ميكرومتر أو إضاءة إبيني-إبي-باستخدام بصريات تشكيل الشعاع (من غاوسي إلى توب-هات) حوالي 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر⁸ أو ورقة بصرية مائلة ومغلفة (HILO) ذات حقل مشابه ل TIRF. يتميز المجهر بالفلورة الانعكاسية الداخلية الكلية (TIRF) بميزة تقليل الإشارة الخلفية. يعرض أدناه تصميم مجهر TIRF بسيط وغير مكلف نسبيا. من خلال إضافة ضوابط في درجة الحرارة، يمكن قياس عدة خصائص ديناميكية حرارية مثل الإنثالبي، الإنتروبيا، وطاقة جيبس الحرة⁹. تتطلب التقنية أيضا وضع علامات فلورية على بروتين الغشاء بدرجة من الوسم تضمن أن معظم بروتينات الغشاء تحمل علامة فلورية.

البروتين العابر للغشاء محل الاهتمام في هذا المقال هو AQP4. AQP4 هو قناة مائية مستقطبة في نهاية أقدام الخلايا النجمية ومناطق أخرى من الأوعية الدموية للجهاز العصبي^{المركزي.} يمكنه نقل ما يصل إلى 3 مليارات جزيء ماء في الثانية ويشارك في توازن الماء، وهجرة الخلايا، وذمة الدماغ، والتعلم، وتكوين الذاكرة من خلال اللدونة المشبكية¹¹. تم ربط اختلال تنظيم وظيفة AQP4 بعدة حالات عصبية، بما في ذلك وذمة الدماغ، التهاب العيون العصبي النخاعي، والصرع^{12، 13، 14، 15}. AQP4 هو بروتين بحجم 32-37 كيلو د، يعتمد على تنظير شكله، وله بنية رباعية رباعية مع ثمانية مجالات غشائية كارهة للماء متصلة بحلقات الاتصال، ومجال N-طرفي داخل الخلية، ونطاق C طرفي كبير داخل الخلية¹⁶. هناك شكلان رئيسيان في AQP4، M1 و M23؛ الفرق ينشأ من البدء عند بقايا الميثيونين 1 أو بقايا الميثيونين 23. أظهرت الأبحاث أن الشكل M1 يمكن أن يشكل ثنائيات أو ثلاثيات مع نفسه، اعتمادا على حالته في البالميتويلية⁹. يتجمع متساوي M23 إلى تجمعات بروتينية كبيرة تعرف باسم المصفوفات المتعامدة للجسيمات (OAPs). عند التعبير المشترك، يحد معادل M1 من نمو OAP من خلال تكوين طبقة بروتينية محيطية حول الجزء الخارجي 17,18,19. قد تكون ديناميكيات تجمع ال OAP عاملا رئيسيا في تعديل نفاذية الماء والتوازن الداخلي في الدماغ. في هذا المقال، نسرح الخطوات اللازمة لتتبع كل AQP4 في الغشاء ومراقبة التفاعلات الفردية بين البروتين والبروتين.

Protocol

1. تحضير الحويصلات الصغيرة أحادية السطح

1. أخرج محاليل مرق الدهون من الفريزر واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
2. أخرج قارورة نظيفة بسعة 10 مل من الفرن واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
3. أضف 900 ميكرولتر من الكلوروفورم الطيف و100 ميكرولتر من الميثانول الطيفي إلى القارورة الباردة ذات القاع المستدير، ثم أضف الكميات المناسبة من كل دهون في الخليط. حرك القارورة للتأكد من خلط الدهون بشكل جيد.
   ملاحظة: يستخدم مؤلفون آخرون نسب مختلفة بين الكلوروفورم إلى الميثانول، لكننا وجدنا أن أفضل نسبة لتكوين كعكات دهنية متجانسة كانت 9:1.
   تم توفير جدول بيانات لحساب الكميات الصحيحة من الدهون في الملف التكميلي 1. إذا كنت تحضر الدهون للتحقق من تكوين طبقة الدهون الثنائية على سطح الركيزة، استخدم دهنية موسومة بالفلورية.
4. ضع موصل تقطير فراغي فوق قارورة القارورة ذات القاع المستدير، كما هو موضح في الشكل 1، وقم بتوصيله بخط النيتروجين (جهاز التجفيف).
   ملاحظة: استخدم نيترن₂(g) منقى ومرره عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر قبل توصيله بجهاز التجفيف.
5. شغل_N2(g) واضبط الضغط بحيث يكون التدفق بالكاد يشعر به على ظهر اليد.
   ملاحظة: ترطيب ظهر اليد يمكن أن يساعد في الإحساس بالتبخر.
6. اترك العينة تجف تحت تدفق_N2(g) لمدة 2.5-3 ساعات، مع التحقق بشكل دوري لضمان استمرار تدفق النيتروجين. من المرجح أن تظهر العينة جافة خلال النصف ساعة الأولى؛ ومع ذلك، استمر في تدفق النيتروجين لمدة 2-2.5 ساعة إضافية لإزالة أي مذيب متبق.
   ملاحظة: يمكن أيضا تجفيف العينة طوال الليل.
7. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لكل 5.0 ميكرومول من إجمالي الدهون في القارورة ذات القاع المستدير.
   ملاحظة: المخزن المستخدم في هذه الدراسة كان يتكون من 100 ملليمولار HEPES، 5 ملليمولار_CaCl2، و140 ملليمولار NaCl؛ وهذا هو نفس المخزن المستخدم طوال تحضير العينة.
8. ضع سدادة زجاجية على القارورة ولفها بفيلم البارافين.
9. ضع القارورة في مشبك على حامل حلقي واغمس قاع القارورة في حمام من جهاز سونيكاتور مضبوط على 60 درجة مئوية. اترك القارورة تحضن لمدة ساعة، مع الدوران الخفيف كل 15 دقيقة لتكوين ليبوزومات متعددة الصفائح، وتظهر كمحلول معتم بدون دهون متصلة بالقارورة.
10. بعد حضانة ساعة، شغل جهاز الصوت (~35 كيلوهرتز) واضبط السعة على أعلى إعداد. ثم حرك القارورة في الحمام لتجد المكان الذي يحدث فيه أكبر تحريك بحيث يمتد المحلول ويرش داخل القارورة. سونيكيت لمدة 30 دقيقة، أبحث عن تغيير من الشفافة إلى الشفافة وقليل من الشفافية.
11. قم بإزالة محلول الدهون من القارورة وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم استخدم الطرد المركزي عند 100,000 × جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. أزل المادة الفائقة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظة: قد تتكون حبيبات صغيرة في أسفل الأنبوب. إذا كانت الحبيبة كبيرة، تخلص منها وكرر العملية.
12. استخدم سيارات الدفع الرباعي بعد الطرد المركزي، وخزنها على درجة حرارة 4 °م لمدة أسبوع، أو حافظ على -80 درجة مئوية مع بعض التريهالوز.
    ملاحظة: الكمية الموصى بها من التريهالوز هي 1 ملغ لكل مل من محلول الدهون. لتحقيق أفضل النتائج، يمكن صنع سيارات SUV جديدة أسبوعيا وتخزينها في الثلاجة.
    ملاحظة: هذه مجرد طريقة واحدة لتحضير سيارات الدفع الرباعي. بجانب سيارات الدفع الرباعي، يمكن إنتاج الحويصلات الصغيرة والمتوسطة والكبيرة أحادية السطح باستخدام البثق أو الليبوزومات الأحادية الصفيحية العملاقة من خلال التشكيل الكهربائي^{20، 21، 22، 23}.

2. وضع علامات البروتين

ملاحظة: وضع علامات على البروتينات بمجسات فلورية باستخدام أنواع مختلفة من المرتبطات، مثل إستر NHS والماليميدات، موثق ومفهوم جيدا. ومع ذلك، فإن درجة الوسم (DOL) مهمة بشكل خاص في تتبع البروتين الواحد. في هذه الدراسة، كان من الضروري تحديد نسبة البروتينات العابرة للغشاء الموسومة وتوزيع الفلوروفورات على كل رباعي AQP4.

1. ضع أنبوب غسيل في كأس يحتوي على مخزن فوسفات بقوة 0.1 متر عند درجة حموضة 8.3 تم تمريره عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر. ثم أتركه في المخزن طوال الليل في وضع معكوس، مما يسمح للغشاء بالتجهيز.
2. في اليوم التالي، استبدل المخزن داخل أنبوب الغسيل بمحلول البروتين.
   ملاحظة: يجب أن يكون حجم محلول البروتين ضمن 20-250 ميكرولتر. يجب أن يكون هناك ~1-5 ملغ من البروتين المذاب داخل المحلول.
3. بمجرد وضع البروتين في أنبوب الغسيل الكلولي، دعه مقلوب طوال الليل في مخزن فوسفات 0.1 مل.
4. بعد الغسيل الكلوي، انقل البروتين إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
5. جهز أنبوب غسيل كلى جديد بتكرار الخطوة 2.1.
6. جهز صبغة NHS بوضع بعض الحبيبات (3-4) على قطعة صغيرة من ورق الوزن، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل واذيب في 100 ميكرولتر من DSMO. تابع ذلك بتخفيفين بمقدار 1 مل 10 طيات في DMSO، باستخدام التخفيف النهائي لتحديد تركيزات كل عينة باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية. لتحقيق متوسط DOL يبلغ 2-3، أضف فائضا ثلاثي الأضرار من الصبغة التفاعلية إلى محلول البروتين أثناء الرج بلطف.
   ملاحظة: مطياف الأشعة فوق البنفسجية البصرية القياسي يكفي لهذا الغرض، رغم أن مطياف الحجم صغير الحجم مفيد بسبب حجم العينة.
7. أضف الصبغة التفاعلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على البروتين بكميات متساوية. بمجرد جمع الصبغة التفاعلية والبروتين، استخدم المغذيات لمدة لا تقل عن 8 ساعات.
8. بعد التغذية، انقل البروتين الموسوم إلى أنبوب الغسيل المعد في الخطوة 2.5 وضعه في كأس يحتوي على مخزن فوسفات طازج. ضع قضيب التحريك في المخزن واتركه يدور بلطف لمدة 6 ساعات، تليها تبديل المخزن و6 ساعات أخرى من الغسيل الكلوي.
9. بعد تبديل المخزن المؤقت (buffer rates)، ضع أنبوب الغسيل الذي يحتوي على البروتين الموسوم في كأس نظيف يحتوي على المخزن النهائي العامل.
   ملاحظة: تكون المخزن العامل النهائي المستخدم في هذه الدراسة من 100 ملليمولار HEPES، 5 ملليمولار CaCl₂، و140 ملليمولار NaCl عند درجة حموضة 7.4.
10. بعد الغسيل الكلوي، قم بقياس DOL باستخدام مطياف UV-vis.
    ملاحظة: من المهم اتباع الطرق القياسية لقياس DOL. فيما يلي معادلة للحساب.
    (1)
    حيث يكون الامتصاص المقاس عند ذروة الصبغة وذروة البروتين عند 280 نانومتر هو . معامل انقراض البروتين هو (محسوب من الوزن الجزيئي للبروتين)، بينما و يتم توفيرها من قبل مصنع الصبغة.

3. تحضير أغطية كوارتز قطرها 25 مم

ملاحظة: فيما يلي طريقتان مختلفتان:

1. غسل الحمض
   ملاحظة: هناك عدة إجراءات منشورة للغسل الحمضي، بما في ذلك البيرانا والحفر الأساسي. وجدنا أن الإجراء أدناه يوفر سطحا نظيفا للغاية ومحبا للماء دون حفر مائي، وهو ما يفضل في دراسات الجزيئات الفردية باستخدام التصوير الفلوري.
   1. طريقة الغسيل الحمضي تتطلب غطاء بخار أثناء تسخين المحلول ومعدات الحماية الشخصية (نظارات واقية، معطف مختبر، قفازات). يجب أن تتوفر زجاجة رش من بيكربونات الصوديوم في الغطاء تحسبا لأي انسكاب.
   2. ضع الغطاء في كأس واملأه بماء نانونقي و30٪ بيروكسيد الهيدروجين وحمض النيتريك المركز بكميات متساوية من حيث الحجم (محلول بنسبة 1:1:1).
   3. سخن الغطاء في هذا المحلول لمدة 30 دقيقة حتى يبدأ المحلول في الفقاعات.
   4. تحقق من المحلول وامزج بلطف كل 10 دقائق لمنع التصاق الغطاء ببعضها. عند تدوير المحلول، لاحظ الانزلاق وهو ينفصل ثم ينفصل. بمجرد فصلهما، قم بإبطاء السرعة تدريجيا لإبقائهما متباعدين، مما يسمح للمحلول المغلي بتغليف الطبقات.
      ملاحظة: يجب عدم تسخين المحلول بقوة زائدة، لأن التفاعل ينتج حرارة. اضبط لوحة التسخين على فقاعات خفيفة، عادة على أدنى إعداد. في هذه الإعدادات، يبقى الحل عند ~70 درجة مئوية. كما ينصح باستخدام بيروكسيد الهيدروجين الطازج.
   5. بعد مرور 30 دقيقة أو توقف المحلول عن الفقاعات، دع المحلول بنسبة 1:1:1 يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم اشطف الغطاء جيدا بماء منقي باستخدام لف لطيف.
2. الأوزون فوق البنفسجي
   1. نظف أغطية الكوارتز باستخدام n-هكسان، ثم الميثانول باستخدام أدراج العدسة.
   2. ضع أغطية الغطاء في منظف أوزون بالأشعة فوق البنفسجية بحيث يكون السطح المراد معالجته مواجها للمصباح.
   3. تدفق الأكسجين إلى الحجرة عند 5 psi لمدة 5 دقائق؛ ثم أوقف تدفق الأكسجين.
   4. بعد ذلك، شغل أضواء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، واترك الأغطية لمدة لا تقل عن 10 دقائق حتى يخرج الأوزون.
   5. بعد استخدام أي من طريقتي التنظيف، تأكد من استخدام أغطية الغطاء المنظفة فورا. إذا كنت تستخدم انزلاق تم تنظيفها سابقا، كرر العملية لتجديد السطح.
      ملاحظة: يتطلب التصوير بالأشعة فوق البنفسجية دوران مستمر لإزالة الأوزون من الهواء. يجب وضع النظام تحت أنبوب تنفس للتحكم بالهواء أو في غطاء بخار.

4. تكوين الطبقتين الثنائية ودمج AQP4 في غشاء الطبقة الثنائية

ملاحظة: تكون المخزن المستخدم في هذه الدراسة من 100 ملليمولار HEPES، و5 ملليمولار CaCl₂، و140 ملليمول NaCl عند درجة حموضة 7.4.

1. ضع غطاء الغطاء الذي تم تنظيفه حديثا في حامل عينة بحجم 25 مم باستخدام أنبوب عدسة SM1 بحجم 1/4 بوصة. ثم اقطع حشوة بارافيلم مزدوجة الطبقة بقطر 8 مم ووضعها في مركز حامل العينة (انظر الشكل 3).
2. ضع قطرة 50 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي على مركز حشية 8 مم، ثم أغلقها، ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
   ملاحظة: هذا يسمح للليبوزومات بالاندماج مع سطح الكوارتز المحبة للماء والتمزق، مكونة طبقة ثنائية مستمرة.
   من المرجح جدا أن كمية الليبوسومات المضافة إلى منطقة الحشية قد تختلف، وقد يتطلب الحشية الأكبر المزيد من الليبوزومات لتكوين طبقة ثنائية مستمرة. ومع ذلك، فإن الكميات المحددة في الخطوة 4.2 غالبا ما تعزز تكوين طبقة ثنائية مستمرة.
3. بعد الحضانة، اشطف العينة باستخدام ماصة لإزالة المحلول. ثم أضف 50 ميكرولتر من المخزن الطازج إلى الطبقة الثنائية. ثم كرر العملية 10 مرات إجمالا.
   ملاحظة: من الضروري ألا تلمس طرف الماصة طبقة الدهون الثنائية وأن يبقى محلول للحفاظ على رطوبة الطبقة الثنائية. عند رفع الطرف إلى قمة القطرة، سترى أنها تلامس. يمكنك إزالة المحلول دون إتلاف الطبقة الثنائية عن طريق الحفاظ على تلامس ضئيل مع سطح القطرة. في النهاية، ستنقلب القطرة وتمتد نحو الحشية؛ هذه هي اللحظة المثالية لإيقاف إزالة المحلول. يجب أن يتغير الضوء المنعكس في هذه النقطة ويمكن أن يكون إشارة للتوقف. إذا كنت قلقا من إزالة كمية زائدة من المحلول، خفض إعداد الماصة أثناء الغسيل لتترك مساحة مريحة من العزل فوق طبقة الدهون الثنائية.
   يمكن تقييم سلامة تكوين الطبقة الثنائية الدهنية في هذه الظروف مسبقا باستخدام استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي (FRAP). يتطلب ذلك وجود مكون في خليط الدهون يحمل علامات فلورية 6,7,24,25.
4. بعد الانتهاء من الغسيل النهائي، أزل المخزن مرة أخرى وأضف 50 ميكرولتر من البروتين المطلوب في المنظف عند تركيزه الحرج أو أقل. اترك ساعة واحدة على الأقل لدمج البروتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: سيقوم المغسل بتليين طبقة الثنائية بلطف ويساعد البروتين على الاندماج في الغشاء. في هذا البروتوكول، كان المنظف المستخدم 50 ميكرومولار n-Dodecyl-beta-D-thiomaltoside (DOTM)، وهو منظف غير أيوني، وتركيز البروتين 2nM.
5. بعد ساعة، اشطف العينة بمحلول مؤقت لإزالة أي بروتين أو مصارف غير مدمجة.
6. أضف 5 ملغ من حبيبات البوليسترين الجيدة (بيو-بيردز) إلى العينة، واتركها لمدة ساعة على الأقل قبل الإزالة. ثم تكون العينة جاهزة للتصوير (انظر أدناه).

5. مضاف مضاد للتصبغ

1. قم بإذابة 5 ملغ من ترولوكس و80 ملغ من D-جلوكوز في 10 مل من المحلول المؤقت (انظر أعلاه). اهتز ودوامة حتى لا يبقى أي مواد صلبة. قم بالتفريغ طوال الليل في الظلام، ثم قم بتصفية المحلول عبر فلتر 0.22 ميكرومتر. حضر طازجا أسبوعيا.
2. قم بإذابة 6.5 ملغ من جلوكوز أوكسيداز (1650 وحدة حركة) و8 ميكرولتر من الكاتالاز (29,200 ميكرولتر في المخزن العازل) في 92 ميكرولتر من المخزن المؤقت (الحافظ). اخلط المحلول بلطف دون دوامة، ثم استخدم الطرد المركزي وانقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد. خزن عند 4 درجات مئوية واحم من الضوء.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في الثلاجة لعدة أشهر؛ ومع ذلك، إذا ظهر أي تعكر، تخلص منه وحضر محلولا جديدا.
3. اخلط 99 ميكرولتر من المحلول من 5.1 مع 1 ميكرولتر من الخطوة 5.2 في أنبوب جديد. بعد الشطف النهائي للعينة، أضف محلول مكافحة التلاشي فوق العينة (يسمى محلول التصوير).
   ملاحظة: يمكن لمحاليل المضادة للتزيف أن تغير وظائف البروتينات العابرة للغشاء؛ من المهم التحقق من التوافق مع النظام.

6. إعداد وإعدادات المجهر

ملاحظة: تم استخدام مجهر TIRF مخصص لهذه الدراسة ذات الجزيئات الواحدة. يصف هذا القسم المكونات الرئيسية وتقنيات المحاذاة الرئيسية لميكروسكوب فلوري أساسي مناسب للتصوير السريع بالزمن الزمني (الشكل 4)، وهو أداة موثوقة.

1. استخدم ليزر He:Ne بقطر 633 نانومتر لتحفيز العينات. يمر الليزر عبر مرشح تمرير نطاق ولوحة موجة بحجم ربع لصقل خط الليزر وتحويل الإثارة من الضوء المستقطب خطيا إلى الضوء المستقطب دائريا.
   ملاحظة: يقلل الاستقطاب الدائري من تأثير اتجاه المجس.
2. يمر الشعاع عبر عدسة 300 مم ومرشح خط ليزر بقطر 633 نانومتر، وينعكس من مرآة ثنائية اللون طويلة التمرير بطول 633 نانومتر، ويركز على ظهر هدف مجهر زيتي بقوة 100x و1.45 نيتو-أمتر. قم بمحاذاة العارضة لضمان مرورها بسلاسة عبر مركز الهدف وبقاؤها مستقيمة عند الخروج من الهدف.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، تم إعداد المجهر للتألق فوق الفلوري (إبينيفر). يمكن إضافة كمية صغيرة من الحليب المجفف إلى كوفيت ذو قاع شفاف. ثم يوضع الكوفيت على هدف المجهر مع قطرة من زيت الغمر بينهما. هذا يسمح لك بملاحظة أن الشعاع يمر مباشرة عبر الهدف.
3. يمر الانبعاث من البروتينات الموسومة بالفلورية عبر المرآة الموضوعية ثنائية اللون، ومرشح المرور الطويل، وعدسة 300 مم، ثم يتم تصويره على كاميرا EMCCD. استخدم عدسات أنبوبية ذات طول بؤري أطول لتكبير الصور على الكاميرا وتعزيز دقة تحديد المواقع الفائقة، وهو أمر مفيد للبروتينات العابرة للغشاء البطيء الحركة والتجميعات. تأكد من معايرة بكسل الكاميرا إلى نانومتر.
   ملاحظة: ومع ذلك، يتم تحقيق تكبير 1x باستخدام عدسة الأنبوب التي يحددها مصنع الهدف، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تركيز الفلورة على عدد أقل من البكسلات. تشمل الأطوال البؤرية الشائعة عدسات 200 مم، 180 مم، 165 مم، و164.5 مم. نوصي باستخدام هدف تكبير من سلاح الجو الأمريكي لعام 1951. باستخدام عدسة 300 مم في هذا الإعداد، تم قياس معايرة بكسل 74 نانومتر بتكبير إجمالي قدره 170x.
4. تحكم في درجة حرارة العينة باستخدام طوق موضوعي وحامل عينات مزود بسخان ومبرد بيلتيير²⁶.
   ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة مستقرة أمر بالغ الأهمية لضمان الاستقرار الحراري للمجهر وتمكين القياسات الدقيقة المعتمدة على درجة الحرارة وتركيز الأجهزة.
5. تحرك مشغلات بيزو العينة في اتجاهات XYZ. بمجرد أن تكون العينة في بؤرة التركيز، ضبط الشعاع على حافة هدف المجهر (انظر الشكل 4) باستخدام المرحلة المثبتة على المرآة النهائية الدورانية حتى يتم الوصول إلى زاوية حرجة. هذا يولد حقل إثارة زائل. المجهر الآن مثبت في TIRF.
   ملاحظة: يمكنك تحديد أن المجهر يكون في TIRF عندما يكون الانعكاس الخلفي من الليزر خطا (وليس بقعة)، وأن الخلفية من العينة تنخفض في شدتها وتمتد.

7. جمع البيانات

ملاحظة: يجب إعداد الكاميرا لجمع البيانات بسرعة.

1. اضبط سرعة إزاحة البكسل الرأسي إلى حوالي 600 نانوثانية ورفع سرعة جهد الساعة العمودي (عادة +4). ثم قم بضبط قراءة البكسل الأفقية على أقصى إعداد لها (30 ميجاهرتز عند 16-بت في هذا المثال). اضبط كسب المضخم المسبق إلى 2 وقم بضبط خرج المضخم لضرب الإلكترون. وأخيرا، اضبط كسب مضاعف الإلكترون إلى أعلى مستوى له.
2. اضبط التعريض إلى 25 مللي ثانية. عند تعريض 25 مللي ثانية، تأكد من أن معدل الإطارات أطول قليلا (25.802 مللي ثانية على الكاميرا المستخدمة هنا).
3. اضبط قوة الليزر بحيث تكون الإشارة واضحة فوق الخلفية.
   ملاحظة: ضبط قوة الليزر قد يكون تحديا. إذا كان مرتفعا جدا، فالمجس يبيض بسرعة كبيرة؛ إذا كانت منخفضة جدا، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء تجعل التتبع صعبا. نوصي بضبط القدرة بحيث تتجاوز الإشارة الخلفية بمقدار 3-5 أضعاف للجسيمات ذات الإشارة الأضعف. يشرح القسم الثاني سبب وجود السطوع الجزيئي توزيعا.
4. اجمع بيانات كافية لتوفير ما لا يقل عن 1000 مسار لكل عينة.

8. تحليل التتبع

ملاحظة: في مختبراتنا، يتم إجراء تحليل تتبع الجسيمات المفردة عادة باستخدام سكريبتات مخصصة في مختبر ماتلاب بناء على أعمال كروكر وغرير وتعديلها المؤلفون ^3,26,27. فيما يلي وصف باستخدام برنامج ImageJ، وهو برنامج متاح مجانا لمجتمع البحث. كلتا الطريقتين تعطيان نتائج متطابقة.

1. قم بقص مجموعات البيانات بحجم ثابت ثم تصحيح الخلفية باستخدام ImageJ.
   ملاحظة: إذا كانت البيانات المجمعة متساوية بين المجموعات، فلا حاجة للقص. عادة ما يتم ذلك فقط إذا كانت المنطقة المعنية قد تحركت على حساس الكاميرا بين مجموعات البيانات. يمكن توسيع قدرات ImageJ بشكل كبير باستخدام الإضافات. أحد الخيارات هو تثبيت واستخدام FIJI، وهو ImageJ مرفق مع مجموعة من الإضافات القياسية. من بين هذه الإضافات TrackMate، التي ستستخدم للبروتوكول هنا^28,29.
   موقع ImageJ Wiki يقدم إرشادات وأمثلة للعديد من الإضافات. كما يتضمن دروس فيديو.
2. داخل FIJI، قم بسحب وإفلات الفيلم أو ملف *.tif المكدس ليتم تحليله (انظر الملف التكميلي 2).
3. هنا تأتي تفاصيل معايرة البكسلات. في تبويب التحليل ، اختر تعيين المقياس وطبق معايرة البكسل إلى المسافة على الجهاز.
4. احتفظ بنسخة منه لمتابعة أي تغييرات عن الأصل.
5. اطرح الخلفية من النافذة المختارة وطبقها على النسخة المحفوظة من البيانات الأصلية. في تبويب العملية ، اختر طرح الخلفية.
   ملاحظة: سيتم تحسين ذلك بناء على البيانات. نقطة بداية جيدة هي استخدام "كرة متدحرجة" أكبر من الجسيمات التي يتم تصويرها.
6. في تبويب الإضافات ، اختر التتبع | TrackMate. يفتح هذا نافذة حوار TrackMate التي توجه المستخدم خلال عملية التتبع.
   ملاحظة: بمجرد اكتمال التتبع، يصبح من الممكن تصدير المسارات لمزيد من التحليل خارج ImageJ.

9. معالجة البيانات

ملاحظة: نناقش هنا كيفية معالجة البيانات الممثلة وكيفية حساب توزيعات حجم الخطوات والحصول على ثابت انتشار متوسط.

1. سحب وإفلات مكدس الصور إلى FIJI؛ ثم قم بتطبيق المعايرة (74 نانومتر/بكسل).
2. اطرح الخلفية باستخدام طرح الكرة المتدحرجة بعرض 5 بكسل. قم بقص الحقل إلى أربعة أقسام منفصلة بحجم 11 ميكرومتر × 11 ميكرومتر وتحليلها بشكل منفصل.
   ملاحظة: هذا لتقليل أي تباين في العتبة بسبب حقل الإثارة عند تتبع بروتينات الغشاء.
3. ابدأ إضافة TrackMate . تحقق من أن المعايرة مطبقة على البكسلات (انظر الملف التكميلي 3) وأن الوقت يغطي النطاق المطلوب.
   1. في TrackMate، اختر لابلاسيان من غاوسي (LoG) كطريقة للكشف عن الجسيمات، بقطر تقديري 350 نانومتر باستخدام مرشح الوسيط قبل العملية. انقر على زر المعاينة للتحقق من أن الجسيمات المكتشفة معقولة.
      ملاحظة: قد تكون بعض الجسيمات واضحة في الخلفية؛ لا تقلق بشأن هذه الأمور - سيتم إزالتها في الخطوة التالية.
   2. عندما تتأكد من إعدادات العد، أعالج بقية التكديس تليها العتبة. استخدم تحديد العتبة التلقائي أو اسحب مربع الاختيار لضبط العتبة.
   3. بعد اختيار كيفية تصور الجسيمات المكتشفة، اختر طريقة التتبع: Advanced Kalman Tracker لهذه المجموعة من البيانات، مع الإعدادات التالية: 350 نانومتر لأنصاف البحث وأقصى فجوة إطارات 2 إطار.
      ملاحظة: من الممكن أيضا إضافة عقوبات، وتقسيم المسارات، ودمج المسارات. بالنسبة لهذه المجموعة، تم إجراء التتبع فقط.
   4. قرر كيف تصفية وتصور المسارات.
      ملاحظة: في هذه المجموعة من البيانات، يتم عرض البقع المكتشفة فقط (انظر الملف التكميلي 4).
   5. بعد معالجة المسارات الفردية، يتم تصدير بيانات التتبع كملف XML لاستخدامها في برنامج تحرير جداول البيانات (انظر الملف الإضافي 5).

Results

كما هو موضح في القسم 2 من البروتوكول، تم تصنيف الليسينات باستخدام إسترات NHS مرتبطة بجزيء صبغة فلورية (NHS-Dye). بعد اقتران البروتين، قس DOL باستخدام مطياف UV-Vis. في هذه التجربة، كان DOL لرباعيات AQP4 4.12. بعد ذلك، حدد احتمال أن يحتوي كل رباعي AQP4 على جزيء صبغة واحد على الأقل باستخدام توزيع بواسون الموضح أدناه.

(2)

حيث P هو احتمال أن يتم تصنيف كل AQP4، باستخدام المعادلة 2، فإن احتمال أن يكون لكل رباعي AQP4 علامة فلورية مرفقة عليه هو 98٪. توزيع الملصقات لكل رباعي موضح في الشكل 2 ويعكس توزيع السطوع الذي لوحظ في العينة.

كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي تم تحقيقها في هذه البيانات النموذجية 8-9 أضعاف فوق الخلفية لفلوروفور واحد وأكثر من 15-20 للجسيمات الأكثر سطوعا. يأتي هذا التباين من الموقع في شعاع الإثارة وملف DOL الموصوف في الخطوة الثانية من البروتوكول.

داخل ملف XML المولد، الأعمدة المعنية هي J وK وL وM، والتي تتوافق مع معرف رقم الجسيم، والإطار الذي تم اكتشاف الجسيم فيه، وموقع X للجسيم، وموقع Y للجسيم على التوالي (انظر الملف التكميلي 6). في الورقة الثانية من الملف، يتم حساب توزيع حجم الخطوة ومتوسط معامل الانتشار، حيث تمثل أحجام الخطوات المسافات التي يتحرك فيها الجسيم بين الإطارات، ويعطى متوسط الانتشار بالمعادلة 3:

(3)

حيث D_ave هو متوسط معامل الانتشار، وΔt هو معدل الإطارات. تفترض هذه المعادلة حركة براونية، والتي تكون صالحة عموما للإزاحات الصغيرة ويمكن تأكيدها بتحليل متوسط تربيع الإزاحة مقابل علامة الزمن من عينة من المسارات الفردية ^3,30,31.

يظهر مخطط حجم الخطوات توزيع الجسيمات المنتشرة، ويمكن عزو ذلك إلى نقاط OAP بأحجام مختلفة (الشكل 5).

الشكل 1: جهاز تجفيف الدهون. يتكون الجهاز من قارورة دائرية قاع بسعة 10 مل مع موصل تقطير فراغي. يدخل النيتروجين بضغط منخفض عبر فلتر حقنة بحجم 0.2 ميكرومتر مع إبرة متصلة بغطاء تخليق أصفر، متصل بموصل تقطير فراغي. يتم تحرير الضغط عبر أنبوب تايجون المتصل بحقنة بإبرة مقطوعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: التوزيع المتوقع لعلامات الفلورسنت على كل وحدة AQP4 باستخدام المعادلة 2. العدد الأكثر احتمالا للفلوروفورات هو 4، و98٪ من جميع الفلوروفورات سيكون عليها ملصق فلوري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تجميع حامل العينة. يتكون التجميع من أنبوب عدسة SM1 بحجم 1 بوصة مع إزالة خيوط الذكور وتم إشرافها لمنع التداخل مع هدف المجهر. تشمل غطاء كوارتز وحشية بارافيلم. يتم تأمين التجميع بالكامل بحلقة تثبيت SM1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: المجهر. على الجانب الأيمن يوجد مخطط مبسط للمجهر؛ الخط الأخضر يظهر ضوء الإثارة القادم من الليزر. بدءا من اليمين، يمر ضوء الليزر عبر لوحة موجية بحجم ربع اللون، ثم يتم تركيزه بعدسة 300 مم. ينعكس الضوء بواسطة مرآة ثنائية اللون طويلة على الهدف، حيث يركز على الفتحة الخلفية. باستخدام مرآة التحويل لنقل شعاع الإثارة، يتم وضع الشعاع عند حافة فتحة الهدف، مما يخلق حقلا متلاشيا في العينة. يتم جمع الضوء المنبعث في البؤرة بواسطة الهدف ويمثله الخط الأحمر. يمر الضوء المنبعث بعد ذلك عبر المرشح ثنائي اللون، ثم فلتر تمرير طويل، ويتم تركيزه بواسطة عدسة 300 مم على الكاميرا، مما يوفر تكبيرا بصريا بمقدار 1.7x (تكبير إجمالي 170x من عدسة الهدف والأنبوب). على الجانب الأيسر، توجد صورة للمجهر. لاحظ أن هناك مرايا إضافية تدور تستخدم لوضع الليزر بشكل صحيح. في الوقت نفسه، يتم ترتيب ذراع الكشف لتعظيم جمع الفوتونات من البروتينات العابرة للغشاء الموسوم بالفلورية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: مخطط حجم الخطوات. الخط الأزرق ذو الدوائر الحمراء هو مخطط مدرج لجميع أحجام الخطوات. الخط الأسود مناسب لمعاملات انتشار متعددة. توزيع احتمالية حجم الخطوة يعطى ب: حيث f_i هو العدد السكري لكل نوع من الجسيمات المنتشرة، بافتراض أن كل منها يخضع لحركة براونية. يظهر مخطط التكرار والتوافق توزيعا غير متجانس لجسيمات أبطأ وأسرع حركة، وينسب إلى توزيع لأحجام متعددة من OAP. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: حاسبة جداول بيانات تستخدم لتحديد تركيبات المولي، وكميات الدهون الكلية، ومكونات الفلورسنت/FRAP الاختيارية لتحضير سيارات الدفع الرباعي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 2: مكدس صور ميكروسكوب فلورية أحادية جزيء خام باستخدام تقنية التايم لابس المستخدمة في تتبع المسار (ملف المصدر لدرس TrackMate). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: معاينة متحركة لبيانات الفلورة الخام لجزيء واحد تظهر الشدة والخلفية قبل المعالجة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 4: تحريك مسارات الجسيمات المصفاة (بعد العتبة) الذي يظهر مسارات AQP4 الممثلة عبر الزمن. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 5: تراكب متحرك يظهر تتبع جزيئات AQP4 بكامل المجال باستخدام مخرجات TrackMate. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: جدول بيانات يوضح إحداثيات المسار المستخرجة وتوزيعات حجم الخطوات المحسوبة المستخدمة في تحليل الانتشار. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

في هذا المقال، نقدم طريقة تتبع الجسيمات الفردية لمراقبة بروتينات الغشاء الفردية مباشرة أثناء تحركها عبر غشاء ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بالصلب وتفاعلها مع بعضها البعض. تم اختيار AQP4 كمثال تمثيلي بسبب قدرته على تشكيل تجمعات ذاتية ديناميكية منظمة بواسطة أشكالها المختلفة ^32,33,34. أعلاه، نحدد طريقة موثوقة لتحضير العينة ومعلمات رئيسية لتتبع البروتينات أحادية الغشاء على مقاييس زمنية ملي-ثانية. تشمل الخطوات: (1) تجهيز سيارات الدفع الرباعي، (2) تحديد المستوى المناسب من الوسم الفلوري، (3) تحضير دعامات صلبة، (4) إنشاء عينات بروتينية عابرة للغشاء داخل طبقة دهنية ثنائية مدعومة بصلب، (5) تحضير عوامل مكافحة التظاهر، (6) بناء مجهر جزيء واحد بسيط، (7) جمع بيانات تتبع جزيء واحد، و(8) تحليل بيانات التتبع باستخدام ImageJ.

الطريقة الموصوفة خطوة بخطوة واضحة من الناحية المفاهيمية؛ ومع ذلك، لكل خطوة حرجة مزالقها وقيودها الخاصة. من بين هذه الموارد، يعد تحضير العينات هو الأكثر تحديا (الخطوات من 1 إلى 5). لذلك، يجب وضع عدة تفاصيل في الاعتبار. الأول هو كيفية إنشاء طبقة ثنائية الدهن مدعومة صلبة. هناك ثلاث طرق رئيسية: (1) لانغموير-بلودجيت (LB)، (2) دمج وتمزق سيارات الدفع الرباعي، و(3) الطلاء الدوراني^{35، 36، 37، 38، 39}. لكل طريقة مزايا وعيوب. على سبيل المثال، توفر طريقة لانغموير-بلودجيت تحكما أكبر في خصائص وتركيب الطبقات الثنائية، بما في ذلك التراكيب غير المتماثلة بين الورقة، وتسمح بتكوين الطبقات المتعددة بطريقة مضبوطة. ومع ذلك، فإن استخدام حوض LB يتطلب تقنيا الكثير من الوقت، ويستغرق وقتا طويلا، ومكلفا للحصول على³⁵. الطلاء الدوراني هو تقنية بسيطة نسبيا لإنشاء طبقات ثنائية الدهون؛ ومع ذلك، يميل إلى إنتاج طبقات متعددة ويتطلب فائضا كبيرا من المواد، وغالبا ما يكون ذلك بكمية غير عملية³⁹. اندماج الحويصلات وانفصالها هما عمليتان بسيطتان لا يتجهان إلا إلى كمية صغيرة من المادة. ومع ذلك، فإن إنشاء سطح محب للماء أمر بالغ الأهمية، وبعض تركيبات الدهون تشكل طبقات ثنائية عبر اندماج الحويصلات بسهولة أكبر من غيرها (على سبيل المثال، في مختبرنا، وجدنا أن الحويصلات ذات الشحنة السالبة الصافية تشكل طبقتين من خلال اندماج الحويصلات فقط مع إضافة كاتيونات ثنائية التساوي وأوقات حضانة ممتدة^). بالإضافة إلى إنشاء سطح محب للماء (الخطوة 3)، تشمل الاعتبارات المهمة الأخرى عند تشكيل طبقة ثنائية مدعومة بالصلب عبر اندماج الحويصلات غسل الطبقة الثنائية المكونة حديثا قبل وبعد دمج بروتين الغشاء. يقوم غسل ما قبل الإدخال بإزالة الفائض من المركبات الرياضية متعددة الاستخدامات والحويصلات متعددة الصفائح الأكبر (MLVs)، بينما يقوم الغسول النهائي بعد إدخال الغشاء بإزالة البروتين غير المدمج. يمكن أن يؤدي الغسيل غير الكاف إلى إدخال إشارات خلفية أثناء دراسات التتبع.

قمنا بفحص العديد من المنظفات لتحديد ما إذا كانت مناسبة لإدخال البروتين عبر الغشاء في طبقات الدهون الثنائية المدعومة بالصلبة، بما في ذلك C12E9 وTween-20 وTritonX-100 والعديد غيرها. المنظف المفضل لدينا هو DOTM لأنه سهل الإزالة والأكثر لطفا على الغشاء (أقل احتمالا لإزعاج سلامة الغشاء). كمية البروتين المضافة أمر بالغ الأهمية. إذا كان الأمر كثيرا، سيكون من المستحيل ملاحظة مسارات فردية. عند تكييف هذا الإجراء مع بروتينات عابرة للغشاء الأخرى، يجب تعديل الكمية من خلال التجربة والخطأ. ومع ذلك، فإن الكميات المعطاة في هذا الإجراء تعتبر نقطة انطلاق ممتازة. يجب الحفاظ على كمية المغسلة عند أو أقل من التركيز الحرج للميسيلار؛ وإلا، سيتم ذوبان الطبقة الثنائية وإزالتها من ركيزة الكوارتز.

يجب تحسين إدخال بروتينات الغشاء في الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة لكل مجموعة من الظروف التجريبية. ومع ذلك، هناك بعض الطرق الشائعة لتحقيق ذلك، بما في ذلك استخدام البروتيوليبوزومات والدمج المباشر لبروتينات الغشاء في طبقة ثنائية التكوين^{مسبقا 41}. البروتيوليبوسوم هو ليبوسوم مثل SUV، يحتوي على بروتين مدمج فيه. يمكن أن تندمج هذه البروتينات مع طبقة دهنية ثنائية مدعومة بالصلب أو تدمج في نفس الوقت مع المركبات الثنائية خلال تكوين الطبقة^{الثنائية 42}. يسبب الاندماج تمزقا، مما يطلق البروتين في الغشاء. من السهل تنفيذه، لكنه يؤدي إلى توجيه عشوائي لبروتينات الغشاء. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تفاعلات قوية مع الدعم الصلب، مما يؤدي إلى خصائص انتشار مختلفة حسب اتجاه البروتين³. يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم الدمج المباشر، مما يعطي تفضيلا توجيهيا ل AQP4 وبروتينات الغشائية الأخرى ذات المجالات المحبة للماء الكبيرة على جانب واحد من البروتين 2,5,43,44.

الملاحظة المباشرة أداة قوية تستخدم في الاكتشافات العلمية. يعد التصوير الديناميكي للجزيء الواحد مهما بشكل خاص في الفيزياء الحيوية للغشاء والبروتينات، حيث يستخدم مراقبة حركة وتفاعلات البروتينات الفردية لاختبار فرضيات أو توليد فرضيات جديدة تصف بشكل أفضل كيف يتصرف البروتين. البروتوكول والطرق الموضحة هنا مثالية للطبقات الدهنية ثنائية الأبعاد المدعومة بالصلب، لكنها يمكن توسيعها إلى بيئات أكثر تعقيدا تحتوي على عدة مكونات²، خلايا حية^{34، 45، 46، 47}، وثلاثة أبعاد⁴⁸. يفتح تتبع الجزيئات الفردية الباب للعديد من التجارب الأخرى، بما في ذلك تتبع جزيء واحد بلونين⁴⁹، ونظام FRET ^50,51 ذو جزيء واحد، والتصوير الديناميكي فائق الدقة مثل المجهر البصري العشوائي (STORM) وتصوير التراكم النقطي للتضاريس النانوية على المستوى (PAINT). من خلال توسيع الجهاز ليشمل التحكم في درجة الحرارة، يمكن أيضا استكشاف الخصائص الديناميكية الحرارية لبروتينات الغشاء 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 لوحة الموجة	ثورلابز	WPQ05M-633	تأكد من مطابقة الليزر
هدف نفطي 100X	أوليمبوس	12-563-659	1.45 N/A أبوكروماتيك
16:0-18:1 PC	أفانتي بولار ليبيدات	850457	فوسفوليبيدات POPC
18:0 PEG2000 التربية البدنية	أفانتي بولار ليبيدات	880210	ملح الأمونيوم
عدسة 300مم	ثورلابز	AC254-300-A-ML
ليزر He:Ne على طول 633 نانومتر	ميلي غريو	05-LHP-927	يمكن تغييرها إلى مصادر أخرى، وإلى أطوال موجية أخرى
مرشح تمرير النطاق 633 نانومتر	كروما تك	633/10X	تطابق مع الليزر المستخدم
فلتر تمرير طويل 655 نانومتر	كروما تك	ET655lp	قم بالتغيير لتطابق الأطوال الموجية للصبغة/الليزر
أندور سوليس الأول	أندور	أندور سوليس الأول	برامج التقاط الصور
ATTO 655	ATTO-TEC	655 ميلادي	تعديل NHS-Ester، أي صبغة تحتوي على تعديل مناسب للعمل على جزيء واحد يمكن استخدامها. يوصى ب ATTO لكن يمكن استخدام Cy5/7
راتنج SM-2 من بيو-بيدز	بيوراد	1523922
كلوريد الكالسيوم	ميليبور سيغما	C4901
الكاتالاز	سيغما-ألدرتش	C3155-50MG	من كبد البقر، المذاب المائي، وما إلى ذلك؛ 30000 وحدة/ملغ
الكلوروفورم	فيشر ساينتفيك	C547-1	HPLC أو الدرجة الطيفية
الكوليسترول	سيغما-ألدرتش	C8667-500MG
الغطاء المغلق	إسكو أوبتيكس	R525000	كوارتز 25 مم
مقسم الشعاع ثنائي الكروك	سيمروك	FF545/650-Di01-25x36	قم بالتغيير لتطابق الأطوال الموجية للصبغة/الليزر
كاميرا EMCCD	أندور	iXon Ultra 888
أنابيب فالكون 15 ملم	غرينر بيو-ون	188261	أنابيب زراعة خلايا سيلستار
إزاز الجلوكوز أوكسيداز	سيغما-ألدرتش	G2133-50KU	من Aspergillus niger، Typer VII، وما إلى ذلك؛ 100000 وحدة/جم صلب (بدون أكسجين مضاف)
مسدس الحرارة	هاربر فريت	56434	يستخدم في تسخين البارافيلم، وعادة ما يمكن استخدام أي مسدس حراري
هيبس	كواشف فيشر الحيوية	BP310-500
زيت الغمر الذاتي منخفض التألق الذاتي	ثورلابز	MOIL-30
الميثونال	فيشر ساينتفيك	A452-1	HPLC أو الدرجة الطيفية
أنبوب الطرد المركزي الدقيق	VMR	525-1126	1.5 مللمتر
ميكرو بايبتر	إبندورف		متنوعة؛ 1000 وميكرو؛ L، 100 وميكرو؛ L و 10 وميكرو؛ L مقترحون
&أوسلاش؛ أنابيب عدسة 1.5 بوصة	ثورلابز	SM1.5L10	يتم حلق الخيط الخارجي لتحضير العينة
الجدول البصري	نيوبورت	RPR Reliance	يعتمد حجم التابل على المساحة المتاحة
الأنسجة البصرية	ثورلابز	MC-50E	تنظيف المكونات المختلفة
بارافيلم	ميليبور سيغما	P7669	تحقق من عدم وجود غازات فلورية أثناء العملية
محرك بيزو	نيوبورت	PZA12
عوازل الاهتزاز الهوائية	نيوبورت	سلسلة I-2000	يستخدم لتثبيت الجدول البصري لأي عدم تساوي
حمام مبرد	فيشر ساينتفيك	إيزوتمب 3016
وحدة تحكم الغالق	ثورلابز	SC10	مرتبط ببرنامج التصوير
كلوريد الصوديوم	ميليبور سيغما	S988
فلتر ستيريتوب	ميليبور سيغما	S2GPT05RE
برنامج تشغيل ووحدة تحكم صندوق المفاتيح	نيوبورت	PZC200	وحدة تحكم المرحلة
فلتر الحقنة	ج. ت. بيكر	SF01-98	PES 25مم 0.2 وميكرو؛ M
عنصر TEC	ثورلابز	TEC3-2.5	استخدم لتوصيل مضخة الحرارة في بيلتيرر بحامل العينة وطوق الهدف
متحكم في درجة الحرارة	ميرستيتر للهندسة	TEC-1091
كاشف درجة الحرارة	ثورلابز	TH100PT
ثيرميستور	ثورلابز	TH10K
جهاز قياس الأنابيب-أو-دالايزر	جي بيوساينسز	786-611	4K MWCO
منظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية	نوفاسكان	PSDP_UV	سلسلة برو - رقمي
زوم أوبتيكس	ثورلابز	SM1NR1