مقالة منهجية

نمذجة مرض الميتوكوندريا باستخدام عضيات الدماغ: التركيز على اعتلال عضلة الدماغ في الميتوكوندريا ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية

DOI:

10.3791/69303

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل عضيات الدماغ كنموذج قيم لاعتلال عضلة الدماغ في الميتوكوندريا ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) ، مما يوفر رؤى حول الفيزيولوجيا المرضية الأساسية وتوفير منصة لفحص الأدوية. تظهر العضيات المشتقة من خطوط الخلايا بمستويات متفاوتة من التغاير في الجينات المسببة للأمراض اختلافات ظاهرية كبيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال عضلة الدماغ في الميتوكوندريا ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) هي اضطرابات في الميتوكوندريا تحدث بشكل شائع بسبب متغير m.3243A>G في الميتوكوندريا tRNALeu. للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية ل MELAS ، قمنا بتوليد عضيات دماغية من خطوط متعددة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من مريض مصاب ب MELAS يحمل متغير m.3243A>G. تشترك هذه الخطوط في خلفية وراثية نووية متطابقة ولكنها تختلف في مستويات التغاير التي تتضمن متغير m.3243A>G. لاحظنا اختلافات كبيرة في حجم العضوية ، والتشكل ، وكفاءة الحث العصبي ، والتي ترتبط بدرجة التغاير العصبي. تم نقل الخلايا العصبية المنفصلة من العضيات إلى نظام ثقافة ثنائي الأبعاد ، وهو مناسب ومناسب لفحص الأدوية عالية الإنتاجية. أظهرت العضيات أيضا اختلافات كبيرة في تكوين الشبكات العصبية ، اعتمادا على مستويات التغاير اللازم. تشير نتائجنا إلى أن النماذج العضوية المستندة إلى iPSC المشتقة من المريض تمثل منصة مفيدة لدراسة آليات MELAS وفحص الأدوية. يقدم هذا الفيديو طرقا شاملة وسهلة الاستخدام ، بما في ذلك بروتوكولات توليد العضيات وتقييم الأنماط الظاهرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال عضلي الميتوكوندريا ، واعتلال الدماغ ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) هي أمراض الميتوكوندريا التي تتميز بخلل وظيفي عصبي ونوبات شبيهة بالسكتة الدماغية وأعراض جهازية مختلفة. السبب الأكثر شيوعا هو متغير m.3243A>G في جين الليوسين tRNA للميتوكوندريا ، MT-TL11. يعتقد أن هذا البديل يضعف تعديل التورين في مضاد الكودون ، وبالتالي يقلل من كفاءة ترجمة الليوسين ويساهم في خلل الميتوكوندريا في MELAS2،3،4. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن تحسينات في الأعراض بعد تناول جرعة عالية من التورين5،6. ومع ذلك ، فإن وجود غير المستجيبين يشير إلى أن الآليات الفيزيولوجية المرضية الإضافية ، التي لم يتم تحديدها حتى الآن ، قد تساهم في الإصابة بالمرض لدى الأفراد الذين يؤوون متغير m.3243A>G.

لتوضيح آليات المرض التي تسببها المتغيرات الجينية ، من المثالي استخدام نماذج تجريبية تكون فيها جميع المتغيرات متطابقة باستثناء المتغير المسبب ، مما يتيح مقارنات دقيقة للنمط الظاهري. غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا المعدلة بالجينوم والنماذج الحيوانية ذات المتغيرات المصححة كعناصر تحكم لاضطرابات الجينات النووية. ومع ذلك ، لا يزال إصلاح متغيرات mtDNA يمثل تحديا تقنيا ، حتى مع تقنيات تحرير الجينوم المتقدمة7. لذلك ، لا يزال إنشاء نماذج تجريبية ذات خلفيات نووية متطابقة أمرا صعبا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدمنا خطين للخلايا الجذعية المستحثة (iPSC) مشتقة من نفس المريض المصاب ب MELAS والتي تختلف فقط في مستويات الحمض النووي غير المتجانسة (أي نسبة الحمض النووي للميتوكوندريا التي تحمل MT-TL1 m.3243A>G المتغير8) ، وولدت عضيات الدماغ كنموذج مرضي. على الرغم من أن مستويات التبديم غير المتجانسة يمكن أن تتقلب أثناء مرور الخلايا أو تمايزها ، مما قد يؤثر على الأنماط الظاهرية ويسبب تباين دفعة إلى دفعة في النتائج التجريبية ، إلا أن الخلايا المشتقة من المريض التي تحمل متغيرات جينات الميتوكوندريا تظل ذات قيمة للتحقيق في التسبب في المرض.

في هذه الدراسة, ولدنا عضيات الدماغ من iPSCs مشتقة من مريض مع MELAS والتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لفهم آليات المرض بشكل أفضل. باستخدام خطين iPSC مع مستويات عالية ومنخفضة heteroplasmy, لاحظنا اختلافات كبيرة في كفاءة الحث العصبي, التي ترتبط بدرجة heteroplasmy. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن عضيات الدماغ المستندة إلى iPSC المشتقة من المريض توفر منصة قيمة لتوضيح الآليات الكامنة وراء MELAS ولتسهيل فحص الأدوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطي iPSC (2-6 و 2-8) مشتقة من نفس الخلايا الليفية لمريض MELAS باستخدام طرق راسخة8. تختلف فقط في مستوياتها غير المتجانسة. تم استخدام خط 414C2 iPSC الذي تم إنشاؤه من فرد سليم كعنصر تحكم. اتبع البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة إرشادات لجنة الأخلاقيات في كلية الطب بجامعة كيتاساتو (#G22-02).

1. ثقافة الخلية

  1. إذابة مخزون الخلايا المجمدة
    1. تحضير ألواح 6 آبار عن طريق الطلاء باللامينين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بتسخين وسط الاستزراع للحصول على مثبطات iPSCs الخالية من المغذيات التي تحتوي على مثبط ROCK 10 ميكرومتر إلى 37 درجة مئوية.
    3. استرجع قارورة iPSC المجمدة من النيتروجين السائل (LqN2) خزان وإذابة الجليد بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    4. انقل المعلق المذاب إلى 10 مل من الوسط المسخن مسبقا. جهاز طرد مركزي على حرارة 120 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
    5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق النقر على الأنبوب. أضف خلايا الوسط والبذور الطازجة إلى أطباق 6 آبار مغطاة مسبقا باللامينين. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. تغيير متوسط
    1. استبدل الوسيط (بدون مثبط ROCK) كل 1-2 أيام.

2. توليد العضيات الدماغية

  1. بدء التمايز (اليوم 0)
    1. إزالة الوسط من iPSC (~ 70-80٪ متجمعة) لوحات الاستزراع. اغسل الخلايا باستخدام PBS.
    2. يضاف محلول الإنزيم ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. أضف وسيطا لإيقاف رد الفعل. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 190 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
    4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط التمايز الذي يحتوي على 30 ميكرومتر مثبط ROCK ، و 5 ميكرومتر SB431542 و 2.5 ميكرومتر IWP-2.
      ملاحظة: الوسيط الأساسي هو نفسه المستخدم في الخطوة 1.1.2.
    5. عد الخلايا. البذور 3 × 103 خلايا في 100 ميكرولتر لكل بئر في ألواح على شكل حرف U ، 96 بئرا ، منخفضة التعلق. احتضان لمدة 6 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. تغيير متوسط (اليوم 6)
    1. انقل العضيات (من الخطوة 2.1.5) من طبق 96 بئرا إلى طبق 10 سم باستخدام ماصة عريضة التجويف. أضف 50 ميكرولتر من الوسط (DMEM / F12 مع 1٪ N2 ، 1٪ بديل الجلوتامين 1٪ NEAA ، 2.5 ميكرومتر IWP-2 ، 5 ميكروغرام / مل كبريتات الهيباران ، و 1٪ PS) إلى كل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا.
      ملاحظة: استخدم ماصات عريضة التجويف طوال التجارب عند نقل العضيات لتجنب تعطيل بنيتها ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، تعد الماصات ذات 8 قنوات مفيدة لإجراء التجارب بسرعة ودقة.
    2. اجمع العضيات في أنابيب 2 مل. قم بإزالة الوسط بعناية حتى لا تستنشق العضيات وأضف 1.5 مل من DMEM / F12. كرر 3 مرات لغسل الأعضيات.
    3. قم بإزالة الوسط وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى الأنابيب ذات العضويات. انقل جميع العضيات إلى طبق 10 سم ، ثم أضف 5 مل من الوسط لتسهيل التقاط كل عضوية.
    4. التقط عضويا واحدا باستخدام ماصة دقيقة معدلة إلى 50 ميكرولتر وانقله إلى بئر واحد من صفيحة 96 بئرا. كرر حتى يتم نقل جميع العضيات إلى صفيحة 96 بئرا (الحجم النهائي 100 ميكرولتر). احتضان لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. تغيير متوسط (اليوم 9)
    1. (اختياري) انقل العضيات إلى طبق 10 سم عند استخدام ماصات ذات 8 قنوات. تخطي الخطوة 2.3.1 عند استخدام الماصات الدقيقة أحادية القناة وانتقل إلى الخطوة 2.3.2.
    2. اجمع العضيات في أنابيب 2 مل. اغسل 3 مرات باستخدام DMEM / F12 كخطوة 2.2.2.
    3. إعادة التعليق في وسط التمايز (1: 1 DMEM / F12 والعصبية القاعدية) يحتوي على 1٪ N2 ، 2٪ B27 بدون فيتامين أ ، 100 ميكرومتر 2-ميركابتوإيثانول (ME) ، 2.5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 1٪ بديل الجلوتامين ، 0.5٪ NEAA ، و 1٪ مستخلص غشاء قاعدي.
      ملاحظة: قم بإعداد كميات صغيرة من مستخلص الغشاء القاعدي للاستخدام الفردي وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة. قم بإذابة المستخلص عند 4 درجات مئوية دون السماح له بتجاوز 8 درجات مئوية ، ثم اخلطه في وسط بارد وقم بتسخين الوسط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
    4. انقل ~ 10 عضيات لكل بئر إلى طبق مكون من 6 آبار. اضبط الحجم النهائي للوسط لمدة 1 بئر إلى 2 مل. استزراع بشكل ثابت لمدة 6 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  4. تغيير متوسط (اليوم 15)
    1. اجمع العضيات في أنابيب سعة 15 مل. اترك الأنبوب دون إزعاج حتى تستقر جميع العضيات. قم بإزالة المادة الطافية وأضف وسط التمايز الطازج (مثل الخطوة 2.3.3 ولكن مع فيتامين ب 27 + أ).
      ملاحظة: عادة ، تستقر العضيات في الجزء السفلي من الأنبوب دون طرد مركزي. ومع ذلك ، قد لا تغرق العضيات الصغيرة المستمدة من iPSCs للمريض بكفاءة. في هذه الحالة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 120 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع المواد العضية.
    2. انقل ~ 10 عضيات لكل بئر إلى طبق مكون من 6 آبار. الاستزراع بشكل ثابت لمدة 15 يوما عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    3. استبدل الوسط كل 5-7 أيام حتى اليوم 30.

3. تفكك العضيات الدماغية للثقافة ثنائية الأبعاد (اليوم 30)

  1. ألواح الطلاء ببولي L-ornithine (PO)
    1. قم بإعداد محلول مخزون PO عن طريق إذابة 10 مجم من PO في 66.7 مل من H2O وعمل حصص صغيرة للاستخدام الفردي. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. قم بتخفيف محلول مخزون PO 1: 5 باستخدام H2O وقم بتغطية ألواح الثقافة بالمحلول المخفف. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  2. طلاء اللامينين
    1. قم بإزالة PO واغسل الآبار 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
    2. أضف اللامينين (1: 1,000 في PBS) واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أو طوال الليل.
      ملاحظة: محلول مخزون اللامينين هو 1 مجم / مل. قم بإعداد الحصص الصغيرة وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة.
  3. التفكك إلى خلايا عصبية مفردة
    1. قم بإذابة محلول التفكك عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الاستخدام.
    2. انقل العضيات إلى أنبوب سعة 15 مل واترك الأنبوب دون إزعاج حتى تستقر جميع العضيات. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 5 مل من PBS لشطف الأعضيات.
    3. بعد إزالة PBS ، أضف 1 مل من محلول الإنزيم والماصة برفق 1-2x. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ ماصة عدة مرات. إذا لزم الأمر ، احتضن لمدة 2-3 دقائق إضافية. ماصة مرة أخرى لإكمال التفكك.
    4. جهاز طرد مركزي على حرارة 200 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الطافق ، وأضف 1 مل من محلول التشتت ، والماصة.
    5. محلول عزل الطبقة تحتها وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. أضف 1 مل من الوسط العصبي (عصبي قاعدي مع 1٪ B27 ، 0.25٪ بديل الجلوتامين ، 1٪ PS) واخلط. مرر التعليق عبر مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
    7. عد الخلايا. خلايا البذور عند 1 × 105 خلايا / سم2 على ألواح PO / laminin. استبدل الوسط كل 4-7 أيام حتى اليوم 60.

4. حصاد الخلايا والمواد العضوية للتحليل الخلوي والجزيئي

  1. التثبيت العضوي للتألق المناعي (اليوم 30)
    1. حصاد العضيات (الخطوة 2.4.3) في أنابيب دقيقة.
    2. قم بإزالة الوسط بعناية حتى لا تستنشق العضيات ، وأضف 1 مل من PBS لشطف العضيات.
    3. قم بإزالة PBS بعناية حتى لا تستنشق الأعضيات ، وأضف 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لتثبيتها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. يغسل 3 مرات مع PBS.
    5. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. مجموعة عضوية ل RT-qPCR (اليوم 30)
    1. نقل العضيات (الخطوة 2.4.3) إلى أنابيب دقيقة. يغسل باستخدام PBS كما هو موضح في الخطوة 4.1.2.
    2. أضف محلول التحلل والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل (LqN2). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. تثبيت الخلية للتألق المناعي (اليوم 60)
    1. قم بإزالة وسط الاستزراع وأضف PBS لغسل الخلايا.
    2. ثبت 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة PFA وأضف PBS لغسل الخلايا. كرر هذه الخطوة 3x.
    4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

5. RT-qPCR

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من العضيات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة.
  2. قم بتصنيع (كدنا) من 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي المحضر في الخطوة 5.1 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة بحجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
  3. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام البادئات التالية: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTTGAT. قم بإعداد التركيز النهائي لكل تفاعل على النحو التالي: 1x مزيج رئيسي فلوري ، 0.25 ميكرومتر برايمر أمامي ، 0.25 ميكرومتر برايمر عكسي. إجمالي حجم التفاعل هو 15 ميكرولتر ، بما في ذلك 0.2 ميكرولتر من (كدنا) من الخطوة 5.2. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  4. قم بتطبيع تعبير FOXG1 إلى ACTB كعنصر تحكم داخلي.

6. تلطيخ التألق المناعي

  1. احتضان العضيات (اليوم 30) في 10٪ سكروز لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، ثم 30٪ سكروز لمدة ≥3 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بتركيب العضيات في وسط التضمين وقم بإعداد القطع بالتبريد (10 ميكرومتر) باستخدام التبريد. قم بتخزين الأقسام على أكواب منزلقة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. قم بإزالة وسط التضمين بواسطة غسول PBS (2 × 5 دقائق).
  4. يتخلل 0.3٪ PBST لمدة 10 دقائق. يغسل مع PBS.
  5. قم بحظر مصل الماعز العادي بنسبة 10٪ في 0.1٪ PBST لمدة ساعة واحدة. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية: مضاد FOXG1 (1: 200) ، مضاد TUBB3 (1: 500-1: 1،000). يغسل 3 مرات مع PBS.
  6. احتضان بجسم مضاد ثانوي (1: 500) + Hoechst 33258 (1: 500) لمدة 1 ساعة. يغسل 3 مرات مع PBS.
  7. جبل ومراقبة تحت مجهر متحد البؤر.

7. تحليل التغاير

  1. حصاد iPSCs باستخدام كاشطات الخلايا ونقلها إلى الأنابيب الدقيقة. أضف 0.5 مل من PBS وجهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وانتقل إلى الخطوة 7.2.
  2. استخراج الحمض النووي الكلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة.
  3. قم بإعداد التركيز النهائي لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): 1x مزيج رئيسي فلوري ، 0.25 ميكرومتر برايمر أمامي ، 0.25 ميكرومتر برايمر عكسي. حجم التفاعل الكلي هو 15 ميكرولتر ، بما في ذلك 50 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي من الخطوة 7.2. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تسلسلات التمهيدي هي كما يلي: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagtt ؛ MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaagtt ؛ FBXO15_ إلى الأمام: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ العكس : aatgcacggctagggtcaaaa.
  4. استخدم قيم دورة العتبة لحساب رقم نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا (متحور مقابل النوع البري).
  5. تطبيع إلى رقم نسخة الجين النووي FBXO15 .

8. تقييم حجم وشكل العضوية

  1. التقط صورا للعضويات باستخدام المجهر بتنسيق TIFF.
  2. قياس الحجم والدائرية باستخدام برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. افتح ملفات TIFF المحفوظة في الخطوة 8.1 بالنقر فوق ملف | افتح الملف وحدده. اختر التحديدات اليدوية وتتبع العضوية. ثم انقر فوق تحليل | قياس. استخدمت قيم المساحة والدائرية في النتائج للتحليل في الخطوة 3.8.
  3. تحليل البيانات عن طريق إجراء اختبار t لتقييم ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة بخطوط التحكم باستخدام البرامج الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بإنشاء عضيات دماغية وأجرينا ثقافات عصبية ثنائية الأبعاد باستخدام بروتوكول بسيط نسبيا مع تعديلات طفيفة بناء على Nakamura et al.9 (الشكل 1). في البروتوكول السابق ، تم استخدام ألواح 96 بئرا على شكل حرف V ، بينما في هذه الدراسة ، استخدمنا صفائح منخفضة التعلق على شكل حرف U مكونة من 96 بئرا للسماح للخلايا بالتجمع بشكل طبيعي في وسط كل بئر. باستخدام خط iPSC للتحكم الصحي 414C2 ، نجحنا في إحداث عضيات الدماغ التي تحتوي على خلايا عصبية إيجاب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل العضيات المستحثة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) / iPSCs نماذج مرضية واعدة للأمراض المستعصية النادرة ، في حين أن توليد عضيات الدماغ يتطلب عادة فترات ثقافة ممتدة تستمر لعدة أشهر10 واستخدام معدات باهظة الثمن ، مثل حاوية هندسية تحرك وسط الثقافة باستمرار وتحافظ على ظروف مستقرة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد على المدى الطويل. في هذه الدراسة ، أنشأنا عضيات الدماغ في إطار زمني قصير باستخدام معدات زراعة الخلايا القياسية. باستخدام iPSCs المستمدة من مريض مصاب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على 414C2 iPSCs من RIKEN BRC. تم تقديم الدعم التمويلي من قبل JSPS KAKENHI (24H00648 إلى MF ، 23K08971 إلى CS) وبرنامج AMED Translational Research Network (25yf0126001j002 إلى MF). تم دعم هذا العمل من خلال زمالة من خدمة التبادل الأكاديمي الألمانية (DAAD) إلى F.B.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق زراعة الخلايا بحجم 10 سمكورنينغ353003
سطح تثبيت منخفض جدا للوحة 6 آباركورنينغ3471
70 & mu; مصفاة خلية Mكورنينغ352350
أكوتازناكلاي تيسك12679-54الإنزيمات المستخدمة لتفكيك iPSCs
مكمل فيتامين B27ثيرموفيشر العلمي17504001
مكمل فيتامين B27 ناقص فيتامين أثيرموفيشر العلمي12587010
β-ميركابتوإيثانول (2-ME)سيغماM3148تخلص منها وفقا لقواعد المؤسسة.
بئر زراعة الخلايا 6 متعدد الألواحكورنينغ353046
نصيحة حفظ الخلايابي إم بيو إيكوBMT-200Wرأس الماصة واسع السبطانة
كاشطات الخلاياشركة سوميتومو باكليتيكو المحدودة.MS-93100
المجهر الكونفوكالزايسLSM710
كريوستاتلايكاCM3050
كالتشر ماوس لامينين 1R& D3400-010-02تستخدم لتغطية الألواح لزراعة الخلايا العصبية المفكككة ثنائية الأبعاد
DMEM/F12شركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال042-30795
وسط تثبيت الفلورةداكوS302380-2وسيط التركيب
الجسم المضاد FOXG1أبكامab196868
غلوتامكسثيرموفيشر العلمي35050061
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفئران IgG (H+L) عالي الامتصاص المقاطع، أليكسا فلور بلس 488ثيرموفيشر العلميA32723
جسم مضاد ثانوي عالي الامتصاص من نوع Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)، أليكسا فلور بلس 555ثيرموفيشر العلميA32732
كبريتات هيباران (HS)سيغماH7640
مجموعة RNA إلى cDNA عالية السعةثيرموفيشر العلمي4387406يستخدم لتخليق cDNA من الحمض النووي الريبي
هوشت 33258ثيرموفيشر العلميH3569
ImageJالإصدار 1.52aيستخدم لقياس حجم ودائرية العضويات
حرير iMatrix-511شركة تاكارا بيو إنك.892021طلاء الألواح لزراعة iPSC
الأنسولينشركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال  090-06481
IWP2توكريس للعلوم الحيوية3533
كينس BZ-X810كينسBZ-X810يستخدم لالتقاط الصور للشكل 3A
LSM710كارل زايس AGالمجهر الكونفوكالي
LSM980كارل زايس AGالمجهر الكونفوكالي
LUNA يونيفرسال qPCR Master Mixمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM3003
ماتريجيلكورنينغ354277
ملحق N2ثيرموفيشر العلمي17502001
الوسط العصبي القاعديثيرموفيشر العلمي21103049
حل تفكك الخلايا العصبية شركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال291-78001
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)ناكلاي تيسك06344-56
مصل الماعز العاديشركة جاكسون إيمينوريسيرش؛005000121
نونكلون سفيرا 96-بئر، صفيحة دقيقة معالجة بنفعة الننكلون، ذات قاع على شكل حرف Uثيرموفيشر العلمي174929
بارافورمالديهايد (PFA)ناكلاي تيسك09154-85تخلص منها وفقا لقواعد المؤسسة.
PBSناكلاي تيسك14249-24
PBSناكلاي تيسك27575-31
البنسلين/الستريبتوميسين (PS)ناكلاي تيسك26253-84
بولي-إل-أورنيثين (PO)سيغماP3655
بولي أوكسي إيثيلين(10) أوكتيل فينيل إيثر (تريتون)شركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال168-11805
PRISM جراف بادالإصدار 9.5.0
مجموعة QIAamp DNA مصغرة كياغين51304يستخدم لاستخراج الحمض النووي الكلي
مجموعة RNeasy الصغيرةكياغين74104يستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي
SB-431542شركة كايمان للكيماويات13031
نظارات الانزلاقماتسوناميCRE-05
ستيم فيت AK02Nشركة تاكارا بيو إنك.AK02Nالوسط المستخدم لثقافة iPSCs غير المميزة ومن اليوم 0 إلى اليوم 6
سكروزشركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال196-00015
مركب O.C.T. من Tissue-Tekشركة ساكورا فينتيك اليابانية المحدودة.4583وسيط الحفظ بالتجميد
الأجسام المضادة TUBB3بروميغاG712A
Y27632شركة فوجي فيلم واكو بيور كيرميكال030-24021مثبط الصخور
زينكارل زايس AG2.3SP1 (النسخة السوداء)برنامج لتحليل الصور الملتقطة   باستخدام المجهر الكونفوكالي (LSM710)
زينكارل زايس AG2.6 (النسخة الزرقاء)برنامج لتحليل الصور الملتقطة   باستخدام المجهر الكونفوكلي (LSM980)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MELAS RT qPCR

مقالات ذات صلة