مقالة منهجية

تعزيز امتصاص فيروس الغدة المؤتلف في الأمعاء باستخدام تركيبة الطب الصيني التقليدي

130 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70413

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج كيس الأمعاء المنفتح لتقييم التفاعلات بين الطب الصيني التقليدي (TCM) والفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (rAAV) أثناء الامتصاص المعوي، مما يوفر منصة خارج الجسم الحي لتحسين استراتيجيات توصيل الجينات الفموية.

الملخص

يحمل توصيل فيروس الالتهاب المرتبط باللحمية المؤتلاف (rAAV) إمكانات علاجية كبيرة لكنه محدود بسبب امتصاص الأمعاء غير الفعال. يعد الطب الصيني التقليدي (TCM)، المستخدم على نطاق واسع في التركيبات الفموية، مصدرا واعدا لتعزيز الامتصاص. ومع ذلك، لا تزال تأثيراته المحتملة على امتصاص rAAV وتحويله غير مستكشفة إلى حد كبير. يوفر نموذج كيس الأمعاء المنتفخ منصة كمية خارج الجسم للتحقيق في هذه التفاعلات. يقدم هنا بروتوكول مفصل يستخدم نموذج كيس الأمعاء المنتفخ لتقييم انتقال الفيروس المرتبط بالعدوى (rAAV) عبر ظهارة الأمعاء ونقل الجينات اللاحق داخل نسيج الأمعاء تحت ظروف تجريبية مضبوطة. تشمل الخطوات الرئيسية جمع شرائح الأمعاء الصغيرة من القوارض المختبرية، ونقل الأجزاء لتشكيل أكياس، وملء كل كيس بمخزن مؤكسج. تغمر الأكياس المنبعثة في مخزن مؤكسج يحتوي على جزيئات rAAV وتحضن عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعرض الضوئي ونقل الناقلات. تشمل تحليلات النهاية أخذ عينات من السائل الداخلي (المصل) لقياس جسيمات rAAV التي عبرت الظهارة، بالإضافة إلى تحليل نسيج الكيس للتعبير عن الجينات المنقولة لتحديد كفاءة التحويل. من خلال اختبار عدة مناطق معوية، يوفر البروتوكول رؤى حول الفروق الخاصة بكل قطاع في امتصاص rAAV. علاوة على ذلك، يتيح تضمين GZNG، وهي صيغة كلاسيكية للطب الصيني الصيني، أثناء الحضانة تقييم تأثيره على امتصاص الناقلات والنقل. يوفر نهج كيس الأمعاء المنتفخ منصة قيمة لفحص أنماط مصل rAAV، ومعزات التوصيل، والتفاعلات بين ناقلات rAAV ومكونات الطب الصيني التقليدي. تصميمه البسيط والقابل للتوازي يتيح أيضا الفحص عالي الإنتاجية في الدراسات قبل السريرية.

المقدمة

يمثل فيروس الحقن الوريدي المؤتفي (rAAV) منصة واعدة للعلاج الجيني الجهازي، مع ثلاثة طرق رئيسية قيد الاستكشاف حاليا: الحقن الوريدي1، الحقن داخل الصفاق2، والإعطاء الفموي3. بينما تم دراسة مسارات الحقن الوريدية وداخل الصفاق بشكل موسع، لا تزال طريقة الإعطاء الفموية، وهي نهج غير جراحي، غير مستكشفة نسبيا. تم إثبات جدوى توصيل rAAV الفموي لأول مرة بواسطة شين وآخرون 4، الذين أبلغوا عن نقل ناجح للمخاط المعوي وتحفيز استجابة مناعية مضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بعد إعطاء rAAV2 عن طريق الفم. وبالمثل، أظهر هارا وآخرون 3,5 أن rAAV/Aβ الفموي يمكنه تحويل الغشاء المخاطي في الجهاز الهضمي وتقليل ترسيب الأميلويد في الدماغ، بينما وجد ستيل وآخرون أن التطعيم الفموي أظهر بقاء أفضل ومناعة مضادة للأورام مقارنة بالحقن العضلي. وأشارت نفس الدراسة إلى أن rAAV6 أظهر توازنا معويا أقوى من rAAV5. بعيدا عن تطبيقات اللقاحات، تم تحقيق إمكانات علاجية في نماذج مرضية أخرى. أثبت ما وآخرون 7 وهاو وآخرون أن rAAV الفموي أدى إلى كبت الأورام والعلاج المضاد للتليف في الكبد والمعدة على التوالي بعد النقل الهضمي. حدد هوانغ وآخرون النمط المصلي المعدل Rec2 على أنه ينقل الأنسجة الدهنية البنية بشكل انتقائي بعد الإعطاء الفموي، على عكس التروبيزم الكبدي السائد الذي لوحظ مع التوصيل الوريدي10. على الرغم من هذه النتائج الرائدة، لا تزال الأبحاث حول توصيل rAAV الفموي محدودة، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص أنظمة الفحص الصناعي للتقييم واسع النطاق.

نموذج الكيس المعوي المنتفخ، الذي طوره ويلسون ووايزمان في 1954-11، لا يزال منصة قيمة في المختبر لدراسة آليات امتصاص الأدوية في الأمعاء. على عكس أجهزة محاكاة الامتصاص الأخرى، يأخذ هذا النظام في الاعتبار بشكل فريد عمليات فسيولوجية متعددة تتجاوز الانتشار السلبي البسيط12. تجعله هذه الخاصية مفيدا بشكل خاص لدراسة الطب الصينيالتقليدي 13. باستخدام هذا النظام، تم توثيق أن مركبات الطب الصيني التقليدي غالبا ما تظهر أنماط امتصاص معوية تعتمد على المقاطع عبر الجهاز الهضمي. على سبيل المثال، أظهرت إحدى الدراسات أن عدة قلويدات من ووي تشينغتشو سان تمتص بشكل انتقائي في شرائح معوية مختلفة، حيث يظهر الججونوم واللفائفي أكثر امتصاصا نشطا14. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يعدل الإعطاء المشترك لمكونات الطب الصيني الامتصاص في الأمعاء. أفاد لياو وآخرون أن الإعطاء المشترك مع مستخلص Radix Angelicae dahuricae عزز بشكل كبير امتصاص الأمعاء للبويراين، مما يبرز تأثير تفاعلات الطب الصيني التقليدي على امتصاص المقطع. لذلك، يعد نموذج الكيس الأمعاء المنتفخ أداة مثالية لتوضيح سلوكيات الامتصاص المعقدة والتفاعلات التآزرية الكامنة في تركيبات الطب الصيني الصيني وغيره من الأدوية.

يتطلب اختيار نموذج مناسب لأبحاث امتصاص rAAV فهما دقيقا للمفاضلات بين الدقة الفسيولوجية، والتعقيد التقني، وسرعة الإنتاجية. يلخص الجدول أدناه النماذج التجريبية الأساسية المستخدمة لدراسة امتصاص الأمعاء.

توفر هذه الدراسة دليلا على أن نموذج الكيس الأمعائي المنتفخ يمكن استخدامه لدراسة امتصاص الفيروس المرتبط بالعدوى المعاد تركيبه (rAAV) في الأمعاء. توفر رؤى قيمة حول كيفية تأثير الإعطاء المشترك للطب الصيني التقليدي على امتصاص ناقلات rAAV في الأمعاء، مما يؤكد الحاجة إلى مزيد من التوصيف لتفاعلاتها الميكانيكية في الظروف الفسيولوجية ذات الصلة. قد يساعد تحسين استراتيجيات التوصيل الفموي المعززة بالطب الصيني الصيني من خلال هذا النهج تطوير علاجات غير جراحية لفيروس RAVA، مما يحسن من امتثال المرضى وسهولة الوصول إلى العلاج.

يجب على الباحثين تقييم نموذج الكيس الأمعائي المنتفخ بناء على المعايير التالية لضمان توافقه مع أهدافهم التجريبية. تشمل التطبيقات المناسبة الفحص السريع للأنماط المصلية، وتقييم المنشطات/المعززات، والحركية الإقليمية، بينما تشمل التطبيقات والقيود غير المناسبة دراسات التعبير طويلة الأمد (>48 ساعة) وعلم الأدوية الجهازي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا لمعايير دقيقة وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات الحيوانات في الجامعة الطبية البحرية (الموافقة CHEC (A.E)-2025011).

1. تحضير محلول تايرود والمحاليل الفيروسية

  1. تكييف محلول تايرود المسبق:
    1. جهز اثنين من أليكوتات 500 مل من محلول تايرود (pH 7.4) (انظر جدول المواد).
    2. يبرد أحدهما إلى 4 درجات مئوية والآخر إلى 37 درجة مئوية.
    3. قم بفقاعة كل أليكوت بنسبة 95٪ O₂/5٪ CO₂.
  2. تحضير المحلول الفيروسي:
    1. أضف المادة المؤتليفة AAV9-CMV-EGFP إلى محلول تايرود بدرجة 37 درجة مئوية لتحقيق تركيز نهائي 1 × 1011 vg/mL (حالة التحكم).
    2. للحالة التجريبية، يمكن إضافة تحضير AAV9-CMV-EGFP بتركيبة طب الطب الصيني الصيني GZNG (الجدول 2) المذابة في المركبة إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ملغ/مل.
    3. بالنسبة للتحكم باستخدام GZNG فقط، أضف GZNG (200 ملغ/مل) إلى محلول تايرود بدون AAV9 CMV-EGFP.
      ملاحظة: جهز مخففات فيروسية مباشرة قبل الاستخدام للحفاظ على العدوى. درجة الحموضة لمحلول GZNG تقريبا بين 5.0–6.0.

2. تحضير الحيوانات وجمع الأنسجة المعوية

  1. الصيام: صوم جرذان سبراج-داولي البالغة من العمر 8 أسابيع لمدة 24 ساعة قبل الجراحة. تأكد من الوصول المجاني للماء خلال هذه الفترة للحفاظ على الترطيب.
    ملاحظة: الصيام يساعد في تقليل محتوى الأمعاء ويضمن القياس الدقيق لامتصاص الأمعاء أثناء تجارب خارج الجسم الحي .
  2. تحقق من صحة الحيوان قبل الصيام وتأكد من حالته الجيدة. استبعد الحيوانات التي تظهر عليها علامات ضيق أو مرض من الدراسة.
  3. أعط صوديوم بنتوباربيتال (200 ملغ/كجم، داخل الصفاق) لتحفيز تخدير عميق. تحقق من أن الحيوان مخدر بالكامل عن طريق فحص نقص ردود الفعل والتنفس المنتظم.
    تحذير: البنتوباربيتال مادة خاضعة للرقابة خطيرة؛ يمسكها بالقفازات ومعدات الحماية الشخصية في غطاء بخاري لتجنب ملامسة الجلد أو الاستنشاق واتباع إرشادات المؤسسات للتخلص الآمن والاستجابة للطوارئ.
  4. قم بتنفيذ القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم بعد تأكيد التخدير العميق.
  5. مسح منطقة البطن والصدر بنسبة 75٪ إيثانول لتعقيم الجلد وتقليل التلوث الميكروبي أثناء الجراحة.
  6. قم بعمل شق منتصف على طول منطقة البطن باستخدام مقص جراحي معقم لكشف التجويف الصفاقي.
  7. افصل المعدة والأمعاء بلطف وافتحها. استخدم ستائر معقمة لحماية الأنسجة والأعضاء المحيطة أثناء الإجراء.
  8. اقطع المصرة البوابية بعناية لفصل المعدة عن الاثني عشر القريب. تأكد من بقاء الاثني عشر سليما للإجراءات التالية.
  9. قم بتشريح القولون البعيد عند نقطة التقاء المستقيم مع الشرج مع تجنب أي ضرر للأنسجة المحيطة.
  10. حرر الوصلات المساريقية من الأمعاء الدقيقة بلطف باستخدام ملقط أو مقص دقيق. كن حذرا من عدم تمديد أو تمزيق المساريق.
  11. انقل الأمعاء الدقيقة السليمة فورا إلى محلول بارد كالثلج من محلول كربس-رينجر المؤكسج (محلول تايرود، 4 درجات مئوية).

3. تحضير كيس الأمعاء المنتفخ خارج الجسم الحي .

  1. اختر مقاطع الأمعاء كما يلي: تم تعيين جزء بطول 8 سم يقع على بعد 10 سم من البواب كقطعة اثني عشر.
  2. اجمع قطعة من الجونز بطول 8 سم تبدأ من 16 سم بعيدا عن الجزء الاثني عشر.
  3. احصل على قطعة لباقية بطول 8 سم تبدأ بمسافة 16 سم أخرى بعيدا عن الجزء الهوني.
  4. بالنسبة للقولون، اجمع قطعة بطول 8 سم تقع على بعد 5 سم قريبة من الطرف الأعمى العضوي.
    ملاحظة: تأكد من أن النسيج مرن وسليم، ومناسب للانقلاب أثناء التحضير.
  5. اغسل التجويف الأمعائي باستخدام حقنة سعة 2 مل مملوءة بمحلول تايرود البارد والأكسجين المثلج.
  6. التخلص من الصرف الصحي وفقا لبروتوكولات النفايات البيولوجية المؤسسية للحفاظ على التعقيم ومنع التلوث.
    تحذير: التعامل مع النفايات البيولوجية باستخدام القفازات والمعدات الوقائية المناسبة لتجنب التعرض للمواد التي قد تكون معدية. تخلص من جميع النفايات البيولوجية والمخلفات وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية لمنع التلوث البيئي.
  7. أدخل الطرف القريب من الجزء الأمعائي على قضيب زجاجي مصقول بقطر 4 مم. تأكد من أن سطح القضيب أملس لمنع تمزق المخاط.
  8. اربط الطرف البعيد من المقطع بخياطة حريرية 2-0 لتثبيت النسيج على القضيب. تأكد من أن النسيج يبقى مستقرا أثناء الانعكاس.
  9. قم بتحريك الجزء الأمعي بلطف عن طريق تحريك النسيج على طول القضيب حتى يصبح الغشاء المخاطي مكشوفا بالكامل. تجنب التمدد أو الالتواء المفرط للحفاظ على سلامة الأنسجة.
  10. قم بحقن 2 مل من محلول تايرود البارد في التجويف للتحقق من وجود تسرب. يجب أن يكون التسرب المقبول <5٪ خلال دقيقة واحدة. إذا تم اكتشاف تسرب، قم بضبط الغرز وتحقق من انقلاب كامل لسطح الغشاء المخاطي.
    ملاحظة: قم بإجراء الانقلاب في بيئة باردة لتقليل التحلل الإنزيمي والحفاظ على قدرة الأنسجة.
  11. أدخل شعيرات زجاجية بطول 5 سم بطول 3 مم في الطرف المفتوح من الجزء المخرج ليكون مدخل للتروية. ادفع القنية بلطف لتجنب تمزقات المخاط.
  12. ثبت القنية باستخدام غرز حريرية 2-0. تأكد من بقاء القنية ثابتة في مكانها دون انهيار أو عرقلة تدفق السائل.
  13. طبق شدة لطيفة على الغرز للحفاظ على الشكل الصحيح لكوس الأمعاء. تجنب الانحناء أو التواء، لأن ذلك قد يعطل التروية ويغير نتائج الامتصاص.
  14. تجنب الشد المفرط، لأن ذلك قد يتلف الأنسجة أو يشوه الكيس. حافظ على توتر منتظم طوال فترة التجربة. افحص كيس الأمعاء المنفتح بانتظام بحثا عن تسرب أو تلف هيكلي. إذا تجاوز التسرب 5٪، قم بإصلاح أو استبدال الجزء قبل الاستمرار.

4. تحويل واحتضان AAV

  1. ضع كل كيس مخرج في أنبوب مخروطي بحجم 7 مل يحتوي على 4 مل من محلول تايرود المؤكسج بدرجة حرارة 37 °م.
  2. إضافة محلول فيروسي كما يلي: التحكم: AAV9-CMV-EGFP فقط؛ تجريبي: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. الحضانة ثابتا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين،وخلالها يتم ضخ خليط غازي بنسبة 95٪ أوستيجين2/5٪ ثاني أكسيد الكربون بشكل مستمر في المحلول.

5. أخذ العينات، معالجة النهاية، والتحليل

  1. أخذ عينات زمنية بمسار
    1. سحب 50 ميكرولتر من سائل السيروسال من كل كيس أمعاء عند 0، 30، 60، 90، و120 دقيقة باستخدام حقنة دقيقة معايرة. تأكد من أخذ عينات دقيقة دون إدخال فقاعات هواء.
    2. استبدل السائل المسحوب فورا بمحلول تايرود المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بسعة 50 ميكرولتر للحفاظ على التوازن الأسموزي والحجم الداخلي. تقليل الوقت بين السحب والاستبدال للحفاظ على ظروف تجريبية متسقة.
      ملاحظة: عند استخدام الحقنة الصغيرة (مثل حقنة هاميلتون)، حافظ على العقم وتعامل معه بلطف لمنع تلف غشاء كيس الأمعاء.
    3. قم بأخذ العينات بسرعة في كل نقطة زمنية لتقليل اضطراب بيئة الحضانة.
  2. تحديد عيار الفيروس
    1. استخلاص الحمض النووي الكلي من سائل السيروسال باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الحيواني الجينومية المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بإجراء قياس مطلق لرقم نسخة الجينوم المتجه rAAV بواسطة qPCR. استخدم مجموعة SYBR Green Kit مع بادئات ITR. نفذ تضخيم qPCR في صفيحة قياسية بسعة 96 بئر باستخدام جهاز تدوير حراري مع شروط الدورة التالية: إزالة الطبيعة الأولية: 95°C لمدة 10 دقائق؛ إزالة الطبيعة (التبشير): 95°C لمدة 15 ثانية؛ التلدين والتمديد: 60°C لمدة دقيقة واحدة؛ 40 دورة إجمالا
    3. لقياس عدد نسخ الجينوم، أنشئ منحنى قياسي باستخدام تخفيفات متسلسلة من البلازميد rAAV-CMVp-gfp (1 نانوغرام، 0.1 نانوغرام، و0.01 نانوغرام). استخدم هذه التخفيفات لحساب عدد نسخ الجينوم الفيروسي بناء على قيم عتبة الدورة (Ct) المقابلة لها.
    4. تحديد عدد نسخ الجينوم الناقل في السائل المصلي المجمع باستخدام المنحنى القياسي. تم الإبلاغ عن النتائج كنسخ جينوم لكل 100 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد والمعدات معقمة لمنع التلوث أثناء استخراج الحمض النووي وتحليل qPCR. استخدم ضوابط مناسبة للتحقق من دقة qPCR، بما في ذلك ضوابط عدم القوالب (NTC) ومعايير البلازميد.
    5. قم بإجراء qPCR في ثلاث نسخ لكل عينة لضمان قابلية تكرار وموثوقية النتائج.
  3. معالجة الأنسجة النهائية
    1. استنشق كل السائل الضوئي المتبقي من كل كيس معوي باستخدام ماصة معقمة. أمسك بلطف لتجنب تمزق الأنسجة.
    2. اشطف كل كيس ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1٪ من البنسلين–ستربتوميسين (P/S) لإزالة الوسط والبكتيريا والشوائب المتبقية. تأكد من الغسل الشامل للحفاظ على التعقيم للتطبيقات اللاحقة.
    3. اقطع نسيج الأمعاء إلى شظايا بحجم 2 مم3 (2 مم * 2 مم * 0.5 مم) باستخدام مقص جراحي معقم أو شفرات. حافظ على حجم الشظايا بشكل موحد لتكون حضانة متسقة.
    4. حضن شظايا الأنسجة في 10 مل من DMEM مع 10٪ FBS و1٪ (v/v) P/S عند 37 °م لمدة 48 ساعة في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. يجب تجديد وسط الزراعة كل 12 ساعة أثناء الحضانة.
      ملاحظة: تحافظ هذه الخطوة على بقاء الأنسجة وتسمح بتعافي الخلايا بعد التجربة. تأكد من بقاء الغشاء المخاطي سليما أثناء القطع والغسيل. قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل كاملة بنظام PBS للقضاء على الحطام والملوثات الميكروبية. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) ورطوبة عالية لدعم النشاط الأيضي وصحة الأنسجة.
      تحذير: تعامل مع شظايا الأنسجة باستخدام أدوات معقمة وتجنب الإجهاد الميكانيكي للحفاظ على سلامة الظهارة.
  4. تحليلات ما بعد الحضانة
    1. أليكوت أ (تحليل نسيجولوجي):
      1. تثبيت عينات الأنسجة في بارافورمالديهيد 4٪ (PFA) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية للحفاظ على البنية الخلوية.
      2. بعد التثبيت، قم بدمج الأنسجة في مركب OCT وإجراء تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لتقييم سلامة الأنسجة وشكلها.
        تحذير: بارافورمالديهايد هو مثبت خطير؛ تعامل معه داخل غطاء أبخرة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة
    2. Aliquot B (تحليل الفلورة وقياس الجينوم):
      1. قم بتجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة الإضافية.
      2. استخدم العينات المجمدة في المجهر الفلوري للكشف عن تعبير EGFP، وتقييم كفاءة النقل أو امتصاص الفيروس.
      3. قم باستخراج الحمض النووي متبوعا ب qPCR لتحديد عدد نسخ الجينوم الفيروسي أو التعبير عن الجينات المعدلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدم هذا البروتوكول لتقييم كفاءة توصيل الجينات التي يعبر عنها AAV9 عبر أجزاء مختلفة من الأمعاء الدقيقة، بالإضافة إلى تأثير علاج GZNG على تعزيز نقل وتعبير الجينات. لوحظت عدة نتائج رئيسية، مما أظهر نجاح تطبيق البروتوكول وبعض التغيرات التي قد تنشأ تحت ظروف معينة.

أظهر تقييم التعبير المعماري المبكر من نوع EGFP الذي بوساطة AAV9 من خلال تحليل الأنسجة (تلوين H&E) والتحليل الفلوري (EGFP) عبر الأمعاء الدقيقة (الاثني عشر، الجيجونوم، اللفائفي، والقولون) عن انتقال ناجح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم إنشاء نهج جديد في المختبر لتقييم امتصاص rAAV في الأمعاء من خلال تكييس الأمعاء المنتفخ الكلاسيكي. تسمح هذه الطريقة بتحليل كفاءة نقل AAV عبر الأمعاء الدقيقة تحت ظروف مضبوطة حسب القطاع، وتقييم التأثيرات التآزرية بين الطب الصيني الصيني وrAAV. هنا، تناقش الخطوات الحرجة، واستكشاف الأخطاء والتعديلات، والقيود، وتطبيقاتها الواسعة في العلاج الجيني وتوصيل الأدوية.

خطوات تقنية حرجة
يتطلب تنفيذ نموذج الكيس الأمعاء المنحرف لدر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في شكر جميع الزملاء والمتعاونين الذين قدموا مناقشات قيمة ومساعدة فنية طوال هذه الدراسة. كما نقدر الدعم المؤسسي الذي جعل هذا العمل ممكنا. تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منحة #82474349 من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (إلى CL).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMالحكم319-005-CLسائل يحتوي على 4.5 جم/لتر دي-جلوكوز، يحتوي على إل-جلوتامين، فينول ريد، وبيروفات الصوديوم
بادئات QPCR منطقة EGFP CDSتسينغكهمهاجم: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGAGG-3'
مصل الأبقار الجنينيالحكم086-550جودة عالية، درجة زراعة الخلايا الأولية
البنسلين-ستريبتومايسين (P/S)الحكم450-201-ELيحتوي هذا المحلول على 10,000 وحدة/مل من البنسلين و10,000 وحدة وميكرو؛ جرام/مل من الستربتومايسين.
PrimeScript RT Master Mix (الوقت الحقيقي المثالي)تاكاراRR036A
مجموعة TaKaRa MiniBEST العالمية لاستخراج RNAتاكارا9767
تسينغكه TSE401 ArtiCan، الرئيس التنفيذي SYBR مزيج qPCRتسينغكهTSE401هذا المنتج مناسب للتجارب الكمية بالفلورة باستخدام طريقة صبغة SYBR Green ويتوافق مع العديد من أجهزة PCR الكمية الفلورية في الوقت الحقيقي.
تسينغكه TSP202-200 تريليف  مجموعة الحمض النووي الجينومية للحيوان Hi-PureتسينغكهTSP202-200
حل تايروديوان ييR20268-500 مليتكون بشكل رئيسي من كلوريد الصوديوم، وكلوريد البوتاسيوم، وكلوريد المغنيسيوم، والفوسفات، وكلوريد الكالسيوم، والجلوكوز، والهيبيس.

المراجع

  1. Wang, J. H., et al. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  2. Durbacz, M. Z., et al. Optimized genomic editing of a common Duchenne muscular dystrophy mutation in patient-derived muscle cells and a new humanized mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102569(2025).
  3. Hara, H., et al. An oral Aβ vaccine using a recombinant adeno-associated virus vector in aged monkeys: reduction in plaque amyloid and increase in Aβ oligomers. J Alzheimers Dis. 54 (3), 1047-1059 (2016).
  4. Xin, K. Q., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus elicits human immunodeficiency virus-specific immune responses. Hum Gene Ther. 13 (13), 1571-1581 (2002).
  5. Hara, H., et al. Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 6 (5), 483-488 (2004).
  6. Steel, J. C., et al. Oral vaccination with adeno-associated virus vectors expressing the neu oncogene inhibits the growth of murine breast cancer. Mol Ther. 21 (3), 680-687 (2013).
  7. Ma, H., et al. Oral adeno-associated virus-sTRAIL gene therapy suppresses human hepatocellular carcinoma growth in mice. Hepatology. 42 (6), 1355-1363 (2005).
  8. Hao, Z. M., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-7 suppresses CCl4-induced hepatic fibrosis in mice. Mol Ther. 20 (11), 2043-2051 (2012).
  9. Huang, W., et al. Genetic manipulation of brown fat via oral administration of an engineered recombinant adeno-associated viral serotype vector. Mol Ther. 24 (6), 1062-1069 (2016).
  10. Liu, X., et al. Adipose tissue insulin receptor knockdown via a new primate-derived hybrid recombinant AAV serotype. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 8(2014).
  11. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  12. Lassoued, M. A., Khemiss, F., Sfar, S. Comparative study of two in vitro methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus everted gut sac. J Pharm Pharm Sci. 14 (1), 117-127 (2011).
  13. Yang, Y. N., Zhan, J. G., Cao, Y., Wu, C. M. From ancient wisdom to modern science: Gut microbiota sheds light on property theory of traditional Chinese medicine. J. Integr. Med. 22 (4), 413-444 (2024).
  14. Liao, C. P., et al. Intestinal absorption components and absorption characteristics of Wuwei Qingzhuo San by everted intestinal sac models. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 49 (2), 509-517 (2024).
  15. Liao, Z. G., et al. Transport properties of puerarin and effect of extract of Radix Angelicae Dahuricae on puerarin intestinal absorption using in situ and in vitro models. Phytother Res. 28 (9), 1288-1294 (2014).
  16. During, M. J., Xu, R., Young, D., Kaplitt, M. G., Sherwin, R. S., et al. Peroral gene therapy of lactose intolerance using an adeno-associated virus vector. Nat. Med. 4 (10), 1131-1135 (1998).
  17. Hao, Z., Yang, X., Lv, Y., Li, S., Purbey, B. K., et al. Intracolonically administered adeno-associated virus-bone morphogenetic protein-7 ameliorates dextran sulphate sodium-induced acute colitis in rats. J. Gene Med. 14 (7), 482-490 (2012).
  18. Meng, J. S., et al. Melittin analog p5RHH enhances recombinant adeno-associated virus transduction efficiency. J. Integr. Med. 22 (1), 72-82 (2024).
  19. Sun, H., et al. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4 (4), 395-411 (2008).
  20. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids—current and future applications. Vet Sci. 3 (4), 31(2016).
  21. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  22. Caldeira, T. G., et al. Determination of intestinal permeability using in situ perfusion model in rats: challenges and advantages to BCS classification applied to digoxin. Int J Pharm. 551 (1-2), 148-157 (2018).
  23. Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411(2019).
  24. Mateer, S. W., et al. Ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease. J Vis Exp. (108), e53250(2016).
  25. Liu, W., et al. Developments in methods for measuring the intestinal absorption of nanoparticle-bound drugs. Int J Mol Sci. 17 (7), 1171(2016).
  26. Lengler, J., et al. Crucial aspects for maintaining rAAV stability. Sci Rep. 14, 27923(2024).
  27. Benskey, M. J., et al. Targeted gene delivery to the enteric nervous system using AAV: a comparison across serotypes and capsid mutants. Mol Ther. 23 (3), 488-500 (2015).
  28. Polyak, S., et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2, and 5. Dig Dis Sci. 53 (5), 1261-1270 (2008).
  29. Dudhatra, G. B., et al. A comprehensive review on pharmacotherapeutics of herbal bioenhancers. Scientific World Journal. 2012, 637953(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

rAAV

مقالات ذات صلة