Method Article

انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

DOI:

10.3791/945

⸱

November 26th, 2008

 ,  ,  , 
1Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تجلى هناك طريقة بسيطة ومحددة لوضع العلامات الفلورسنت وتعزيز اكتشاف بروتينات سطح الخلية دون خطوة التجزئة. وتم تحليل وفرة الفرق في البروتينات سطح الخلية باستخدام الكهربائي ثنائي الأبعاد (2 - D) وEttan التكنولوجيا DIGE ™.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات السطحية هي المركزية لقدرة الخلايا على الاستجابة لبيئتها وتتفاعل مع الخلايا المجاورة. ومن المعروف أن تكون محرضات من الإشارات كلها تقريبا داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك ، وأنها تلعب دورا هاما في التكيف مع البيئة والعلاج من تعاطي المخدرات ، وغالبا ما تشارك في التسبب بالمرض والباثولوجيا (1). البروتين البروتين التفاعلات الجوهرية لمسارات الإشارات ، وكسب مزيد من التبصر في هذه العمليات البيولوجية المعقدة ، وهناك حاجة إلى طرق حساسة وموثوق بها لدراسة بروتينات سطح الخلية. يستخدم ثنائي الأبعاد (2 - D) الكهربائي على نطاق واسع للكشف عن المؤشرات الحيوية وغيرها من الاهداف في عينات البروتين معقدة لدراسة التغيرات التفاضلية. بروتينات سطح الخلية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تدني وفرة (1 2 ٪ من البروتينات الخلوية) ، التي يصعب كشفها في هلام 2 - D دون تجزئة أو بعض الأنواع الأخرى من تخصيب اليورانيوم. كما انهم غالبا ما تظهر على استحياء في 2 مد المواد الهلامية نظرا لطبيعتها مسعور والوزن الجزيئي عالية (2). في هذه الدراسة ، فإننا نقدم لبروتوكول جديد للخلايا سليمة باستخدام الأصباغ CyDye DIGE فلور الحد الأدنى لوضع العلامات المحددة والكشف عن هذه المجموعة المهمة من البروتينات. أظهرت النتائج العلامات المحددة لعدد كبير من بروتينات سطح الخلية مع الحد الأدنى من العلامات البروتينات داخل الخلايا. هذا البروتوكول هو سريعة ، سهلة الاستعمال ، ويمكن استخدام كل ثلاثة CyDye DIGE الأصباغ فلور الأدنى (قبرصي 2 ، 3 و [سي] [سي] 5) لتسمية سطح الخلية البروتينات. هذه الميزات تسمح لمضاعفة استخدام 2 - D جل الفرق الإسفار الكهربائي (2 - D DIGE) مع التكنولوجيا DIGE Ettan وتحليل التغييرات باستخدام بروتين تعبير DeCyder 2 - D برمجيات التحليل التفاضلي. وأعقب مستوى سطح الخلية بروتينات المصل خلال تجويع الخلايا CHO لفترات مختلفة من الوقت (أنظر الجدول 1). تم الكشف عن تغيرات صغيرة في وفرة مع دقة عالية ، ويتم اعتماد النتائج وفقا لأساليب إحصائية محددة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلية ثقافة

  1. زراعة خلايا المبيض الهامستر الصيني (CHO - K1) باستخدام معيار إجراءات ثقافة خلية في المتوسط ​​هام F - 12 I مع GlutaMAX تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ، 50 U / مل البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل سلفات الستربتوميسين (Invitrogen).
  2. تبادل مستنبت لمصل خالية من وسائل الإعلام. وكانت التسمية بروتينات سطح الخلية عند نقاط زمنية مختلفة مع CyDye DIGE فلور Cy3 Cy5 أو الحد الأدنى من الأصباغ (انظر القسم سطح الخلية وصفها أدناه).
  3. تجمع أعداد متساوية من الخلايا من كل نقطة زمنية والتسمية مع فلور CyDye Cy2 DIGE. استخدام هذه كمعيار الداخلية لكل هلام 2 - D.
  4. لا يمكن أن يؤديها غالبية التجارب مع CHO - K1 الخلايا ، ولكن الخلايا الليفية جنين الفأر (L1 3T3) وسرطان الغدد الليمفاوية lymphoblasts الماوس استسقاء (EL4) يمكن أن تستخدم أيضا (لا تظهر البيانات).
  5. زراعة نوعين الخلية الأخيرة في المتوسط ​​مع DMEM GlutaMAX الثاني ، ولكن على خلاف ذلك ، استخدم ظروف مماثلة للخلايا المستخدمة CHO - K1.

سطح الخلية الوسم

  1. فصل الخلايا الملتصقة بعناية غير إنزيمي ، والفرز وتقسيمها الى aliquots الخلايا x106 5-10. للخلايا النمو في التعليق ، بحذف فصل الخطوة.
  2. الطرد المركزي للتعليق في الخلية حوالي 800 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة supernatants تحتوي على المتوسط.
  3. غسل الكريات بواسطة resuspendion في الحل 1 مل من الجليد الباردة هانك سولت المتوازن (HBSS) الرقم الهيدروجيني 8.5. طرد 800 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  4. إزالة وطاف resuspend الكرية الخلية في 200 العازلة الجليد الباردة العلامات ميكرولتر (HBSS الحموضة 8.5 ، 1 م اليوريا).
  5. تسمية الخلايا سليمة مع 600 بمول الأصباغ CyDye فلور DIGE الحد الأدنى لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
  6. إخماد ردة الفعل من خلال إضافة 20 ميكرولتر 10 ملي يسين. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  7. يغسل سطح الخلايا المسمى إعادة تعليق مرتين من قبل في 500 درجة الحموضة HBSS ميكرولتر 7.4 ، تليها الطرد المركزي في 800 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.

تحلل الخلايا والتجزيء

  1. ليز سطح الخلايا التي تحمل علامات في 150 ميكرولتر العازلة تحلل الباردة (7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 4 ٪ ، 30 ملم تريس ، 5 المغنيسيوم خلات الرقم الهيدروجيني 8.5 ملي مول). يترك على الجليد لمدة لا تقل عن 1 ساعة مع vortexing في بعض الأحيان.
  2. أجهزة الطرد المركزي في lysates في XG 000 10 في 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. طاف لنقل أنبوب جديد. هذا النموذج هو نموذج غير مجزأة تحتوي على جميع البروتينات الخلوية.
  3. في موازاة ذلك ، يغسل الكريات الخلية ، على النحو الوارد أعلاه ، ثم يجزئ (باستخدام عدة تجزيء الغشاء ، بيرس) في الغشاء والكسور عصاري خلوي قبل هلام إستشراد 2 - D. كسر غشاء الخلية الداخلية ويحتوي على بروتينات غشاء السطح.
  4. للمقارنة ، اتبع الإجراء القياسي DIGE Ettan 3 ، وليز ، والتسمية ، وأخيرا ، يجزئ الخلايا. تحديد تركيز البروتين في عينات باستخدام 2 -- مد كوانت كيت (جنرال الكتريك للرعاية الصحية).

2 - D الكهربائي

  1. ترطيب المواد الهلامية DryStrip Immobiline ، ودرجة الحموضة 3 11NL (24 سم) باستخدام علبة Immobiline DryStrip Reswelling ، 24 سم في 450 ميكرولتر DeStreak محلول معالجة الجفاف (0.5 ٪ IPG العازلة) بين عشية وضحاها.
  2. تطبيق CyDye المسمى عينات (الموافق 50 ميكروغرام البروتين الكلي) لImmobiline المواد الهلامية DryStrip عن طريق تحميل الكأس انوديك في مشعب وتنفيذ التركيز كهرساوي (IEF) باستخدام نظام Ettan IPGphor IEF الثاني وفقا للتعليمات.
  3. بعد IEF ، يوازن الشرائط في خطوتين ومكان على رأس كبير (26 × 20 سم) 12.5 ٪ بولي أكريلاميد المواد الهلامية (SDS - PAGE). تراكب مع agarose 0.5 ٪ (في إدارة العازلة التي تحتوي على bromophenol الزرقاء). تشغيل 2 مد الكهربائي باستخدام Ettan DALTtwelve نظام عمودي كبيرة في 5 واط / هلام لمدة 30 دقيقة ، ثم في 15 واط / هلام حتى تصل الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.

تصوير وتحليل البيانات

  1. بعد إكمال 2 - D الكهربي ، لتفحص المواد الهلامية Cy3 ، أو Cy2 Cy5 باستخدام اعصار 9410 تصوير الوضع المتغير.
  2. مقارنة خرائط بقعة من الكسور الغشاء ، الكسور عصاري خلوي ، والعينات غير مجزأة باستخدام DeCyder 2 - D برمجيات التحليل التفاضلي 4.

بعد التلوين

  1. بعد التصوير ، والفضة وصمة عار في المواد الهلامية وفقا للإجراءات القياسية 5.

تحديد بروتين

  1. تنمو ، والحصاد ، وغسل وليز المبالغ التحضيرية (ما يقرب من 1 ملغ من البروتين الكلي 10 خلايا CHO x106) من الخلايا ، كما هو موضح أعلاه للحصول على عينة غير مجزأة. استخدام سطح الخلية Cy5 عينة المسمى (انظر أعلاه) ، وارتفاعا ، وتطبيق جنبا إلى جنب مع كميات لا تحمل علامات التحضيرية للبروتين.
  2. تنفيذ الكهربائي 2 - D كما هو موضح أعلاه ، ولكن هذه المرة ، aplly 600 ميكروغرام غير المسماة الخلية lysate جنبا إلى جنب مع 50 ميكروغرام سطح الخلية المسمى ارتفاع الطلب من قبل كوب انوديك. استخدام علامات مرجعية للسماح للاختيار الصحيح المكان ، والمكان يمكن أن يكونتوين لوحات من الزجاج قبل صب جل وفقا لتوصيات 3.
  3. مسح الجل في Cy5 القناة للحصول على سطح الخلية Cy5 خريطة الموقع ، تليها تلطيخ البروتين الكلي العميق باستخدام البروتين الكلي الأرجواني صمة 3.
  4. المباراة معا خرائط المرتبة الثانية باستخدام DeCyder 2 - D البرمجيات وإنشاء قائمة اختيار لجميع البقع المقابلة ل5 قبرصي بروتينات سطح الخلية المسمى. اختيار بروتينات سطح الخلية باستخدام محطة معالجة البقعة Ettan ، مستخرج من المقابس هلام ، وtrypsinate باستخدام هاضم Ettan. تحديد باستخدام - TOF MALDI مطياف الكتلة.

الجدول 1. أجري تجربة DIGE Ettan باستخدام عينات من مصل الخلايا المسمى المنضب وفقا لبروتوكول بروتين سطح الخلية الوسم في الشكل 1.

عينة زمن نضوب المصل صفتها مع CyDye عدد هلام
1 -- قبرصي 3 ، 2 قبرصي 1
2 30 دقيقة قبرصي 5 ، 2 قبرصي 1
3 2 ساعة قبرصي 3 ، 2 قبرصي 2
4 4 ساعات قبرصي 5 ، 2 قبرصي 2
5 16 ساعة قبرصي 5 ، 2 قبرصي 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركيز البروتين

ويظهر لمحة عامة عن سير العمل وضع العلامات اثنين في الشكل 1. منذ خلايا لا تزال على حالها عند المسمى وفقا للبروتوكول بروتين سطح الخلية الوسم ، يتعرض فقط سطح الخلية البروتينات إلى صبغ. في بروتوكول قياسي DIGE Ettan ، يتم lysed الخلايا قبل أن يتم وضع العلامات والبروتينات المسماة داخل وخارج الخلية (الشكل 1). ولا يعرف كمية النسبية للصبغ للبروتين في البروتوكول بروتين سطح الخلية العلامات ، إذ لا يمكن بروتينات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الأستاذ Dontscho Kerjaschki ، مايرهوفر كورينا وكريجر سيجورد في معهد علم الأمراض السريرية في جامعة فيينا ، النمسا لتعاونهما.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجموعة CyDye DIGE Kit ، كاشف 2 نانومولGE Healthcare28-9345-30
كاشف مجموعة الكم 2-DGE Healthcare80-6484-51
IPG Buffer درجة الحموضة 3-11NLكاشفGE Healthcare17-6004-40
Immobiline DryStrip درجة الحموضة 3-11NL ، كاشف 24 سمGE Healthcare17-6003-77
IPGboxGE Healthcare28-9334-65
IPGboxkit أداةGE Healthcare28-9334-92
DeStreak Rehydration solutionRehydration ReagentGE Healthcare17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover FluidكاشفGE Healthcare17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF UnitInstrumentGE Healthcare11-0033-64
Ettan IPGphorManifold InstrumentGE Healthcare80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster ToolGE Healthcare80-6467-22
Ettan DALTtwelve وحدة الفصل ووحدة إمداد الطاقة / التحكمأداةGE Healthcare80-6466-46وحدة 230 فولت: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode ImagerأداةGE Healthcare63-0055-81
Ettan SpotPicker InstrumentGE Healthcare18-1145-28
Ettan DigesterInstrumentGE Healthcare18-1142-68
Ettan SpotterInstrumentGE Healthcare18-1142-67
Ettan MALDI-TOFInstrumentGE Healthcare18-1142-33
برنامج التحليل التفاضلي DeCyder 2-DآخرGE Healthcare28-4012-01
برنامج تحليل ImageQuantأخرىGE Healthcare28-9236-62
كاشف اليورياGE Healthcare17-1319-01
كاشف CHAPSGE Healthcare17-1314-01
PlusOne ديثيوثريتول (DTT)كاشفGE Healthcare17-1318-01
كاشفبروموفينول الأزرقGE Healthcare17-1329-01
كاشف تريسGE Healthcare17-1321-01
دوديسيل سلفات الصوديوم (SDS)كاشفGE Healthcare17-1313-01
PlusOne Glycerol 87٪كاشفGE Healthcare17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40٪ T ، 3٪ CكاشفGE Healthcare17-1310-01
كاشف PlusOne TEMEDGE Healthcare17-1312-01
كاشف بيرسلفات الأمونيوم PlusOneGE Healthcare17-1311-01
كاشف جلايسين PlusOne GE Healthcare17-1323-01
2-D عينة الإعدادية لبروتينات الغشاءكاشفبيرس ، Thermo Scientific89864
كاشفكبريتات الستربتومايسينInvitrogen15140-122
أداة مكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
  2. Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
  3. Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
  4. DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
  5. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
  6. CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
  7. Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
  8. Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Surface ProteinsCyDye DIGE Fluor2D DIGEEttan DIGEDeCyder AnalysisIntact Cell LabelingMembrane Protein DetectionSerum Starvation CHOFluorescent ImagingSilver Staining

Related Articles