غير المشعة في الموقع تطبيق بروتوكول لتهجين شجرة التنوب النرويج ومجموعة من الأنواع النباتية
أبريل 17, 2009
نحن تصف تعديل DIG في الموقع بروتوكول التهجين ، وهو سريع ويمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأنواع النباتية بما في ذلك النرويج شجرة التنوب. مع تعديلات قليلة ، بما في ذلك العلاج ريبونوكلياز تغيير وتركيز بروتين كاف ، يمكن استخدام البروتوكول في دراسات الأنسجة المختلفة والأنواع.
بروتوكول التهجين الموضعي غير الإشعاعي القابل للتطبيق على تنوب النرويج ومجموعة من الأنواع النباتية. Carre Etal. مرحباً، اسمي AM GaN، ونحن نعمل في جامعة OBS والجامعة السويدية للعلوم الزراعية في obs السويد.
لقد وضعنا بروتوكولاً لزيارات الحشرات داخل الأزهار يعمل على عدة أنواع مختلفة من النباتات. سنوضح لكم اليوم بعض الخطوات الدقيقة. وسنعرض لكم في هذا البروتوكول عملية الطمر والتقطيع، والخطوات المختلفة في تجربة زيارة الحشرات الفعلية.
لننتقل إلى المختبر الأول، خطوات التثبيت والصبغ من التاسعة إلى الحادية عشرة في البروتوكول. الخطوة التاسعة، تسخين أطباق بتري والقوالب مسبقاً عند 60 °C. الخطوة العاشرة، تسخين ملقط وتوزيع الأنسجة بالتساوي في الطبق.
أضف المزيد من شمع الأنسجة (histo wax) حتى يتم تغطية الأنسجة بالكامل. في الخطوة 11، اترك الشمع يتصلب في درجة حرارة الغرفة. اتبع الخطوات من 12 إلى 19 في البروتوكول.
قم بتشغيل الصفائح الساخنة وتجهيز شمع الأنسجة (histo wax) المذاب. أخرج العينات من الغرفة الباردة. في الخطوة 13، استخدم مشرطاً لقطع كتلة شمعية من النسيج بعناية.
قم بتشكيل القطعة لتسهيل عملية التقطيع. في الخطوة 14، يتم تسخين الكتلة والطرف الخلفي لصهرها ودمجها معاً. اترك العينة لتتصلب عند درجة حرارة 4 °C.
الخطوة 15، يتم قطع قالب الشمع إلى مقاطع يتراوح سمكها بين 6 إلى 8 ميكرومتر. باستخدام الميكروتوم، يتم ربط المقاطع في شريط واحد طويل. اقطع الشريط وانقله إلى الورق.
في هذه المرحلة، يمكن فحص المقاطع الفردية باستخدام مجهر ستيريو لاختيار المقاطع ذات الأهمية. سيكون من السهل إجراء الفحص مع الأنسجة المصبوغة بـ eoin. الخطوة 17: أضف Milli Q water الخالي من RNA إلى الشرائح.
قم بتقطيع الشرائط إلى قطع أصغر وضعها على الشرائح. انقل الشرائح إلى الصفيحة الساخنة. الخطوة 17، اترك الشرائط لتتسطح على صفيحة بدرجة حرارة 42 °C لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
قم بتصريف المياه باستخدام مناديل كيم (Kim wipe). الخطوة 19، حضّن الشرائح عند 42 °C طوال الليل لضمان التصاق الأنسجة بالشرائح لعملية التهجين الموضعي (in situ hybridization)، القسم 4.1 من التهجين الموضعي، خطوات المعالجة المسبقة من 36 إلى 48 في البروتوكول.
الخطوة 36: وضع المقاطع في طبقة نسيجية. يتم توزيع الشرائح بمسافات متساوية ووضعها في حامل لتسهيل النقل بين الحاويات المختلفة، ثم تجفيف المقاطع. في سلسلة من الإيثانول، يتم إضافة أنهيدريد حمض الخليك مع التحريك بقوة.
الخطوة 45، التجهيز للمعالجة بـ acetic anhydride لـ 4.2 التهجين الموضعي (in situ hybridization). الخطوات من 49 إلى 52 في البروتوكول. الخطوة 51، تعتيق شرائح pro one plus.
المحلول لزج. حاول تجنب تكون الفقاعات. قم بتحضين الشرائح في غرفة رطبة.
4.3 البداية. بعد التهجين، اتبع الخطوات من 53 إلى 72 في البروتوكول. في الخطوة 62، قم بتحضين الشرائح مع كتلة الحجز في حاوية بلاستيكية.
الخطوة 63، أضف كمية كافية من محلول الحجب لتغطية الشرائح فقط. يتم إضافة الأجسام المضادة إلى الشرائح باستخدام تقنية التعتيق (aging). تعمل تقنية التعتيق فقط مع شرائح prob bon plus. أما بالنسبة للشرائح ذات التصميم المماثل، فالخطوة 65، اترك القوى الشعرية تسحب محلول الجسم المضاد anti dig إلى الأعلى.
تُكرر هذه الخطوة. في الخطوة 70، وبنفس الطريقة السابقة، يتم وضع العينات بين المناديل الورقية وسحب محلول western blue. لاحظ أنه يتم سحب محلول Western blue مرتين، تماماً كما فعلنا مع محلول antibody anti-dig.
وفي الخطوة 65، والخطوة 71، تُحضن الشرائح في الظلام لمدة تتراوح من يوم واحد إلى خمسة أيام. وفي درجة حرارة الغرفة، يمكن مراقبة إشارات التهجين باستخدام مجهر ستيريو. وبينما لا تزال الشرائح محصورة بين شريحتين، يجب أن يكون من الممكن ملاحظة بقع يتراوح لونها من الأرجواني إلى البني.
هذا هو شكل النتائج الفعلية من تجربة محطة CW. يمكنك رؤية الإشارة هنا على شكل تصبغ أرجواني أو بني.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً معدلاً للتهجين الموضعي باستخدام DIG، والذي يتميز بالكفاءة والقابلية للتكيف مع أنواع نباتية مختلفة، بما في ذلك تنوب النرويج. يتضمن البروتوكول تعديلات محددة، مثل تغييرات في المعالجة بـ RNase وتركيز proteinase K، لتعزيز إمكانية تطبيقه عبر مختلف الأنسجة والأنواع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا النبات
- البيولوجيا الجزيئية
- تقنيات التهجين الموضعي
خلفية علمية
- يعد التهجين الموضعي (In situ hybridization) تقنية قيمة لدراسة التعبير الجيني في الأنسجة.
- يمكن أن تستغرق الطرق التقليدية وقتاً طويلاً وأن تكون مقتصرة على أنواع محددة.
- يمكن أن تؤدي التعديلات على البروتوكولات الحالية إلى تحسين الكفاءة وتعدد الاستخدامات.
- تركز هذه الدراسة على بروتوكول مناسب لمجموعة من الأنواع النباتية.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول التهجين الموضعي (in situ hybridization) ليكون أسرع وأكثر قابلية للتكيف.
- إثبات مدى قابلية تطبيق هذا البروتوكول على تنوب النرويج (Norway spruce) وأنواع نباتية أخرى.
- توفير خطوات إجرائية مفصلة للباحثين.
الطرق المستخدمة
- طمر وتقطيع الأنسجة النباتية.
- خطوات المعالجة المسبقة والتهجين للتحليل الموضعي (in situ).
- استخدام كواشف وظروف محددة لتحسين النتائج.
- مراقبة إشارات التهجين تحت المجهر.
النتائج الرئيسية
- يسهل البروتوكول المعدل بنجاح عملية التهجين الموضعي (in situ hybridization) عبر أنواع نباتية متعددة.
- تعزز التعديلات في معالجة RNase وتركيز proteinase K من توافق الأنسجة.
- تم تحقيق تصور واضح لإشارات التهجين.
- يتميز البروتوكول بالكفاءة وقابلية التكرار لمختلف التطبيقات.
الاستنتاجات
- يعد بروتوكول التهجين الموضعي المعدل باستخدام الـ DIG أداة قيمة في أبحاث النباتات.
- فهو يتيح تحليلاً سريعاً وفعالاً للتعبير الجيني في أنسجة نباتية متنوعة.
- ويمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذا البروتوكول لتحقيق تطبيقات أوسع في علم أحياء النبات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول تحليلاً عالي الدقة للتعبير الجيني المكاني في الأنظمة النباتية، مما يدعم التحقق من الأهداف في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال تأكيد أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة. ويقلل هذا النهج من الاعتماد على النظائر المشعة والتحسينات المكثفة الخاصة بكل نوع، مما يحسن من إمكانية التكرار والقابلية للتوسع في الدراسات المقارنة بين الأنواع. كما توفر هذه الطريقة قيمة في تقليل المخاطر الميكانيكية للفحص المظهري واكتشاف المؤشرات الحيوية الترجمية في مسارات التصنيع الدوائي الحيوي القائم على النباتات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يؤكد التموضع النوعي لـ mRNA في الأنسجة لاستقصاء الفرضيات العلاجية وتوضيح وظيفة الجينات في مسارات التطور التناسلي.
- القيمة التشغيلية: يتيح التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال التصوير المباشر للتعبير الجيني في الأعضاء التناسلية الذكرية عبر نماذج معراة البذور ومغطاة البذور.
- القيمة التنبؤية: يدعم الثقة التنبؤية من خلال إظهار أنماط تعبير محفوظة للجينات المتجانسة (مثل homologs لـ AP3) في البنى الزهرية لنباتات Arabidopsis و Brassica والتنوب النرويجي.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تحضير مقاطع نسيجية قياسية لاختبارات التهجين اللاحقة مع كشف متسق للإشارة باستخدام مسابير مُعلمة بـ DIG.
- قابلية التكرار: الاستغناء عن المعالجة بـ RNase وضبط تركيز proteinase K لتعزيز قوة الإشارة وتقليل التباين بين الأنواع.
- القابلية للتوسع: تسهيل التطبيق عالي الإنتاجية عبر أنواع نباتية متنوعة مع حد أدنى من التعديلات في البروتوكول، مما يسمح بإعادة استخدام المنصة في الجينوميات المقارنة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يوضح إمكانية التطبيق من كاسيات البذور النموذجية إلى معراة البذور، مما يدعم تعميم النتائج على الأنظمة الخشبية المعمرة ذات الصلة بإنتاج الكتلة الحيوية والبوليمرات الحيوية.
- تقليل مخاطر الآليات: يقلل من الغموض في تحديد وظائف الجينات من خلال ربط تماثل التسلسلات بالتعبير المكاني في البنى التطورية المحفوظة.
- تطابق المؤشرات الحيوية: يتيح إيجاد ارتباط مكاني بين التعبير الجيني والسمات المظهرية في الأنسجة التناسلية، مما يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية في الزراعة الجزيئية للنباتات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة بيولوجيا الاكتشاف، مما يتيح تحديد الأهداف القائمة على الفرضيات قبل فحص المركبات الرائدة في أنظمة التعبير القائمة على النباتات.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال التحقق من التعبير المكاني للجينات المرشحة في أنسجة ومراحل نمائية محددة.
- الفحص: يولد قراءات مكانية كمية تساهم في تصميم المقايسات لمراقبة تأثير المركبات في الأنسجة المعدلة وراثياً أو المعالجة.
- التحليلات: ينتج إشارات مولدة للألوان يمكن اكتشافها (من الأرجواني إلى البني) تكون قابلة للتصوير والتحليل المقارن عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط أنماط التعبير الجيني بالأنماط الظاهرية النمائية في الأعضاء التناسلية، مما يدعم قرارات المضي قدماً في مسارات التحقق من السمات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس سير عمل موحد وقابل للتكيف لتحليل التعبير الجيني عبر الأنواع المختلفة، مما يقلل من جهود التحسين المتكررة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من صحة الهدف من خلال الكشف المباشر عن mRNA بدقة مكانية دون مخاطر إشعاعية.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار عن طريق إلغاء المعالجة بـ RNase وتوحيد استخدام proteinase K، مما يقلل من معدلات فشل البروتوكول.
- القيمة الاستراتيجية: تسرع اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) في اختيار الأهداف من خلال توفير بيانات تعبير غير غامضة في مرحلة مبكرة من عملية الاكتشاف.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على تعديل المخاطر وفق أنماط تعبير محفوظة عبر الأنواع، مما يحسن معدلات النجاح في التطبيقات اللاحقة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأنسجة، وطمر الأنسجة، وتقطيع المواد النباتية.
- يعتمد على توفر أجهزة الميكروتوم، وأفران التهجين، وأنظمة الكشف اللونية.
- يستلزم توحيد تركيز proteinase K بناءً على كثافة الأنسجة والمحتوى الفينولي.
- يتضمن تكييف أوقات ودرجات حرارة الحضن وفقاً لمختلف الأنواع وأطوال المسبارات.
- يحد منه التألق الذاتي للأنسجة ونفاذية المركبات في العينات عالية الخشبية أو الغنية بالنواتج الأيضية الثانوية.
