قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

لقد استُخدمت خميرة التبرعم Croce Visi على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. نقدم في هذا المقال بروتوكولاً عاماً لقياس فترة الحياة التكرارية للخلايا الأم في الخميرة. مرحباً، أنا كريستين ستيفن من مختبر برايان كينيدي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة واشنطن.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس عمر التكاثر لخلايا الخميرة الأم. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجينات التي تؤثر على عمر خلايا الخميرة. لذا، دعونا نبدأ.

من أجل تجربة عمر التكاثر وتحضير خلايا الخميرة لتحليل عمر البقاء، يجب تحضير أطباق YEPD صلبة للقيام بذلك. استخدم تقنية تعقيم مناسبة لتحضير أطباق أغار YEPD هذه. قم بتحضير طبقين على الأقل لكل أربعة إلى خمسة سلالات سيتم تحليلها في تجربة عمر البقاء.

يجب تحضير هذه الأطباق قبل يومين على الأقل من تجربة مدى الحياة وتركها لتجف قبل البدء في تحليل مدى الحياة. وإذا لم تُجرَ التجربة في غضون أربعة إلى خمسة أيام من صب الأطباق، فيجب تغليفها بفيلم البارافين أو البلاستيك ووضعها في حاضنة مبردة لمنع الجفاف. أخرج سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة وقم بتخطيطها للحصول على مستعمرات مفردة.

على أطباق آغار YEPD. يمكن تخطيط ما يصل إلى ست سلالات بسهولة على طبق YEPD نفسه عن طريق تقسيم الطبق إلى قطاعات متساوية الحجم على شكل قطع دائرية. تُحضن الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.

بعد الحضن، أخرج الخلايا من الحاضنة وانقل خلايا من مستعمرة واحدة إلى طبق YEPD جديد. في هذه المرحلة، يجب تغطية السلالات المراد تحليلها لضمان إجراء تجربة عمر التكرار بطريقة التعمية، بحيث لا يعرف القائمون على عملية التشريح هوية السلالات الفردية.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا المغطاة والمرقعة عند 30 درجة Celsius حتى مساء اليوم التالي. تُرفع الخلايا ويتم ترقيع الخلايا من كل سلالة مغطاة بشكل خفيف إلى أطباق YEPD جديدة. ستعمل هذه الأطباق كأطباق تجريبية تُستخدم لقياس مدى الحياة التكراري.

يجب نقل خلايا التحليل على شكل بقع على طول خط عمودي في الجانب الأيسر من طبق YEPD. تجنب نقل عدد كبير جداً من الخلايا إلى طبق YEPD طازج واحد؛ حيث سيؤدي ذلك إلى نمو كثيف للخلايا أثناء الحضن طوال الليل، مما يؤثر على عمرها التكاثري، لذا فإن وضع ثلاث إلى خمس بقع تقريباً في كل طبق هو الخيار الأمثل.

بافتراض أن تحليل مدى الحياة التكراري سيتم إجراؤه على 20 خلية من كل بقعة، فقد أصبح الآن إعداد تجربة مدى الحياة مكتملاً، وكل ما تبقى هو تحضينها طوال الليل على سطح المختبر. وبعد ذلك، يمكننا غداً البدء في عملية التشريح المجهري لترتيب خلايا الخميرة على الطبق والحصول على خلايا ابنة بكر من أجل تحليل مدى الحياة التكراري.

استخدم مجهراً مجهزاً بجهاز تشريح دقيق مناسب للخميرة. انقل حوالي 50 خلية من السلالة في الرقعة الأولى إلى موضع على الطبق بعيداً عن الخلايا المرقعة. إذا كانت منصة المجهر مدرجة، فيمكن استخدام هذه التدريجات لضمان سهولة العثور على الخلايا خلال التكرارات اللاحقة.

أحياناً قد تلتصق الخلايا بالإبرة، وهو ما قد يشكل مشكلة إذا خرجت في وقت غير مناسب. وللتأكد من نظافة الإبرة وخلوها من الخلايا، قم بلمس سطح الآجار بشكل متكرر. بعد ذلك، اصنع ثقباً في الآجار عن طريق دفع الإبرة عبر سطحه.

ستعمل هذه الفتحة كعلامة لتوجيهك على الطبق خلال عمليات التشريح اللاحقة وإزالة الخلايا المنقطة. توخَّ الحذر لتجنب وصول خلايا الخميرة إلى الفتحة، وإلا فإنها ستنمو وتُشكل مستعمرة مباشرة فوق الفتحة. قم بمحاذاة خلايا الخميرة الفردية عمودياً في 20 موضعاً متباعدة بالتساوي، مع ترك مسافة تتراوح من قطر إبرة واحدة إلى ثلاثة أقطار بين كل موضع خلية والآخر.

لكل بضع خلايا، ضع خليتين بجانب بعضهما البعض في نفس الموضع من الخط بدلاً من خلية واحدة. يتيح ذلك وجود فائض أثناء عملية اختيار الخلايا البنوتية العذراء. إذا فشلت إحدى الخلايا المنقولة في الانقسام بين الموضع العاشر والحادي عشر في الخط، فقم بعمل سلسلة أفقية من سبع إلى ثماني ثقوب في الآجار.

سيعمل هذا كعلامة لتوجيهك على الطبق أثناء عمليات التشريح اللاحقة وإزالة الخلايا الوليدة. ومرة أخرى، توخَّ الحذر لتجنب وصول خلايا الخميرة إلى الثقوب، وإلا فإنها ستنمو وتشكل مستعمرة. كرر هذا الإجراء لكل بقعة على الطبق، مع الاستمرار في ترتيب الخلايا رأسياً على طول المحور نفسه.

من المهم تذكر أنه عند إنشاء الثقوب في AER، يجب أن يتوافق عدد الثقوب المنشأة مع رقم الرقعة، بحيث يكون هناك ثقب واحد للرقعة الأولى، وثقبان للثقوب الثانية. بمجرد توزيع الخلايا لكل رقعة، قم بتغطية الطبق بغشاء parafilm وحضنه عند 30 °C لمدة ساعتين تقريبًا. تذكر أنه من هذه النقطة فصاعدًا، يجب تغطية جميع الأطباق بغشاء parafilm باستثناء الأوقات التي يتم فيها التشريح.

من أجل منع الجفاف، كرر هذا الإجراء لكل طبق. في التجربة، ومن أجل تحليل طول العمر، من المهم التأكد من أن كل خلية تبدأ كخلية ابنة عذراء.

للقيام بذلك، ابدأ بإخراج الأطباق من الحاضنة والتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لانقسام خلوي. ما لدينا هنا هي خلايا تم محاذاتها مسبقاً، ويمكنكم ملاحظة أنها بدأت في الانقسام بعد مرور ساعتين في الحاضنة. والآن لدينا الخلية الأم، وهي الخلية الأكبر المتصلة بجسمها، والخلية البنت البكر، وهذه الخلية البنت البكر هي الخلية التي ستُستخدم لبدء قياس فترة الحياة.

إذا كانت هناك حاجة إلى وقت إضافي للسماح باكتمال انقسامات الخلايا، فقم بإعادة الطبق إلى الحاضنة. بدءاً من خلية المصفوفة الأولى، استخدم الإبرة لفصل الخلايا الوليدة عن الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة برفق فوق الخلايا الملتصقة.

قد يكون من المفيد أحياناً النقر على جانب قاعدة المجهر بينما تكون الإبرة مستقرة على الخلايا. بعد ذلك، ضع الخلية الوليدة المنفصلة في الخط الرأسي للخلايا لتحل محل الخلية الأم وأي خلايا وليدة إضافية، مع تحريك هذه الأخيرة جانباً بشكل مؤقت. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا المصفوفة.

إذا فشلت خلية في الانقسام، فخذ خلية بنوية من إحدى الخلايا الفائضة الموجودة بجوار الخلية المختبرة. عند الانتهاء، يجب أن يكون لديك 20 خلية بنوية لكل رقعة مصطفة رأسيًا على لوحة قياس فترة الحياة. اجمع كل الخلايا الأم والخلايا البنوية الإضافية في كومة واحدة وانقلها مرة أخرى إلى منطقة بالقرب من الرقع تسمى المقبرة.

من المهم إبقاء الخلايا غير المرغوب فيها بعيدة عن الخلايا التي تخضع لتحليل مدى الحياة لمنع تكون مستعمرات دقيقة واستنزاف العناصر الغذائية المحلية. بمجرد فصل الخلايا، أخرجها من الطبق واحضنها عند 30 درجة Celsius لمدة ساعتين تقريبًا. كرر هذه الخطوات لكل طبق في التجربة.

لقياس القدرة التكرارية للخلايا الفردية، ستحتاج إلى إعداد أوراق بيانات فترة الحياة. يمكن أن تكون ورقة بيانات فترة الحياة عبارة عن شبكة بسيطة حيث يمثل كل صف خلية أم فردية ويمثل كل عمود نقطة عمرية. تأكد من تسمية كل ورقة بيانات وفقاً لعدد السلالات المراد تحليلها.

للبدء، قم أولاً بإخراج الأطباق من الحاضنة وتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لانقسام خلوي واحد على الأقل. إذا كانت هناك حاجة لمزيد من الوقت للسماح باكتمال الانقسام الخلوي، فأعد الطبق إلى الحاضنة. ابدأ بأول خلية في المصفوفة على الطبق الأول، وراقب بصرياً الخلية الأم والخلية أو الخلايا الابنة لتحديد عدد الانقسامات الخلوية التي حدثت.

من السهل عموماً تحديد عدد الخلايا الوليدة التي أنتجتها الخلية الأم بناءً على الأنماط المميزة لترتيب الخلايا. من البسيط جداً هنا معرفة عدد الخلايا التي تم إنتاجها لوجود خليتين هناك، وهما من نفس الحجم وكلاهما أصغر من الخلية الأم. سجل عدد الخلايا الوليدة التي أنتجتها الخلية الأم في المربع المناسب في ورقة تسجيل مدة الحياة.

بعد ذلك، استخدم الإبرة لفصل الخلايا البنوية عن الخلية الأم كما وُصف سابقاً، وذلك بوضع الإبرة برفق فوق الخلايا الملتصقة والنقر على جانب قاعدة المجهر بينما تستقر الإبرة على الخلايا. حافظ على وضع الخلية الأم في الخط العمودي وحرك الخلية البنوية أو الخلايا البنوية جانباً بشكل مؤقت. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا المصفوفة.

أخيراً، اجمع كل الخلايا الوليدة المستبعدة وانقلها إلى منطقة التخلص الموجودة بالقرب من البقع الأصلية. غلف الطبق بفيلم Para film ثم حضنه عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات. كرر عملية استبعاد الخلايا الوليدة والتحضين.

الخطوة لكل طبق في التجربة. كرر هذا الإجراء بالكامل حتى تتوقف جميع الخلايا الأم عن الانقسام. ضع في اعتبارك أنه مع تقدم الخلايا الأم في السن، يصبح تقدم الدورة الخلوية أبطأ، وسيكون من المرغوب فيه تحضين الطبق لفترات زمنية أطول بين نقاط العمر، وبعد ذلك، يمكن وضع الأطباق في درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

تتمثل البيانات الخام الناتجة عن تجربة عمر التكاثر في قائمة من الأرقام التي تقابل الخلايا الوليدة التي أنتجتها كل خلية أم عند كل نقطة زمنية من العمر، كما هو موضح هنا. ومن خلال جمع كل صف في ورقة تسجيل الدرجات، يتم الحصول على عمر التكاثر لكل خلية أم.

يمكن تجميع البيانات من خلايا أخرى من نفس المجموعة التجريبية لإنشاء منحنى بقاء وإجراء الحسابات الإحصائية. يجب أن يكون المنحنى متوافقاً تقريباً مع حركيات Gomperts Mac am، بحيث يظهر شكلاً سينياً (sigmoidal) يتميز بانخفاض الوفيات في المراحل المبكرة، يليه انخفاض سريع نسبياً في معدل البقاء، ثم استواء المنحنى في الأعمار المتقدمة. لقد قدمنا لكم الآن كيفية إجراء تجربة عمر التكاثر في الخميرة.

عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر أن الخلايا ستستمر في الانقسام طالما أنها ليست في بيئة باردة. لذا، تذكر وضع الأطباق عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل حتى لا ينتهي بك الأمر بعدد كبير جداً من الخلايا الوليدة التي يصعب عدّها في الصباح. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.