قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

تم استخدام الخميرة الناشئة Croce Visi على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا عاما لقياس العمر التكاثري للخلايا الأم للخميرة. مرحبا ، أنا كريستين ستيفن من مختبر بريان كينيدي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة واشنطن.

سنعرض لك اليوم إجراء لقياس العمر التكاثري للخلايا الأم للخميرة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجينات التي تؤثر على عمر خلايا الخميرة. لذلك دعونا نبدأ.

بالنسبة لتجربة العمر التكاثري وإعداد خلايا الخميرة لتحليل العمر الافتراضي ، يجب أن تكون ألواح YEPD الصلبة مستعدة للقيام بذلك. استخدم تقنية معقمة مناسبة لتحضير ألواح أجار YEPD هذه. قم بإعداد طبقين على الأقل لكل أربع إلى خمس سلالات ليتم تحليلها في تجربة العمر الافتراضي.

يجب تحضير هذه الألواح قبل يومين على الأقل من تجربة العمر الافتراضي وتركها تجف قبل بدء مقايسة العمر. إذا لم تتم التجربة في غضون أربعة إلى خمسة أيام من صب الأطباق ، فيجب لفها في غشاء أو بلاستيك ووضعها في حاضنة مبردة لمنع الجفاف. قم بإزالة سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة وخطها للمستعمرات الفردية.

على لوحات أجار YEPD. يمكن بسهولة ربط ما يصل إلى ست سلالات على نفس لوحة YEPD عن طريق تقسيم اللوحة إلى أسافين متساوية الحجم على شكل دائرة. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وقم بتصحيح الخلايا من مستعمرة واحدة على صفيحة YEPD جديدة. في هذا الوقت ، يجب طلاء السلالات المراد تحليلها لضمان إجراء تجربة العمر التكاثري بشكل أعمى. حيث لا يعرف التشريح هوية السلالات الفردية. سلاسل.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا المطلية المرقعة عند 30 درجة مئوية حتى المساء التالي. قم بإزالة الخلايا وقم بترقيع الخلايا برفق من كل سلالة مغلفة إلى ألواح YEPD الجديدة. ستكون هذه بمثابة لوحات تجريبية تستخدم لعمر التكرار

يجب ترقيع خلايا التحليل على طول خط عمودي على الجانب الأيسر من لوحة YEPD. لا تنقل الكثير من الخلايا إلى لوحة YEPD واحدة جديدة. نظرا لأن هذا سيؤدي إلى نمو كثيف للخلايا أثناء الحضانة الليلية ويؤثر على عمرها التكاثري ، فإن ما يقرب من ثلاث إلى خمس بقع لكل لوحة هي الأمثل.

بافتراض أنه سيتم إجراء تحليل العمر التكاثري على 20 خلية من كل رقعة ، والآن تم إعداد تجربة العمر الافتراضي بالكامل وكل ما عليهم فعله هو احتضانه طوال الليل على سطح المقعد. وبعد ذلك غدا يمكننا أن نبدأ التشريح الدقيق لوضع خلايا الخميرة على اللوحة والحصول على الخلايا الوليدة البكر. لتحليل العمر التكراري.

استخدم مجهرا مزودا بجهاز تشريح دقيق مناسب للخميرة. انقل ما يقرب من 50 خلية من سلالة الرقعة الأولى إلى موضع على اللوحة البعيدة إلى الخلايا المرقعة. إذا تم تصنيف مرحلة المجهر الخاص بك ، فيمكن استخدام هذه التدرجات لضمان سهولة العثور على الخلايا أثناء التكرارات اللاحقة.

في بعض الأحيان يمكن أن تعلق الخلايا في الإبرة ، مما قد يمثل مشكلة إذا خرجت في الوقت الخطأ. للتأكد من أن الإبرة نظيفة وخالية من الخلايا ، المسها على سطح الأجار بشكل متكرر. ثم قم بعمل ثقب في الأجار عن طريق إجبار الإبرة على المرور عبر سطح الأجار.

سيكون هذا الثقب بمثابة علامة لتوجيهك على اللوحة أثناء التكرارات اللاحقة للتشريح وإزالة الخلايا المنقطة. احرص على عدم وضع خلايا الخميرة في الحفرة ، وإلا فإنها ستنمو وتشكل مستعمرة بعد ذلك مباشرة فوق الحفرة. محاذاة خلايا الخميرة الفردية رأسيا في 20 وضعا متباعدة بشكل متساو بأقطار إبرة واحد إلى ثلاثة بين كل موضع خلية.

لكل بضع خلايا ، ضع خليتين بجانب بعضهما البعض في نفس الموضع في السطر بدلا من خلية واحدة. هذا يسمح بالتكرار أثناء اختيار الخلية الوليدة البكر. إذا فشلت إحدى الخلايا المنقولة في الانقسام بين الموضعين 10 و 11 في الخط ، فقم بإنشاء سلسلة أفقية من سبعة إلى ثمانية ثقوب في الأجار.

سيكون هذا بمثابة علامة لتوجيهك على اللوحة أثناء التشريح اللاحق وإزالة الخلايا الوليدة. مرة أخرى ، احرص على عدم وجود خلايا الخميرة في الثقوب وإلا ستنمو وتشكل مستعمرة. كرر هذا الإجراء لكل رقعة على اللوحة ، واستمر في اصطفاف الخلايا عموديا على طول نفس المحور.

من المهم أن تتذكر أنه عند إنشاء الثقب في AER ، فإن عدد الثقوب التي تم إنشاؤها يتوافق مع رقم التصحيح بحيث يكون هناك ثقب واحد للتصحيح الأول ، وفتحتان للثانية. بمجرد أن يتم ترتيب الخلايا لكل رقعة ، قم بتشكيل اللوحة واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا. تذكر ، من هذه النقطة فصاعدا ، يجب تصوير جميع اللوحات إلا عند الخضوع للتشريح.

من أجل منع الجفاف ، كرر هذا الإجراء لكل لوحة. في التجربة. لتحليل العمر الافتراضي ، من المهم التأكد من أن كل خلية تبدأ كخلية ابنة عذراء.

للقيام بذلك أولا ، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة وتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لتقسيم الخلية. إذن ما لدينا هنا هو الخلايا التي تمت محاذاتها سابقا، ويمكنك أن ترى أنه بعد ساعتين في الحاضنة، بدأت في الانقسام. والآن لدينا خلية أم ، أكبر الخلية مرتبطة بجسمها ، الخلية الابنة البكر ، وتلك الخلية الوليدة البكر هي خلية ستستخدم لبدء العمر.

إذا كانت هناك حاجة إلى وقت إضافي للسماح بإكمال انقسامات الخلايا ، فأعد اللوحة إلى الحاضنة. بدءا من خلية المصفوفة الأولى. استخدم الإبرة لفصل الخلايا الوليدة عن الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة برفق فوق الخلايا المرفقة.

من المفيد أحيانا النقر على جانب قاعدة المجهر أثناء وضع الإبرة على الخلايا. بعد ذلك ، ضع الخلية الوليدة المنفصلة في الخط الرأسي للخلايا لتحل محل الخلية الأم وأي خلايا ابنة إضافية ونقلها جانبا مؤقتا. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا الصفيف.

إذا فشلت الخلية في الانقسام، فخذ خلية ابنة من إحدى الخلايا الزائدة عن الحاجة الموضوعة بجوار خلية الاختبار. عند الانتهاء ، يجب أن يكون لديك 20 خلية ابنة لكل رقعة محاذاة عموديا على لوحة العمر الافتراضي. اجمع كل الخلايا الأم والخلايا الابنة الإضافية في كومة وانقلها مرة أخرى إلى منطقة بالقرب من البقع تسمى المقبرة.

من المهم إبقاء الخلايا غير المرغوب فيها بعيدا عن الخلايا التي تخضع لتحليل العمر الافتراضي لمنع تكوين المستعمرات الدقيقة واستنفاد العناصر الغذائية المحلية. بمجرد فصل الخلايا ، قم بتحتضن اللوحة واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين تقريبا. كرر هذه الخطوات لكل لوحة في التجربة.

لقياس سعة التكرار للخلايا الفردية، ستحتاج إلى إعداد أوراق بيانات العمر الافتراضي. يمكن أن تكون ورقة بيانات العمر الافتراضي عبارة عن شبكة بسيطة حيث يتوافق كل صف مع خلية أم فردية ويتوافق كل عمود مع نقطة عمرية. تأكد من تسمية كل ورقة بيانات وفقا لعدد السلالات المراد تحليلها.

للبدء ، أولا ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لانقسام خلوي واحد على الأقل. إذا كانت هناك حاجة إلى وقت إضافي للسماح بإكمال انقسام الخلايا ، فأعد اللوحة إلى الحاضنة. ابدأ بخلية المصفوفة الأولى على اللوحة الأولى ، وراقب بصريا الأم وابنتها أو الخلية أو الخلايا لتحديد عدد انقسامات الخلايا التي حدثت.

من السهل عموما تحديد عدد الخلايا الوليدة التي أنتجتها الأم بناء على الأنماط المميزة لترتيبات الخلايا. من السهل حقا معرفة عدد الخلايا التي أنتجتها لأن هناك خليتين هناك وهما بنفس الحجم وكلاهما أصغر من الأم. سجل عدد الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلية الأم في المربع المناسب في ورقة درجات العمر الافتراضي.

بعد ذلك ، استخدم الإبرة لفصل الخلايا الوليدة عن الخلية الأم كما هو موضح سابقا عن طريق وضع الإبرة برفق فوق الخلايا المرفقة والنقر على جانب قاعدة المجهر بينما تستقر الإبرة على الخلايا. احتفظ بالخلية الأم في موضعها في الخط الرأسي وحرك الخلية أو الخلايا الوليدة جانبا مؤقتا. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا الصفيف.

أخيرا ، اجمع كل الخلايا الوليدة المهملة وانقلها إلى المقبرة الواقعة بالقرب من البقع الأصلية. قم بتصوير اللوحة واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. كرر التخلص من الخلايا الوليدة والحضانة.

خطوة لكل لوحة في التجربة. كرر هذا الإجراء بأكمله حتى تتوقف جميع الخلايا الأم عن الانقسام. ضع في اعتبارك أنه مع تقدم الخلايا الأم في العمر ، يصبح تقدم دورة الخلية أبطأ وسيكون من المستحسن احتضان اللوحة لفترات زمنية أطول بين النقاط العمرية بعد ذلك ، ويمكن وضع الصفائح عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

البيانات الأولية التي تنتجها تجربة العمر التكاثري هي قائمة بالأرقام المقابلة للخلايا الوليدة التي تنتجها كل خلية أم في كل نقطة عمرية. كما هو موضح هنا. من خلال جمع كل صف من ورقة الدرجات ، يتم الحصول على العمر التكراري لكل خلية أم.

يمكن تجميع البيانات من الخلايا الأخرى من نفس المجموعة التجريبية لإنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة وإجراء العمليات الحسابية الإحصائية. يجب أن يكون المنحنى متسقا تقريبا مع حركية Gomperts Mac am ، حيث يظهر شكلا سينيا مع انخفاض معدل الوفيات المبكر ، يليه انخفاض سريع نسبيا في البقاء على قيد الحياة وتسطيح المنحنى في الأعمار اللاحقة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تجربة عمر تكاثري للخميرة.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخلايا ستستمر في الانقسام عندما لا تكون في البرد. لذا تذكر أن تضع الألواح على أربع درجات بين عشية وضحاها حتى لا ينتهي بك الأمر بعدد كبير جدا من الخلايا الوليدة التي لا يمكن عدها في الصباح. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.