Name: قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء. (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: اكتشف بروتوكول قياس العمر التكاثري لخلايا الخميرة الأم في أبحاث الشيخوخة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة الجينات المؤثرة على طول العمر الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال منحة لعضو الكنيست وبانكوك من مؤسسة طبية إليسون. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة. نود أن نشكر Soumya Kotireddy للحصول على المساعدة أثناء التصوير.

الجزء 1 : إعداد لوحات لسلالات والتحليل مدى الحياة تنسخي هذا المقطع يصف إعداد لوحات لYEPD صلبة لاستخدامها في فترة التجربة تنسخي الحياة وإعداد خلايا الخميرة لتحليل مدى الحياة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنية معقمة المناسبة ، وإعداد لوحات أجار YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون ، أغار 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪) التي سيتم استخدامها لزراعة خلايا الخميرة والتحليل مدى الحياة تنسخي. يجب عليك إعداد ما لا يقل عن 2 لوحات لكل سلالات 4-5 ليتم تحليلها في الحياة تجربة تمتد. وينبغي إعداد لوحات على الأقل 2 قبل أيام من حياة تمتد التجربة ، وسمح لتجف قبل البدء في فحص مدى الحياة. إذا لن تكون التجربة التي بدأت داخل 4-5 أيام من صب لوحات ، ينبغي وضعها في حاضنة مبردة وملفوفة في parafilm أو البلاستيك لمنع أصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة ومتواصلة من أجل المستعمرات واحد على لوحات أجار YEPD. يمكن بسهولة حتى 6 سلالات أن يشوبه على لوحة للYEPD نفس التقسيم في لوحة على شكل دائري أسافين الحجم على حد سواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من الخلايا الحاضنة والتصحيح من مستعمرة واحدة على صحن YEPD الطازجة. وينبغي أن يكون إنشاء اثنين من بقع اثنين من المستعمرات المختلفة لكل سلالة. في هذا الوقت ، ينبغي ترميز سلالات لتحليلها للتأكد من أداء عمر التجربة تنسخي &quot;العمياء&quot; ، حيث dissectors لا نعرف هوية من السلالات الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصححة لاحتضان ، وخلايا ترميز عند 30 درجة مئوية حتى مساء اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا والخلايا التصحيح طفيفة من كل سلالة ترميز لوحات YEPD العذبة ، والذي سيكون بمثابة لوحات تجريبية تستخدم لتحليل مدى تنسخي الحياة. وينبغي تصحيحها الخلايا على طول الخط العمودي على الجانب الأيسر من لوحة YEPD (الشكل 1). حوالي 3-5 تصحيحات في اللوحة هو الأمثل ، على افتراض تنسخي تحليل مدى الحياة في 20 من كل الخلايا التصحيح. ليس من الضروري (ولا مرغوب فيه) لنقل عدد كبير من الخلايا لوحة للYEPD جديدة ، لأن هذا سوف يسبب الخلايا لتنمو بشكل كثيف خلال الحضانة بين عشية وضحاها ، والتي قد تحد من حياتهم اللاحقة تنسخي تمتد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات مصححة حديثا بين عشية وضحاها على رأس مقاعد البدلاء. </li></ol> الجزء 2 : الخلايا المركز للحياة تنسخي التحليل مدى. في هذا القسم ونحن تصف كيفية وضع خلايا الخميرة على لوحة وكيفية الحصول على خلايا الابنة البكر للحياة تنسخي التحليل مدى. من هذه النقطة ، ينبغي parafilmed جميع لوحات ، إلا عندما تمر التشريح ، وذلك لمنع أصاب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر مزودة جهاز microdissection مناسبة للخميرة ، ونقل ما يقرب من 50 سلالة من الخلايا مصححة أولا إلى موقف وحشي على لوحة للخلايا مصححة. إذا كان لديك مجهر مرحلة متدرجة ، ويمكن استخدام هذه تدرجات لضمان الخلايا سوف يكون من السهل العثور خلال التكرار اللاحقة. على Axioscope زايس 40 ، يمكن وضع الخلايا من سلالة مصححة الأولى في إحداثيات 90 × 10 و المحتشدة عموديا من هناك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف إبرة من الخلايا عن طريق لمس سطح أغار مرارا ، ثم خلق ثقب في آغار من خلال اجبار الإبرة من خلال سطح آغار. وسوف تخدم هذه الحفرة كعلامة لتوجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الحفرة ، أو أنهم سوف تنمو وتشكل مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة فوق الحفرة ، محاذاة عموديا خلايا الخميرة الفردية إلى 20 وظيفة موزعة بالتساوي ، بأقطار الإبرة 1-3 (~ 100 ميكرومتر) بين موقف كل خلية (الشكل 1). كل خلايا قليلة ، مكان خليتين المجاورة لبعضها البعض في نفس الموضع في السطر بدلا من واحدة. وهذا يسمح لابنته البكر التكرار خلال تحديد الخلية ، إذا كان واحد من الخلايا تفشل في نقل الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين ال 10 و ال 11 في مواقف الخط ، إنشاء سلسلة أفقية من 7-8 ثقوب في أجار. هذا سوف يكون بمثابة علامة على توجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الثقوب ، أو أنها سوف تنمو وتشكل مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،4 لكل التصحيح على لوحة ، والاستمرار في مجموعة الخلايا عموديا على طول المحور نفسه. عن الخطوة 2.2 ، يجب أن يكون عدد الثقوب خلق تتوافق مع عدد التصحيح (فتحة واحدة لتصحيح الأولى ، فتحتين للمرة الثانية ، الخ.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد المحتشدة الخلايا لكل التصحيح ، parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،6 عن كل لوحة في التجربة. </li></ol> الجزء 3 : الحصول على خلايا ابنته البكر لتحليل مدى الحياة في هذا القسم ونحن الشروع في التحليل مدى الحياة من خلال ضمان أن كل خلية يبدأ بوصفها ابنة البكرالخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها خضعت لعملية انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بداية الخلية المحتشدة الأولى ، استخدام إبر لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة بلطف على الجزء العلوي من الخلايا المرفقة. ومن المفيد في بعض الأحيان للاستفادة من جانب قاعدة المجهر بينما الإبرة يستريح على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الخلية ابنة منفصلة في خط عمودي ، لتحل محل الخلايا الأم وابنتها أية خلايا إضافية ونقلها جانبا مؤقتا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.2 و 3.3 لكل من الخلايا التي تم حشدها. إذا فشل خلية لتقسيم وأخذ خلية من ابنة واحدة من خلايا زائدة المتمركزة في خطوة 2.3. عند الانتهاء ، يجب أن يكون الخلايا الوليدة 20 لكل التصحيح محاذاة عموديا على لوحة الحياة تمتد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل من الخلايا الأم وابنتها خارج الخلايا في كومة وتحويلها مرة أخرى إلى منطقة قريبة من البقع (&quot;مقبرة&quot;). فمن المهم للحفاظ على الخلايا غير المرغوب فيها بعيدا عن الخلايا التي تمر التحليل مدى الحياة لمنع تشكيل microcolonies ونضوب المواد المغذية المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،6 عن كل لوحة في التجربة. </li></ol> الجزء 4 : قياس قدرة تنسخي الخلايا الفردية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كشوف بيانات تمتد الحياة. ويمكن لصحيفة الحياة أن تكون بيانات تمتد شبكة بسيطة حيث كل صف يناظر الخلية الأم الفردية ويتوافق مع كل عمود إلى نقطة في سن (الشكل 2). تسمية كل ورقة البيانات وفقا لعدد من السلالات التي سيتم تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها قد خضعت واحدة على الأقل انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بداية الخلية الأولى في المحتشدة لوحة الأولى ، نلاحظ بصريا الخلية الأم وابنتها (ق) وتحديد عدد من الانقسامات الخلوية التي وقعت. فمن السهل عادة لتحديد عدد الخلايا ابنة الأم المنتجة ، واستنادا إلى أنماط مميزة للترتيبات الخلية. تسجيل عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في الخانة المناسبة على النتيجة ورقة تمتد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبرة لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم كما هو موضح في الخطوة 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبقاء على الخلايا الأم في موقفها في خط عمودي ونقل خلية ابنة (ق) إلى مؤقتا جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،5 في كل من الخلايا التي تم حشدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل من الخلايا الوليدة تجاهل ونقلها إلى &quot;مقبرة&quot; ، وتقع بالقرب من بقع الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm لوحة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،8 عن كل لوحة في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات حتى 4،2-4،9 كافة الخلايا الأم قد توقفت الانقسام. كما يجب على الأم خلايا السن ، وتقدم دورة الخلية تصبح أبطأ ، وسيكون من المرغوب فيه لاحتضان لوحة لفترات أطول من الوقت بين نقاط العمر. ويمكن وضع لوحات عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل. البيانات الخام التي تنتجها فترة التجربة تنسخي الحياة عبارة عن أرقام قائمة المناظرة إلى الخلايا الوليدة التي تنتجها كل خلية الأم في كل نقطة في سن (الشكل 2). عن طريق جمع كل صف من لائحة الهدافين ، يتم الحصول على عمر تنسخي لكل خلية الأم. ويمكن تجميع البيانات عن الخلايا الأم من نفس المجموعة التجريبية لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 3A) وإجراء الحسابات الإحصائية ، مثل عمر يعني ، متوسط ​​العمر ، والانحراف المعياري. يمكن إجراء اختبار غير المعلمية مثل اختبار الرتبة مجموع Wilcoxon ، لتحديد ما إذا كان تم الكشف عن اختلافات كبيرة في طول العمر بين المجموعات التجريبية. عند التجربة يعمل بشكل صحيح ، يجب أن تكون متسقة منحنى بقاء تقريبا مع إن السفارة - Makeham حركية تظهر حالات العسر الشديد السيني مع انخفاض الوفيات المبكرة اتبعت الانخفاض السريع نسبيا في البقاء على قيد الحياة والخروج من تسطيح منحنى الأعمار في وقت لاحق. معظم السلالات البرية من نوع لديها قيم تنسخي مدى الحياة في مجموعة الجيل 20-30 ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن الاختلاف من خارج هذا النطاق. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="الشكل 1.5" /> الشكل 1. رسم تخطيطي لوحة تنسخي نموذجية تمتد مدى الحياة. في المساء قبل بداية microdissection من خلايا الخميرة ، ومصححة طفيفة 3-5 سلالات على سطح لوحة YEPD (مربعات حمراء) في خط عمودي على طول جانب واحد من لوحة. في أعقاب نمو بين عشية وضحاها ، وحوالي 30 المحتشدة الخلايا الفردية من كل سلالة عموديا في خط يحتوي على 20 وظيفة. الحياة تمتد analysiسوف يتم تنفيذها على خلايا ت ق ابنته البكر التي تم الحصول عليها من هذه الخلايا الأولية. وتوضع الخلايا الإضافية التي تم الحصول عليها من خلال التجربة microdissection (مثل الخلايا غير المرغوب فيها ابنته) في &quot;مقابر&quot; (بيضاوية اللون الرمادي) ، والذي يقع بعيدا عن الخلايا التجريبية من أجل تجنب نضوب المحلية من المواد الغذائية حيث يتم تشكيل المستعمرات. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ويرد عمر تنسخي ورقة الفرز. بيانات أولية من فترة التجربة تنسخي الحياة. كل صف يناظر خلية الخميرة الأم واحدة ويقابل كل عمود إلى نقطة العمر. عدد دخلت في كل مربع هو عدد الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في تلك المرحلة العمرية. يسمى كل سلالة مع عدد مشفرة مثل أن الفرد تشريح خلايا الخميرة لا يوجد لديه معرفة هوية من السلالات التي يجري تحليلها. ويعاير العشرين الخلايا لكل سلالة. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. بقاء ممثل ومنحنيات النمو من فترة التجربة تنسخي الحياة (A) ويتم الحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة من قبل المتهم بالتآمر في جزء من الخلايا الأم لا تزال على قيد الحياة بوصفها وظيفة من العمر تنسخي (عدد انقسامات الخلية (ب) منحنيات النمو هي التي حصل عليها المتهم بالتآمر في متوسط ​​عدد الخلايا التي تنتجها ابنة سلالة معينة بوصفها وظيفة من نقطة العمر. وفي هذا المثال ، سلالة # 2 هو الأطول عمرا ولكن أبطأ نموا ، كما يتضح من انخفاض المنحدر الأولي للمؤامرة النمو.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>أجار</td><td>كاشف</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>باكتو-ببتون</td><td>كاشف</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص الخميرة</td><td>كاشف</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. الخميرة في مهدها<em&gt; السكيراء الجعوية</em&gt; قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة ، وثبت العديد من المحددات طول العمر لتكون الخميرة المحفوظة في حقيقيات النوى متعددة الخلايا ، بما فيها الديدان والذباب والفئران<sup&gt; 1</sup&gt;. وقد يعاير بسبب عدم وجود الظواهر المرتبطة بالسن كميا بسهولة ، والشيخوخة في الخميرة على وجه الحصر تقريبا من خلال قياس العمر الافتراضي للخلايا في سياقات مختلفة ، مع اثنين من نماذج مختلفة تمتد الحياة في الاستعمال الشائع<sup&gt; 2</sup&gt;. عمر زمني يشير إلى طول الفترة الزمنية التي خلية الأم يمكن أن يعيش في حالة عدم تقسيم هدوء يشبه ، ويقترح أن تكون بمثابة نموذج للشيخوخة بعد الإنقسامية الخلايا في حقيقيات النوى متعددة الخلايا. تنسخي مدى الحياة ، في المقابل ، يشير عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم قبل الشيخوخة ، ويعتقد أن تقدم نموذجا للتقدم في السن في الخلايا النشطة mitotically. هنا نقدم بروتوكول معمم لقياس مدى الحياة تنسخي من الناشئين خلايا الخميرة الأم. هدف تمتد مقايسة تنسخي الحياة لتحديد عدد مرات كل براعم الخلية الأم. يمكن أن تكون الخلايا الأم وابنتها متباينة بسهولة من قبل ذوي الخبرة الباحث باستخدام مجهر الضوء القياسية (التكبير مجموع 160X) ، مثل Axioscope زايس 40 أو نموذج آخر للمقارنة. ويتحقق الفصل المادي بين الخلايا من خلايا والدة ابنته باستخدام micromanipulator دليل مجهزة إبرة الألياف البصرية. مختبر نموذجي سلالات إنتاج خلايا الخميرة ابنة 20-30 في تجربة واحدة من الأم وعمر يتطلب 2-3 أسابيع.

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.

تُعد الشيخوخة عملية تنكسية تتميز بتدهور تدريجي في المكونات الخلوية والعضيات، مما يؤدي في النهاية إلى الوفاة. وتعتبر الخميرة المبرعمة...

لقد استُخدمت خميرة التبرعم Croce Visi على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. نقدم في هذا المقال بروتوكولاً عاماً لقياس فترة الحياة التكرارية للخلايا الأم في الخميرة. مرحباً، أنا كريستين ستيفن من مختبر برايان كينيدي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة واشنطن.سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس عمر التكاثر لخلايا الخميرة الأم. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجينات التي تؤثر على عمر خلايا الخميرة. لذا، دعونا نبدأ.من أجل تجربة عمر التكاثر وتحضير خلايا الخميرة لتحليل عمر البقاء، يجب تحضير أطباق YEPD صلبة للقيام بذلك. استخدم تقنية تعقيم مناسبة لتحضير أطباق أغار YEPD هذه. قم بتحضير طبقين على الأقل لكل أربعة إلى خمسة سلالات سيتم تحليلها في تجربة عمر البقاء.يجب تحضير هذه الأطباق قبل يومين على الأقل من تجربة مدى الحياة وتركها لتجف قبل البدء في تحليل مدى الحياة. وإذا لم تُجرَ التجربة في غضون أربعة إلى خمسة أيام من صب الأطباق، فيجب تغليفها بفيلم البارافين أو البلاستيك ووضعها في حاضنة مبردة لمنع الجفاف. أخرج سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة وقم بتخطيطها للحصول على مستعمرات مفردة.على أطباق آغار YEPD. يمكن تخطيط ما يصل إلى ست سلالات بسهولة على طبق YEPD نفسه عن طريق تقسيم الطبق إلى قطاعات متساوية الحجم على شكل قطع دائرية. تُحضن الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.بعد الحضن، أخرج الخلايا من الحاضنة وانقل خلايا من مستعمرة واحدة إلى طبق YEPD جديد. في هذه المرحلة، يجب تغطية السلالات المراد تحليلها لضمان إجراء تجربة عمر التكرار بطريقة التعمية، بحيث لا يعرف القائمون على عملية التشريح هوية السلالات الفردية.بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا المغطاة والمرقعة عند 30 درجة Celsius حتى مساء اليوم التالي. تُرفع الخلايا ويتم ترقيع الخلايا من كل سلالة مغطاة بشكل خفيف إلى أطباق YEPD جديدة. ستعمل هذه الأطباق كأطباق تجريبية تُستخدم لقياس مدى الحياة التكراري.يجب نقل خلايا التحليل على شكل بقع على طول خط عمودي في الجانب الأيسر من طبق YEPD. تجنب نقل عدد كبير جداً من الخلايا إلى طبق YEPD طازج واحد؛ حيث سيؤدي ذلك إلى نمو كثيف للخلايا أثناء الحضن طوال الليل، مما يؤثر على عمرها التكاثري، لذا فإن وضع ثلاث إلى خمس بقع تقريباً في كل طبق هو الخيار الأمثل.بافتراض أن تحليل مدى الحياة التكراري سيتم إجراؤه على 20 خلية من كل بقعة، فقد أصبح الآن إعداد تجربة مدى الحياة مكتملاً، وكل ما تبقى هو تحضينها طوال الليل على سطح المختبر. وبعد ذلك، يمكننا غداً البدء في عملية التشريح المجهري لترتيب خلايا الخميرة على الطبق والحصول على خلايا ابنة بكر من أجل تحليل مدى الحياة التكراري.استخدم مجهراً مجهزاً بجهاز تشريح دقيق مناسب للخميرة. انقل حوالي 50 خلية من السلالة في الرقعة الأولى إلى موضع على الطبق بعيداً عن الخلايا المرقعة. إذا كانت منصة المجهر مدرجة، فيمكن استخدام هذه التدريجات لضمان سهولة العثور على الخلايا خلال التكرارات اللاحقة.أحياناً قد تلتصق الخلايا بالإبرة، وهو ما قد يشكل مشكلة إذا خرجت في وقت غير مناسب. وللتأكد من نظافة الإبرة وخلوها من الخلايا، قم بلمس سطح الآجار بشكل متكرر. بعد ذلك، اصنع ثقباً في الآجار عن طريق دفع الإبرة عبر سطحه.ستعمل هذه الفتحة كعلامة لتوجيهك على الطبق خلال عمليات التشريح اللاحقة وإزالة الخلايا المنقطة. توخَّ الحذر لتجنب وصول خلايا الخميرة إلى الفتحة، وإلا فإنها ستنمو وتُشكل مستعمرة مباشرة فوق الفتحة. قم بمحاذاة خلايا الخميرة الفردية عمودياً في 20 موضعاً متباعدة بالتساوي، مع ترك مسافة تتراوح من قطر إبرة واحدة إلى ثلاثة أقطار بين كل موضع خلية والآخر.لكل بضع خلايا، ضع خليتين بجانب بعضهما البعض في نفس الموضع من الخط بدلاً من خلية واحدة. يتيح ذلك وجود فائض أثناء عملية اختيار الخلايا البنوتية العذراء. إذا فشلت إحدى الخلايا المنقولة في الانقسام بين الموضع العاشر والحادي عشر في الخط، فقم بعمل سلسلة أفقية من سبع إلى ثماني ثقوب في الآجار.سيعمل هذا كعلامة لتوجيهك على الطبق أثناء عمليات التشريح اللاحقة وإزالة الخلايا الوليدة. ومرة أخرى، توخَّ الحذر لتجنب وصول خلايا الخميرة إلى الثقوب، وإلا فإنها ستنمو وتشكل مستعمرة. كرر هذا الإجراء لكل بقعة على الطبق، مع الاستمرار في ترتيب الخلايا رأسياً على طول المحور نفسه.من المهم تذكر أنه عند إنشاء الثقوب في AER، يجب أن يتوافق عدد الثقوب المنشأة مع رقم الرقعة، بحيث يكون هناك ثقب واحد للرقعة الأولى، وثقبان للثقوب الثانية. بمجرد توزيع الخلايا لكل رقعة، قم بتغطية الطبق بغشاء parafilm وحضنه عند 30 °C لمدة ساعتين تقريبًا. تذكر أنه من هذه النقطة فصاعدًا، يجب تغطية جميع الأطباق بغشاء parafilm باستثناء الأوقات التي يتم فيها التشريح.من أجل منع الجفاف، كرر هذا الإجراء لكل طبق. في التجربة، ومن أجل تحليل طول العمر، من المهم التأكد من أن كل خلية تبدأ كخلية ابنة عذراء.للقيام بذلك، ابدأ بإخراج الأطباق من الحاضنة والتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لانقسام خلوي. ما لدينا هنا هي خلايا تم محاذاتها مسبقاً، ويمكنكم ملاحظة أنها بدأت في الانقسام بعد مرور ساعتين في الحاضنة. والآن لدينا الخلية الأم، وهي الخلية الأكبر المتصلة بجسمها، والخلية البنت البكر، وهذه الخلية البنت البكر هي الخلية التي ستُستخدم لبدء قياس فترة الحياة.إذا كانت هناك حاجة إلى وقت إضافي للسماح باكتمال انقسامات الخلايا، فقم بإعادة الطبق إلى الحاضنة. بدءاً من خلية المصفوفة الأولى، استخدم الإبرة لفصل الخلايا الوليدة عن الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة برفق فوق الخلايا الملتصقة.قد يكون من المفيد أحياناً النقر على جانب قاعدة المجهر بينما تكون الإبرة مستقرة على الخلايا. بعد ذلك، ضع الخلية الوليدة المنفصلة في الخط الرأسي للخلايا لتحل محل الخلية الأم وأي خلايا وليدة إضافية، مع تحريك هذه الأخيرة جانباً بشكل مؤقت. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا المصفوفة.إذا فشلت خلية في الانقسام، فخذ خلية بنوية من إحدى الخلايا الفائضة الموجودة بجوار الخلية المختبرة. عند الانتهاء، يجب أن يكون لديك 20 خلية بنوية لكل رقعة مصطفة رأسيًا على لوحة قياس فترة الحياة. اجمع كل الخلايا الأم والخلايا البنوية الإضافية في كومة واحدة وانقلها مرة أخرى إلى منطقة بالقرب من الرقع تسمى المقبرة.من المهم إبقاء الخلايا غير المرغوب فيها بعيدة عن الخلايا التي تخضع لتحليل مدى الحياة لمنع تكون مستعمرات دقيقة واستنزاف العناصر الغذائية المحلية. بمجرد فصل الخلايا، أخرجها من الطبق واحضنها عند 30 درجة Celsius لمدة ساعتين تقريبًا. كرر هذه الخطوات لكل طبق في التجربة.لقياس القدرة التكرارية للخلايا الفردية، ستحتاج إلى إعداد أوراق بيانات فترة الحياة. يمكن أن تكون ورقة بيانات فترة الحياة عبارة عن شبكة بسيطة حيث يمثل كل صف خلية أم فردية ويمثل كل عمود نقطة عمرية. تأكد من تسمية كل ورقة بيانات وفقاً لعدد السلالات المراد تحليلها.للبدء، قم أولاً بإخراج الأطباق من الحاضنة وتحقق من أن معظم خلايا المصفوفة قد خضعت لانقسام خلوي واحد على الأقل. إذا كانت هناك حاجة لمزيد من الوقت للسماح باكتمال الانقسام الخلوي، فأعد الطبق إلى الحاضنة. ابدأ بأول خلية في المصفوفة على الطبق الأول، وراقب بصرياً الخلية الأم والخلية أو الخلايا الابنة لتحديد عدد الانقسامات الخلوية التي حدثت.من السهل عموماً تحديد عدد الخلايا الوليدة التي أنتجتها الخلية الأم بناءً على الأنماط المميزة لترتيب الخلايا. من البسيط جداً هنا معرفة عدد الخلايا التي تم إنتاجها لوجود خليتين هناك، وهما من نفس الحجم وكلاهما أصغر من الخلية الأم. سجل عدد الخلايا الوليدة التي أنتجتها الخلية الأم في المربع المناسب في ورقة تسجيل مدة الحياة.بعد ذلك، استخدم الإبرة لفصل الخلايا البنوية عن الخلية الأم كما وُصف سابقاً، وذلك بوضع الإبرة برفق فوق الخلايا الملتصقة والنقر على جانب قاعدة المجهر بينما تستقر الإبرة على الخلايا. حافظ على وضع الخلية الأم في الخط العمودي وحرك الخلية البنوية أو الخلايا البنوية جانباً بشكل مؤقت. كرر هذه الخطوات لكل خلية من خلايا المصفوفة.أخيراً، اجمع كل الخلايا الوليدة المستبعدة وانقلها إلى منطقة التخلص الموجودة بالقرب من البقع الأصلية. غلف الطبق بفيلم Para film ثم حضنه عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات. كرر عملية استبعاد الخلايا الوليدة والتحضين.الخطوة لكل طبق في التجربة. كرر هذا الإجراء بالكامل حتى تتوقف جميع الخلايا الأم عن الانقسام. ضع في اعتبارك أنه مع تقدم الخلايا الأم في السن، يصبح تقدم الدورة الخلوية أبطأ، وسيكون من المرغوب فيه تحضين الطبق لفترات زمنية أطول بين نقاط العمر، وبعد ذلك، يمكن وضع الأطباق في درجة حرارة 4 °C طوال الليل.تتمثل البيانات الخام الناتجة عن تجربة عمر التكاثر في قائمة من الأرقام التي تقابل الخلايا الوليدة التي أنتجتها كل خلية أم عند كل نقطة زمنية من العمر، كما هو موضح هنا. ومن خلال جمع كل صف في ورقة تسجيل الدرجات، يتم الحصول على عمر التكاثر لكل خلية أم.يمكن تجميع البيانات من خلايا أخرى من نفس المجموعة التجريبية لإنشاء منحنى بقاء وإجراء الحسابات الإحصائية. يجب أن يكون المنحنى متوافقاً تقريباً مع حركيات Gomperts Mac am، بحيث يظهر شكلاً سينياً (sigmoidal) يتميز بانخفاض الوفيات في المراحل المبكرة، يليه انخفاض سريع نسبياً في معدل البقاء، ثم استواء المنحنى في الأعمار المتقدمة. لقد قدمنا لكم الآن كيفية إجراء تجربة عمر التكاثر في الخميرة.عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر أن الخلايا ستستمر في الانقسام طالما أنها ليست في بيئة باردة. لذا، تذكر وضع الأطباق عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل حتى لا ينتهي بك الأمر بعدد كبير جداً من الخلايا الوليدة التي يصعب عدّها في الصباح. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة من الديدان الخيطية حافظت على وسائل الإعلام متينة مع الأشعة فوق البنفسجية قتل الغذائي الجرثومي.

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

الشيخوخة في الخميرة الزمني يشير الى فقدان قابلية الخلايا المرتبطة بها مع مرور الوقت في مرحلة ثابتة. نحن هنا وصف أسلوب الإنتاجية العالية لتحديد كميا مدى الحياة الخميرة زمني.

قياس سبان الخميرة الحياة الزمني بواسطة خلايا ثمرة المسنين

في هذا البروتوكول نقدم طريقة...

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات الحمض النووي الطفرة التي يمكن دمجها مع نموذج الخميرة عمر زمني لدراسة الجينات / المسارات التي تنظم أو تساهم في عدم الاستقرار الجيني DNA أثناء الشيخوخة.

دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

يصف هذا الفيديو طريقة تقليدية قائمة على الألواح لقياس عمر C. ايليجانس. يقيس بروتوكول المثال عمر الديدان المعالجة بالحمض النووي الريبي.

تحليل العمر: قياس C. ايليجانس طول العمر

نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.

المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل لإنتاج رقائق ميكروفلويديك وإعداد التجارب الموائع الدقيقة لقياس عمر والظواهر الخلوية من خلايا الخميرة واحدة.

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

هنا يصف لنا طريقة "مجموعة النسخ المتماثلة"، ونهج لقياس كمي C. ايليجانس عمر/البقاء وهيلثسبان بطريقة الفائق وقوية، مما يتيح فحص ظروف كثيرة دون التضحية بجودة البيانات. هذا البروتوكول تفاصيل الاستراتيجية ويوفر أداة حاسوبية لتحليل البيانات "مجموعة النسخ المتماثلة".

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

هنا هو بروتوكول لتحديد التفاعلات الجينية من خلال زيادة عدد الشاشة عدد في Saccharomyces cerevisiae. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتحديد واستنساخ واختبار القامع في المسوخ الخميرة قصيرة الأجل. نحن اختبار تأثير زيادة عدد نسخة من SIR2 على عمر في متحولة فارغة autophagy.

شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

وصفنا بروتوكولين متكاملين لتحديد مدة الطور S بدقة في S. cerevisiae باستخدام EdU ، وهو نظير ثيميدين ، والذي تم دمجه في الجسم الحي واكتشافه باستخدام كيمياء النقر عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. يسمح بالتوصيف السهل لمدة تكرار الحمض النووي وعيوب النسخ المتماثل التي تم التغاضي عنها في الطفرات.

تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae

اكتشف بروتوكول قياس العمر التكاثري لخلايا الخميرة الأم في أبحاث الشيخوخة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة الجينات المؤثرة على طول العمر الخلوي.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

استكشف المزيد من الفيديوهات