بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة

مرحبا ، أنا نيكيتا آري من مختبر رالف بوير في برنامج التنمية والشيخوخة في معهد بورنهام للأبحاث الطبية. أنا جيل لر أيضا من المختبر السفلي. سنعرض لك اليوم إجراءات وضع العلامات الفلورية على هياكل قلب لافال والقلب قبل الشمس للبالغين.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لإعداد أنابيب القلب للتحليل المورفولوجي والهيكلي عبر الفحص المجهري متحد البؤر أو الفلورسنت من أجل تسمية هياكل القلب بالفلورسنت في ذبابة الفاكهة البالغة. أولا ، قم بعمل قطع واحد بين الصدر والبطن في شخص بالغ شبه سليم لفصل أجزاء الجسم. ثم تقليم الحواف البطنية المتدلية للبشرة البالغة.

بعد ذلك ، قم بنقل وتصنيف عينات اليرقات البالغة أو التشريح بالأجسام المضادة الأولية والثانوية. بعد وضع العلامات ، تم غسل العينات البالغة عن طريق إمساك حواف البشرة ووضعها على جانب القلب لأسفل على قطرة من الدرع المتجه على زلة الغطاء ، اقلب زلة الغطاء على قطرة من الوسط محاطة بزلقتين للغطاء على شريحة لتشكيل جسر. مع تعليق القلوب الآن في وضع مستقيم لتركيب قلوب اليرقات.

انقل العينات إلى شريحة بحيث تكون الجوانب البطنية متجهة لأسفل ، وقم بتركيب زلتين للغطاء على جانبي الشريحة. أخيرا ، قم بتشكيل جسر مع زلة غطاء ثالثة عن طريق وضعه أولا على زلة الغطاء بالقرب من الأطراف الخلفية لليرقات. القلوب جاهزة الآن للتصوير.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد المخزن المؤقت التالي لاسترخاء DH يحتوي على A DH كما هو موضح في بروتوكول فيديو آخر في هذه السلسلة مع مثبت EGTA 10 مللي مولار يتكون من 4٪ فورمالديهايد في واحد X-P-B-S-P-B-S ، TX ، والأجسام المضادة الأولية المخففة بشكل مناسب والأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورسنت. في PBS TX ، قم بتشريح ذبابة الفاكهة البالغة واليرقة لفضح أنابيب القلب بعد ذبابة الفاكهة شبه السليمة ، كما هو موضح في بروتوكولات الفيديو التي تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة وذبابة الفاكهة ، بروتوكول تشريح NMJ. ولكن مع التعديلات ، استخدم DH المؤكسج أثناء تشريح اليرقة وقم بإزاحة المسامير الخلفية قليلا من يرقة خط الوسط البطني.

قطع على طول خط الوسط البطني. لا تقم بإزالة أي أنسجة قبل التثبيت في الخطوات التالية. ابدأ إجراء وضع العلامات عن طريق التحقق تحت المجهر من أن جميع القلوب تتقلص بشكل إيقاعي وتسترخي في DH المؤكسج. ثم استبدل DH بسرعة بمخزن مؤقت مريح وأعد فحص كل أنبوب قلبي للتأكد من تثبيط الانقباضات.

تابع إصلاح القلوب عن طريق استبدال المخزن المؤقت المريح بالمثبت. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع رج لطيف. لاحظ أنه بالنسبة لمستحضرات اليرقات ، فإن الاهتزاز ليس ضروريا في أي خطوة وقد يضر بسلامة أنسجة القلب.

في نهاية 20 دقيقة ، قم بإزالة المثبت وغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام P-B-S-T-X. في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز المستمر للبالغين ، قم بعمل قطع واحد بين البطن والصدر بعناية ونظيفة. افصل كلا الجزأين من الجسم لضمان الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالمنطقة الأمامية من القلب.

احرص على عدم قطع الجزء الأمامي من البطن حيث توجد الغرفة المخروطية للقلب. افحص العينة تحت المجهر للتأكد من إجراء قطع نظيف. بعد ذلك ، قم بقص أي حواف بطنية متدلية لبشرة البطن بعناية ، بحيث يكون ما تبقى أكثر بيضاوية الشكل وأقل استدارة.

بالنسبة لقلوب اليرقات التي تستخدم ملقطا دقيقا ، قم بإزالة الجسم الدهني بعناية. نفذ هذا بحذر شديد. نظرا لأن قلب اليرقات هش بشكل خاص ولديه القليل جدا من الدعم من العضلات الأخرى أو الأنسجة الضامة ، فلا تقم بإزالة فروع القصبة الهوائية لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف القلب.

بعد ذلك ، احتضن الجسم المضاد الأساسي ، الذي يتم تخفيفه في PVS TX ويتم توزيعه عند 50 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 96 بئر. بالنسبة للذباب البالغ ، أمسك البشرة الظهرية المشذبة من الحواف دون لمس أنبوب القلب الموجود في المنتصف وانقله إلى اللوحة. لا تضع أكثر من 12 عينة لكل بئر وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع التحريك المستمر.

أمسك عينات اليرقات من الحافة باستخدام ملقط وانقلها إلى P-B-S-T-X مملوءة. حسنا مرة أخرى ، لا تهز عينات اليرقات في نهاية الحضانة. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي.

اغسل القلوب ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 100 ميكرولتر P-B-S-T-X في درجة حرارة الغرفة بعد الغسيل الأخير عند 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي في PBS tx مع Alexa 5 9 4 Phin. احتفظ بالعينات مغطاة لمنع تبييض الفلورو الرابع من الآن فصاعدا واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل القلوب ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 100 ميكرولتر من P-B-S-T-X في درجة حرارة الغرفة.

أخيرا ، قم بإزالة TRITTON X 100 عن طريق شطف القلوب في 100 ميكرولتر من PBS لمدة 10 دقائق. يمكن تخزين العينات في الظلام عند أربع درجات مئوية لعدة أيام قبل تركيبها. أولا ، قم بإعداد الشريحة للتركيب.

ضع ثلاث قطرات متباعدة بشكل متساو. 10 قطرات ميكرولتر من وسط تركيب درع المتجه على المجهر. قم بوضع انزلاقين مقاس 18 × 18 ملم على القطرات الخارجية ، مما يحافظ على انزلاق الغطاء بحوالي 10 إلى 15 ملم.

بالإضافة إلى ذلك ، ضع 20 ميكرولترا من درع ناقل الحركة في وسط زلة الغطاء الثالثة. بعد ذلك ، أمسك الذبابة البالغة المقطعة من الحواف القصوى للبشرة. لإزالته بعناية من محلول الغسيل PVS، ضعه برفق مع وضع جانب القلب لأسفل على قطرة وسط التثبيت على زلة الغطاء الثالثة بما لا يزيد عن خمسة قلوب لكل قطرة على زلة الغطاء.

بعد وضع القلوب على القطرة ، الموجودة على زلة الغطاء ، تحقق تحت المجهر للتأكد من أن جميع القلوب متجهة لأسفل. الآن اقلب زلة الغطاء بعناية مع القلوب وضعها بسرعة على الشريحة التي تحمل زوج زلات الغطاء بحيث تندمج قطرة زلة الغطاء المقلوبة التي تحتوي على أنابيب القلب مع قطرة درع المتجه التي تستريح في الفراغ بين زلات الغطاء. إقران بهذه الطريقة ، تشكل زلات الغطاء الثلاثة جسرا.

سيتم تعليق القلوب بين زلة الغطاء الأوسط والمجهر. انزلق أسفل الجسر ، وتحقق تحت المجهر للتأكد من أن قلوب الذباب البالغة متجهة الآن لأعلى باستخدام طلاء الأظافر. إصلاح زلات الغطاء عند حوافها.

القلوب جاهزة الآن للتصوير عبر الفحص المجهري الفلوري أو متحد البؤر. لتركيب قلوب اليرقات ، ضع قطرة من حوالي 20 ميكرولتر من درع BTA على شريحة مجهرية باستخدام ملقط دقيق. أمسك اليرقات على حواف البشرة وانقلها بعناية إلى القطرة.

قم بتوجيه الجانب الظهري لليرقات لأسفل باستخدام إبر التنغستن. ضع ما يصل إلى يرقتين على شريحة واحدة. بعد ذلك ، اسحب كل عينة من وسط التثبيت وقم بمحاذاة اليرقات بالتوازي.

ضع زلة غطاء على كل جانب من القلوب المحاذاة باستخدام الملقط. ضع زلة غطاء ثالثة في الأعلى أولا عن طريق وضع جانب واحد على زلة الغطاء الأمامي وخفضها لأسفل إلى زلة الغطاء الخلفي. وبالتالي تشكيل جسر.

سوف تتسبب القوى الشعرية في تدفق الدرع الناقل من الخلف إلى الأمام ، مما يساعد على المحاذاة الصحيحة لقلب اليرقات. أخيرا ، قم بتثبيت جميع زلات الغطاء في مكانها عند حوافها باستخدام طلاء الأظافر واملأ الفراغ بين زلات الغطاء بعناية ب 20 إلى 30 ميكرولترا من ختم الدرع المتجه بطلاء الأظافر وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية للتخزين على المدى القصير أو عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لفترة أطول من الوقت. عند تنفيذها بشكل صحيح ، يجب أن تظل جميع المكونات والأنسجة المرتبطة بها في الوعاء الظهري سليمة وأن يتم تصورها بسهولة.

يجب أن يكون مضان الخلفية ضئيلا للبالغين. تلطخ طبقة العضلات الطولية البطنية جيدا وتنتج إشارة كبيرة. ومع ذلك ، فإن خلايا عضلة القلب الدائرية الأساسية لا تميل إلى إنتاج إشارة شديدة مثل تلك التي تأتي من الطبقة البطنية العلوية.

الخلايا العضلية في الغرفة المخروطية الأمامية للقلب البالغ على كمية كبيرة من المواد المقلصة ، وبالتالي ، تظهر هذه المنطقة على أنها الأكثر قوة بالنسبة لبقية الأنبوب القلبي. تظهر صورة قلب اليرقات ترتيبا ليفي عضلي متصاعدا. على غرار تلك الخاصة بخلايا عضلة القلب المقلصة للبالغين ، لقد أظهرنا للتو بروتوكولك لإعداد وتلطيخ القلوب البيضاوية للفحص المجهري الفلوري ومتحد البؤر.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحد من أي معالجة غير ضرورية. سيضمن ذلك بنية قلبية سليمة ومحفوظة بشكل أفضل. يعمل هذا البروتوكول فقط كنقطة انطلاق.

كما هو الحال مع أي كيمياء مناعية أخرى ، تتطلب الأجسام المضادة المختلفة ظروفا مختلفة وتحتاج إلى تحسينها بشكل فردي. هذا كل شيء. شكرا للمشاهدة ونتمنى لك السعادة في تلطيخك.