A Perifusion جزيرة متعدد حدودي النظام داخل جهاز ميكروفلويديك Perifusion

سنقدم في هذا العرض نظام تروية للمناطق المجهرية يعتمد على الموائع الدقيقة للقياس المتزامن لإفراز الإنسولين الديناميكي، وتدفق الكالسيوم، وتغيرات الجهد الميتوكوندري لجزر البنكرياس استجابةً لمحفزات إفراز الإنسولين. يتكون نظام التروية من جهاز موائع دقيقة ثلاثي الطبقات، ومضخات حقن، وجهاز جمع أجزاء للإنسولين. ويتم تصوير تدفق الكالسيوم والجهد الميتوكوندري الناجم عن محفزات إفراز الإنسولين باستخدام إعداد مجهر فلوري.

مرحباً، اسمي أولا، باحثة من مختبر الدكتور Val Holter في قسم جراحة زراعة الأعضاء بجامعة إلينوي في شيكاغو. مرحباً، أنا دون لي، أيضاً من مختبر أكتوبر. مرحباً، أنا تريشيا هارت، أيضاً من مختبر الدكتور Al Holster.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير المتزامن للجفون باستخدام تدرج غلوكوز خطي. لقد استخدمنا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مرئيات ووظائف الجفون. لذا، فلنبدأ.

يتكون الجهاز الموائع الدقيقة المستخدم في هذا الإجراء من ثلاث طبقات من مادة PDMS المعالجة والتي تم إنتاجها بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. تحتوي الطبقة الأولى الناتجة عن قالب سيليكوني على آبار جهاز الموائع الدقيقة التي ستثبت العيينات بلطف في مكانها، وبعمق 150 micrometers وقطر 500 micrometers. أما الطبقة الثانية فتحتوي على قنوات بارتفاع 500 micrometers وعرض two millimeters.

يتم توسيع منتصف القناة لتوزيع التدفق من أجل تحسين تبادل المحلول. وداخل الجهاز، يتم إنشاء بئر التبادل عن طريق ثقب فتحة بارتفاع 3 mm وعرض 7 mm في منتصف الطبقة. أما الطبقة الثالثة فهي عبارة عن شريحة سميكة من PDMS. ولتحضير هذه الطبقة، يتم ثقب فتحات صغيرة على كلا الجانبين بحيث تتماشى مع مدخل ومخرج القناة.

بالنسبة للطبقة الثانية، وبمجرد إنشاء الطبقات الثلاث جميعاً، يتم ربط الطبقة الأولى بشريحة زجاجية بحيث تكون الآبار متجهة للأعلى. ثم يتم ربط الطبقة الثانية بالطبقة الأولى مع توجيه تباعد القنوات للأعلى. وأخيراً، يتم ربط الطبقة الثالثة بالطبقة الثانية.

بمجرد ربط الطبقات، يصبح الجهاز جاهزاً للاستخدام في التجارب. باستخدام محقنة سعة 10 milliliter مملوءة بـ 70%ethanol ومتصلة بفتحة الإدخال في الجهاز بواسطة أنابيب Tai، يتم تعقيم الجهاز الموائع دقيقة عن طريق تمرير ethanol عبر قنوات الجهاز. بعد ذلك، وباستخدام نفس الإعداد، يتم تمرير الماء منزوع الأيونات لغسل ethanol.

بمجرد تعقيم الجهاز، ضعه على منصة مجهر مسخنة باستخدام أنابيب tigon، وقم بتوصيل مضخات الحقن التي تحتوي على محاليل جلوكوز عالية ومنخفضة التركيز بموصل على شكل Y. ثم قم بتوصيلها بمدخل الجهاز الموائع دقيقة (microfluidic device). وصِل مخرج الجهاز الموائع دقيقة بجهاز تجميع الأجزاء (fraction collector).

تأكد من وضع الأنابيب على لوح تسخين بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. من المهم جداً الحفاظ على المحاليل في درجة الحرارة الفسيولوجية طوال فترة التجربة. بعد ذلك، استخدم برنامج lab view لبدء تدريج الجلوكوز الذي سيتم ضخه عبر الشبكة الموائعية الدقيقة أثناء التجربة.

يعمل هذا البرنامج على تغيير معدل تدفق محلولين من الجلوكوز. ومن خلال التحكم في مضخات المحاقن، يمكن إنشاء أنماط مختلفة من تدرجات الجلوكوز هنا، بما في ذلك أنماط تدرج خطية، وجرسية الشكل، ومربعة الشكل. وفي هذه التجربة، تُعرض القيم المتوقعة المحسوبة للمقارنة، حيث سيتم استخدام تدرج خطي للجلوكوز من 2 millimolar إلى 25 millimolar بمعدل تدفق متغير يبلغ 0.01 milliliters per minute لمحلولي الجلوكوز، ومعدل تدفق ثابت قدره 0.25 milliliters per minute يدخل إلى الجهاز بعد خلط المحاليل.

بمجرد اختيار ملف التدرج المناسب، اختبر استقرار التدرج. أولاً، ابدأ تشغيل نظام التدرج. ثم ابدأ تشغيل مجمع الكسور واجمع ثماني كسور في أنابيب eend orph سعة 1 mL.

بعد ذلك، وباستخدام مقياس الغلوكوز، اختبر تركيز الغلوكوز في كل أنبوب باستخدام برنامج excel. قم بتحليل النتائج التي تم الحصول عليها من مقياس الغلوكوز. تالياً، استبدل سرنجة الغلوكوز بتركيز عالٍ بسرنجة تحتوي على محلول 0.5% BSA في محلول كريبس رينجر المنظم، ثم قم بعملية PERFUSE لـ 50 milliliters عبر الجهاز بمعدل 1 milliliter في الدقيقة.

سيمنع هذا الامتصاص غير النوعي للإنسولين على جدران القناة الدقيقة لضمان الدقة عند قياس مستويات الإنسولين المفرزة لاحقًا بعد التروية باستخدام BSA. استبدله بمحلول الجلوكوز عالي التركيز reus. علّق من 25 إلى 30 من عينات eyelets الفأر المختارة يدويًا في محلول Krebs ringer buffer يحتوي على 2 mM جلوكوز وصبغة مؤشر الكالسيوم fira 2:00 AM وصبغة مؤشر الجهد الميتوكوندري rumine 1 2 3، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

بعد التحضين، افصل الجهاز عن نظام التروية وقم بتحميل الجزر بدقة في الجهاز الموائع الدقيقة عن طريق إدخال طرف الماصة، الذي يحتوي على الجزر، في فتحة المدخل، وتوزيع الجزر ببطء؛ بعد التحميل، أعد توصيل الجهاز بنظام التروية، مع توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات الهواء. بعد ذلك، قم بتشغيل مضخة المحقنة لبدء تروية الجزر بمحلول KRB الذي يحتوي على 2mM من الجلوكوز.

ستعمل هذه الخطوة على غسل الصبغة الزائدة من الوسط، وتحديد مجموعات مرشحات الإثارة والانبعاث وأوقات التعرض التي سيتم استخدامها أثناء التجربة. ثم اضبط جامع الأجزاء لجمع العينات على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة أثناء استخدام العيون مع محلول الجلوكوز المنخفض. استخدم أداة المنطقة ذات الأهمية أو ROI من برنامج تصوير PCI البسيط لتحديد المناطق أو العيون التي ترغب في تصويرها.

كذلك، قم بتحديد منطقة الخلفية التي سيتم طرحها بعد غسل الخلايا لمدة 10 دقائق، ثم ابدأ تشغيل مجمع أجزاء تدرج الجلوكوز وباشر بالتصوير الزمني المتقطع. بعد 30 دقيقة، قم بإيقاف تشغيل البرنامج ومضخة حقنة الجلوكوز العالي. استمر في التروية باستخدام الجلوكوز المنخفض لغسل آثار الجلوكوز العالي.

بعد مرور 10 دقائق، أوقف تدفق الجلوكوز المنخفض عن طريق إيقاف تشغيل مضخة المحقنة. بعد عملية التروية، قم بتصدير البيانات إلى برنامج excel للتحليل. يمكن تحديد كمية الإنسولين المفرزة في سائل التروية باستخدام ELA mouse eyelets.

تم إجراء التروية بتدرج خطي من الغلوكوز يتراوح من 2 إلى 25 millimolar كما هو موضح هنا. يتم تحفيز تدفق الكالسيوم وإفراز الإنسولين بعد حوالي 13 دقيقة من التروية، وهو ما يتوافق مع 6 millimolar من الغلوكوز. أما التغيرات في الجهود الميتوكوندرية فتظهر في وقت أبكر، كما هو متوقع عند حوالي 11 دقيقة.

توضح هذه البيانات ميزة استخدام هذه الشبكة للموائع الدقيقة في توصيف فسيولوجيا العوينات. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية استخدام جهازنا للموائع الدقيقة للتروية المتوازية لدراسة فسيولوجيا العوينات. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التأكد من عدم وجود فقاعات في الجهاز، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحرك العوينات أثناء التجربة.

علاوة على ذلك، يمكن ضبط التدفق ليصل إلى 1 ml في الدقيقة دون التأثير على العروات. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.