A Perifusion جزيرة متعدد حدودي النظام داخل جهاز ميكروفلويديك Perifusion

في هذا العرض التقديمي ، سنقدم نظام تروية الجفن القائم على الموائع الدقيقة للقياس المتزامن لإفراز الأنسولين الديناميكي ، وتدفق الكالسيوم ، والتغيرات المحتملة في الميتوكوندريا لثقوب البنكرياس استجابة للكلاب التي تفرز الأنسولين. يتكون نظام التروية من جهاز ميكروفلويديك ثلاثي الطبقات ومضخات حقنة وأنسولين مجمع الكسر. يتم تصوير تدفق الكالسيوم الناجم عن الإفرازات وإمكانيات الميتوكوندريا باستخدام إعداد المجهر الفلوري.

مرحبا ، اسمي علا ، والر من مختبر الدكتور فال هولتر في قسم جراحة زراعة الأعضاء بجامعة إلينوي في شيكاغو. مرحبا ، أنا دون لي ، أيضا من مختبر أكتوبر. مرحبا ، أنا تريشيا هارت ، أيضا من مختبر هولستر Dr.Al.

سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير الجفن المتزامن باستخدام تدرج الجلوكوز الخطي. استخدمنا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مرئيات العيينة ووظيفتها. لذلك دعونا نبدأ.

يتم تجميع جهاز الموائع الدقيقة المستخدم في هذا الإجراء من ثلاث طبقات من PDMS المعالجة الناتجة عن الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. تحتوي الطبقة الأولى التي تم إنشاؤها من سيد السيليكون على آبار جهاز الموائع الدقيقة الذي سيثبت الثقوب برفق في مكانها ، بعمق 150 ميكرومتر وقطرها 500 ميكرومتر. تحتوي الطبقة الثانية على قنوات يبلغ ارتفاعها 500 ميكرومتر وعرضها ملليمترين.

يتم توسيع منتصف القناة لنشر التدفق من أجل تبادل أفضل للمحلول داخل الجهاز ، في المقابل يتم عمل جيد عن طريق ثقب ثقب يبلغ ارتفاعه ثلاثة ملليمترات وعرضه سبعة ملليمترات في منتصف الطبقة. الطبقة الثالثة عبارة عن لوح سميك من PDMS. لتحضير هذه الطبقة ، قم بعمل ثقوب صغيرة على كلا الجانبين تتماشى مع مدخل ومخرج القناة.

في الطبقة الثانية ، بمجرد إنشاء الطبقات الثلاث ، يتم ربط الطبقة الأولى بشريحة زجاجية مع توجيه الآبار لأعلى. ثم يتم ربط الطبقة الثانية بالطبقة الأولى مع تباعد القناة. أخيرا ، يتم ربط الطبقة الثالثة بالطبقة الثانية.

بمجرد ربط الطبقات ، يصبح الجهاز جاهزا للاستخدام في التجارب. باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر مملوءة بنسبة 70٪ من الإيثانول ومتصلة بمنفذ مدخل الجهاز باستخدام Tai على الأنابيب ، قم بتعقيم جهاز الموائع الدقيقة عن طريق تدفق الإيثانول عبر قنوات الجهاز. ثم باستخدام نفس تدفق الإعداد ، الماء منزوع الأيونات لغسل الإيثانول.

بمجرد تعقيم الجهاز ، ضعه على مرحلة مجهر ساخن باستخدام أنبوب tigon ، وقم بتوصيل مضخات الحقن التي تحتوي على محاليل الجلوكوز العالية والمنخفضة بموصل Y. ثم قم بالاتصال بمدخل جهاز الموائع الدقيقة. قم بتوصيل مخرج جهاز الموائع الدقيقة بمجمع الكسر.

تأكد من أن الأنبوب يستقر على لوح تسخين 37 درجة مئوية. من المهم جدا الحفاظ على المحاليل في درجة حرارة فسيولوجية طوال التجربة. بعد ذلك ، استخدم برنامج عرض المختبر لبدء تدرج الجلوكوز الذي سيتم نقله عبر شبكة الموائع الدقيقة أثناء التجربة.

يغير هذا البرنامج معدل تدفق محلولي الجلوكوز. من خلال التحكم في مضخات الحقن ، يمكن إنشاء ملفات تعريف تدرج الجلوكوز المختلفة هنا ، ملامح تدرج الجلوكوز الخطي على شكل جرس ومربع الشكل. بالمقارنة مع القيم المتوقعة المحسوبة الموضحة في هذه التجربة ، سيتم استخدام التدرج الخطي من اثنين من مللي مولار إلى 25 ملليمولار جلوكوز بمعدل تدفق متغير يبلغ 0.01 ملليلتر في الدقيقة من محلولي الجلوكوز ومعدل تدفق ثابت يبلغ 0.25 ملليلتر في الدقيقة يدخل الجهاز بعد خلط المحاليل.

بمجرد تحديد ملف تعريف التدرج المناسب، اختبر استقرار التدرج. أولا ، ابدأ نظام التدرج. ثم ابدأ مجمع الكسر واجمع ثمانية في مليلتر واحد أنابيب orph.

ثم باستخدام جهاز قياس السكر ، اختبر تركيز الجلوكوز في كل أنبوب باستخدام Excel. تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من جهاز قياس السكر بعد ذلك ، استبدل حقنة الجلوكوز العالية بحقنة تحتوي على محلول BSA بنسبة 0.5٪ في عازلة Krebs ringer PERFUSE 50 مل من خلال الجهاز بمعدل مليلتر واحد في الدقيقة.

سيمنع ذلك الامتصاص غير المحدد للأنسولين على جدران القنوات الدقيقة لضمان الدقة عند قياس مستويات الأنسولين المفرز لاحقا بعد التروية باستخدام BSA. استبدله بمحلول الغلوكوز العالي reus. قم بتعليق 25 إلى 30 ثقوب فأر منتقاة بعناية في مخزن جرس جرس كريبس بسعة مللي من الجلوكوز يحتوي على صبغة مؤشر الكالسيوم في الساعة 2:00 صباحا وصبغة مؤشر إمكانات الميتوكوندريا الرومين 1 2 3 ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، افصل الجهاز عن نظام التروية وقم بتحميل الثقوب بعناية في جهاز الموائع الدقيقة عن طريق إدخال طرف الماصة ، التي تحتوي على الجزر في منفذ المدخل ، وتوزيع الجزر ببطء بعد التحميل ، وأعد توصيل الجهاز بنظام التروية. توخي الحذر من إدخال الفقاعات. بعد ذلك ، ابدأ مضخة الحقنة لبدء نفخ الثقوب باستخدام KRB الذي يحتوي على اثنين من الجلوكوز المليمول.

ستقوم هذه الخطوة بغسل الصبغة الزائدة من الوسط ، وتحديد مجموعات مرشحات الإثارة والانبعاث وأوقات التعرض لاستخدامها أثناء التجربة. ثم اضبط مجمع الكسور على التجميع على فترات دقيقة واحدة أثناء استخدام الثقوب بمحلول منخفض الجلوكوز. استخدم أداة منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار من برنامج تصوير PCI البسيط لتحديد المناطق أو الثقوب التي تريد تصويرها.

أيضا ، ضع دائرة حول منطقة الخلفية التي سيتم طرحها بعد غسل الخلايا لمدة 10 دقائق ، وابدأ مجمع كسر تدرج الجلوكوز وابدأ التصوير بفاصل زمني. بعد 30 دقيقة ، قم بإيقاف تشغيل البرنامج ومضخة الحقنة عالية الجلوكوز. استمر في الترشيح بانخفاض الجلوكوز لغسل تأثير ارتفاع الجلوكوز.

بعد 10 دقائق ، أوقف تدفق الجلوكوز المنخفض عن طريق إيقاف تشغيل مضخة المحقنة. بعد التروية ، قم بتصدير البيانات إلى Excel لتحليلها. يمكن تحديد كمية الأنسولين التي تفرز في الثماني من البرفو بواسطة ثقوب الفأر ELA.

تم إدماجها بتدرج خطي من اثنين إلى 25 مللي مولار من الجلوكوز كما هو موضح هنا. يتم تشغيل تدفق الكالسيوم وإفراز الأنسولين بعد حوالي 13 دقيقة من التروية المقابلة لستة مللي مولار. الجلوكوز. تظهر التغيرات في إمكانات الميتوكوندريا في وقت مبكر ، كما هو متوقع في حوالي 11 دقيقة.

توضح هذه البيانات ميزة استخدام هذه الشبكة الموائع الدقيقة لتوصيف فسيولوجيا العيون. لقد أوضحنا لك للتو كيفية استخدام جهاز دمج الموائع الدقيقة لدراسة فسيولوجيا العيون. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من عدم وجود فقاعات في الجهاز ، حيث قد يتسبب ذلك في تحرك الثقوب أثناء التجربة.

أيضا ، يمكن تعديل الفوري حتى مل واحد في الدقيقة دون إزعاج الثقوب. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.